Name: colletotrichum fioriniae development in water and chloroform-based blueberry and cranberry floral extracts
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts at JoVE.com

Wir danken William S. Haines, Sr. ausgestattet Cranberry-Forschungsfonds und New Jersey Heidelbeere und Cranberry Research Council, Inc. für Unterstützung. Wir danken auch Jennifer Vaiciunas (Anleitung und floralen Zubereitungen), Christine Constantelos (pilzartige Kultur und floralen Zubereitungen), David Jones (floral Vorbereitungen und Extraktionen), Langley Oudemans (floral Vorbereitungen, Dreharbeiten/Fotografie), Jesse Lynch (floral Präparate), Roxanne Tumnalis (allgemeine Unterstützung) und zahlreiche Schüler/Ferialpraktikanten.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Erkennung der C. Fioriniae auf florale Extrakte (FEs) Bioassays wurden entwickelt für die Heidelbeere und Cranberry Frucht Rot Pathosystems aber an anderen Gartenbaukulturen leicht angepasst werden können. Das oben beschriebene Protokoll wurde erwerben viele wichtige Datensätze, darunter wertvolle, aber nicht beschränkt auf: FE Auswirkungen auf mehrere Isolate von zahlreichen Krankheitserregern, Zeitverlauf Informationen zu Pilzwachstum Stadien in Anwesenheit von verschiedenen FEs Vergleich der Extraktionstechniken, Überprüfung der einzelnen Chemikalien auf C. Fioriniae Wachstum und Differenzierung, Bewertung der einzelnen Blume Orgel extrahiert, Auswirkungen der Temperatur auf C. Fioriniae während in Gegenwart von FE, Effekte Phänologie abhängigen Wachs Extraktionen und floralen Regenwasser Effekte. Durch den Einsatz dieser Techniken hat Daten generiert auch ein viel klareres Verständnis von C. Fioriniae Leben inszeniert und teilweise erläutert, warum die Blütezeit so entscheidend für die Kontrolle über viele Früchte faulen Krankheitserreger ist.
Zunächst alle Blumen auf die aktiveidentisch verarbeitet wurden-FE, aber die Extraktion in Richtung unter Verwendung der ganze Blumen verschoben hat. Floral Dissektion war zeitaufwendig und hatte wenig Einfluss auf die Bioaktivität der daraus resultierenden FEs. Können jedoch einzelne Blütenorganen und haben wurde bewertet mit dieses Protokoll, aber großer Sorgfalt getroffen werden, um nicht vollständig die floralen Geweben (Supplemental Film 1, bei Vorsichtsmaßnahmen detailliert Schritt 2.3), Mazerat als dies unter Umständen freigegeben Pilze giftig/statische Verbindungen in der FE, die die mikroskopischen Bewertungen verfälschen könnte. Weniger invasive Extraktionen wie Pass -sind FE (Supplemental Movie 2) und Rw-FE jetzt günstiger wegen ihrer Leichtigkeit des Erwerbs. Darüber hinaus benötigen diese Extraktionstechniken nur Vakuumfiltration, biologisch aktiven floral chemische Signale zu erwerben.
Die Blumen in allen Extraktionen verwendet wurden in der Regel gekühlt für 0-3 Tage vor dem Auszug-Vorbereitung. Eine Herausforderung dieses Protokolls ist Zeitmanagement FE Umsatzes (Feldsammlung durch Speicherung von Auszügen). Dies wurde durch zahlreiche Proben aus unterschiedlichen Quellen und Termine verschärft. Gefrorene Blumen wurden nicht in echte Ausmaß, evaluiert, wie aufgetaute Blumen verschlechterten und verfärbt erscheinen. Jedoch sobald die wässrige FEs hergestellt worden sein, wiederholt Einfrieren und Auftauen, hat keine Wirkung gezeigt, auf die Bioaktivität der FE, so lange wie die FE sind schnell gefroren nach Bioassay Vorbereitung (tragfähige 3-jährige FE).
Chloroform-basierte Extraktion ermöglicht die Untersuchung der Erreger Antworten auf dreidimensionale Blumen/Früchte Oberfläche Wachse in einer zweidimensionalen Ebene über ch-FE Verdunstung am Glasdeckgläser. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die tatsächliche Kristallstrukturen Wachse abgeschieden von der ch-FE identisch mit der Oberfläche sind aus denen sie erhoben wurden. Bedeutung, ergänzende Techniken sollten umgesetzt werden, wenn Pilz Reaktion auf spezifische Wachs Strukturen in Vivo der Schwerpunkt der Untersuchung sind. Chloroform-basierte Extrakte benötigen mehr Speicher Pflege als wässrige Extraktionen. Bewahrt, nicht nur die ch-FE Extrakte in der Dunkelheit die PTFE ausgekleidet Zellkultur tube Kappen und Parafilm Abdichtung wickeln müssen regelmäßig evaporative Dichtheit überprüft werden und bei Bedarf ersetzt.
Das Konzept der Überwachung floral Regenwasser wurzelt in der Idee der fortschreitenden ortsspezifische Krankheit Überwachungstools. Die Regenwasser-Sammlung-Geräte können auf viele andere Pflanze-Architekturen angepasst werden, so lange, wie der Sammelvorrichtung Regenwasser erfasst, die von Blumen ausgeführt hat. Dieser Ansatz bietet Informationen über ob florale Stimulation ist vor Ort zu einem bestimmten Zeitpunkt und in der gesamten Saison überwacht werden kann. Alternativ können Sammlung Geräte eingesetzt werden, an mehreren Standorten der Baldachin um festzustellen, wie weit floral Hinweise bei einem bestimmten Benetzung-Event gewaschen worden sind. In Zukunft werden Experimente, Rw-FE diktieren, wenn Fungizidanwendungen beginnen soll und wann sie sicher beenden können. Darüber hinaus ist durch die Überwachung der Phänologie abhängigen Wachs Extraktionen (Protokoll Abschnitt 9), wie wichtig es ist, dass die Blütezeit zur Biologie des Erregers noch deutlicher geworden. Dieser Abschnitt wurde auch aufgenommen, um demonstrieren die Flexibilität dieser Bioassays, Bereitstellung von Methoden, mit denen für Side-by-Side-Vergleich der Host Oberfläche Wachse, die zeitlich getrennt sind. Die Daten generiert mit floralen Extraktionstechniken und Bioassays stellen konkrete Indikatoren der Erreger Stimulation, spezifischen chemischen Klassen wichtig, Erreger Biologie und Ziele für die künftige Bekämpfungsstrategien.

Colletotrichum Fioriniae verursacht eine Fruchtfäule Schneeball Heidelbeere (Vaccinium Corymbosum L.) und der großen amerikanischen Cranberry (V. Macrocarpon Aiton)1,2. Dieser Erreger wurde vor kurzem von der C. Acutatum Arten komplexe3,4,5,6 abgegrenzt und ist eine kausale Heidelbeere Anthraknose-Agent und Mitglied der Cranberry Frucht rot Komplex, neben zahlreichen anderen Pflanzen Krankheiten weltweit7verursacht. C. Fioriniae hat eine latente, Hemibiotrophic Lebensstil8, mit Infektionen, die während der Blüte und Symptom Entwicklung nicht sichtbar, bis die Frucht in der Endphase der Reifung9sind. Fruchtfäule wird in Heidelbeeren und Preiselbeeren nur ausreichend mit Fungizidanwendungen, die während der Blütezeit gesteuert. Der Erreger überwintert in ruhenden Heidelbeere floral Knospe Skalen10 und sporulates während der Blüte. Konidien werden in den Baumkronen über regen-Splash Zerstreuung11,12 und Inokulum Aufbau wurde stark an die Blüte Periode13korreliert. Antwort von Colletotrichum Arten auf Host Blumen gilt nicht nur für Vaccinium, wie Blumen wichtige Komponenten der Zitrusfrüchte Post Blüte Frucht sind (PFD)14 sowie Erdbeer Anthraknose15, in beiden Fällen verursacht ablegen der Erreger, sporulate. Allen diesen Fällen unterstreichen die Notwendigkeit für effektive Methoden zur Beurteilung der zeitlichen Dynamik des floralen chemische Signale auf C. Fioriniae und andere Krankheitserreger, die während der Blüte zu infizieren. Die Einsichten, die durch die hier beschriebenen Methoden werden immer wertvoller.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden der floralen Extrakt (FE) Beschaffung und führt die Auswertung der C. Fioriniae Reaktionen auf FE über Glas Deckglas Bioassays15,16. Die floralen Extraktionstechniken werden in zwei Haupttypen unterteilt; wässrige Extraktionen (aktiv-FE, passive (Pass -FE) und Feld Regenwasser-basierte (Rw-FE)), und Chloroform-basierte (ch-FE)17 Extraktionen. Die wässrige Extraktionen ermöglichen für die Inspektion von Wasser mobilisiert floral chemische Signale. Diese mobilisiert Cues sind wahrscheinlich wichtige Bestandteile des Gerichts Infektion, da FE die Geschwindigkeit der Infektion16 erhöht, neben der Bereitstellung der Feuchtigkeit erforderlich für die Infektion auftreten. Darüber hinaus stellen sie einen natürlicheren Zustand als floral Stimulation in den Baumkronen bei Benetzung-Veranstaltungen wie zuvor in Heidelbeeren und andere Ernte Systeme14,16gewaschen werden kann. Chloroform-basierte florale Extraktionen (ch-FE) bieten auch wertvolle Informationen zu Erreger Reaktion auf Host Oberfläche17,18, Aufklärung der frühen Entwicklungsstadien der Konidien auf anfälligen einmal hinterlegt Wachse Host-Organe (z. B. Blumen, Eierstöcke und entwickelnden Frucht). Erreger als Reaktion auf saisonale Veränderungen in Host Oberfläche Wachse kann auch mit diesem Protokoll überwacht werden. Dementsprechend sind die Bioassays zugeschnitten auf die Zusammenarbeit mit wasserbasierten FE oder Chloroform-basierte FE um die angeborene Unterschiede zwischen diesen beiden Materialien zu mildern.
Von den Bioassays generierten Daten ergab, dass wässrige Extraktionen höhere Niveaus von sekundären Conidiation als Chloroform-basierte Extraktionen stimulieren gab es eine definitive Appressorial Antwort, daher Verwicklung mehrere Verbindungen in der FE vorhanden. Interessanterweise waren beide dieser Wachstum Antworten beobachtet, wenn die Nutzung von Regenwasser, die von Heidelbeere und Cranberry Blumen, zeigt mehrere stimulierende Verbindungen ausgeführt hatte von der Oberfläche der Blumen gewaschen werden können. So wird die Überwachung für florale Stimulation Einblick in die Erfolgswahrscheinlichkeit Erreger in ein landwirtschaftliches System bieten.
Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine Methode zur Erzeugung von biologischen Basisinformationen auf Pilz Pflanzenpathogene als Reaktion auf florale chemische Signale sowie initiierende Methoden, die diese floralen Informationen zur Unterstützung nutzen können standortspezifische Krankheitsprozesse Leitungs- und Entscheidungsstrukturen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="3" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">0.22 &#181;m pore size, acetate sterilizing filter</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">101102-280</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry floral extract (FE) clarification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">200-1000 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">40-200 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">5-40 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Harbor Freight</td>
			<td style="width:203px;">97098</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry rainwater (rw-)FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Autoclave</td>
			<td style="width:203px;">Amsco</td>
			<td style="width:203px;">3011</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Bar mesh matting (plastic mesh sheet)</td>
			<td style="width:203px;">Winco</td>
			<td style="width:203px;">BL-240</td>
			<td style="width:203px;">Passive (pass)-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Benchtop timer</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">06-662-47</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Black pressure/vacuum hose</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">62994-795</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:324px;">Buchner funnel</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60240</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Bunsen burner&#160;&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Calcium carbonate</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">C64-500</td>
			<td style="width:203px;">Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:203px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">05-527-90</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">10025-694</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Cheesecloth (grade 50)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">AS240</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:324px;">Chloroform</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">JT9175-3</td>
			<td style="width:203px;">Chemical, trichloromethane: assay grade, &#8805; 99% pure, for molecular biology, peroxide-free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Corn Meal Agar (CMA)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">B11132</td>
			<td style="width:203px;">&#160;Pre-mix media, isolate storage on slants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Cotton-blue stain</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">61335</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Curved forceps (45&#730;)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">10-270</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, flower processing and coverslip inversion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Difco Agar</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">90004-032</td>
			<td style="width:203px;">Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Drill-press</td>
			<td style="width:203px;">Delta</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">EASYpure LF Ultrapure water</td>
			<td style="width:203px;">Barnstead</td>
			<td style="width:203px;">D738</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, deionized water source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Ethanol (95%)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Filter flask (500 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Pyrex</td>
			<td style="width:203px;">No. 5340</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Freezer (set to -20&#730; C)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Fume hood</td>
			<td style="width:203px;">Hamilton</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, chloroform usage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Funnel (7 X 7 cm)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">60820-110</td>
			<td style="width:203px;">Cranberry rw-FE collection, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Generic glass slide&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">22-038-101</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Generic plastic pump spray bottle</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">16126-454</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection, at least 250 ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass cell culture tubes</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">12-542B</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass-pipette (1-100 &#181;l)</td>
			<td style="width:203px;">Hamilton Co. Inc.</td>
			<td style="width:203px;">#710</td>
			<td style="width:203px;">ch-FE bioassay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Glycerol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">G5516</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:203px;">Bright-Line</td>
			<td style="width:203px;">5971R10</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Incubator (set to 25&#730; C, dark)</td>
			<td style="width:203px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:203px;">50036</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Lactic acid</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">W261106</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:203px;">Labconco</td>
			<td style="width:203px;">3730400</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, sterile work environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Metal probe (generic)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">05-408-138</td>
			<td style="width:203px;">Aqueous treatment mixture storage and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Microscope, Leica DMLB</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;">020-519.010</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Mortar (ceramic)</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60313</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Nitrile gloves&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">19-130-1597D</td>
			<td style="width:203px;">Flower collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Paper disks (cut paper towels)</td>
			<td style="width:203px;">Office Basics</td>
			<td style="width:203px;">KCC01510</td>
			<td style="width:203px;">humidity control in bioassay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Bemis</td>
			<td style="width:203px;">PM-996</td>
			<td style="width:203px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pestle (ceramic)</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60314</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Phenol crystals</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">A92-100</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Plastic bags (~100 mm X 152 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Uline</td>
			<td style="width:203px;">S1294</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, flower refrigeration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">FB0875712</td>
			<td style="width:203px;">(Petri dish), bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">60927-228</td>
			<td style="width:203px;">Storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex beakers (100 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Pyrex</td>
			<td style="width:203px;">No. 1000</td>
			<td style="width:203px;">Preparation of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex bread-pan</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex graduated cylinder</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Refrigerator (set to 4&#730; C)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Sharp-pointed dissecting scissors</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">8940</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Stainless steel mesh strainer</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">470149-756</td>
			<td style="width:203px;">Preparation of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Step drill bit (step-bit)</td>
			<td style="width:203px;">Dewalt</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Sterile loop (combi-loop)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">22-363-602&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Culture preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Telephone wire (internal wires)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:324px;">Test tube basket&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">470137-792</td>
			<td style="width:203px;">Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">V8 Juice</td>
			<td style="width:203px;">Campbell&#39;s Soup Company</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Fungal media component</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:324px;">Vintage plastic mesh [strawberry] baskets</td>
			<td style="width:203px;">Donation</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:324px;">Vortex Genie (Vortex)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">12-812</td>
			<td style="width:203px;">Spore suspension preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:324px;">Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles</td>
			<td style="width:203px;">Whatman</td>
			<td style="width:203px;">1001-055</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">White plastic twist ties (100 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Uline</td>
			<td style="width:203px;">S-566W</td>
			<td style="width:203px;">Cranberry rw-FE collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colletotrichum fioriniae development in water and chloroform-based blueberry and cranberry floral extracts

Um die Phänologie der Blütezeit und die zeitliche Dynamik der floralen chemische Hinweise auf Pilz Obst verfault Krankheitserreger genau zu überwachen, wurden florale Extraktionsmethoden und Deckglas Bioassays entwickelt unter Verwendung Colletotrichum Fioriniae. In Heidelbeeren und Preiselbeeren ist dieser Erreger optimal gesteuert, durch die Anwendung von Fungiziden während der Blütezeit wegen Blumen Rollenspiel in den ersten Stadien der Infektion. Das Protokoll hier detailliert beschreibt, wie florale Extrakte (FE) mit Wasser, Chloroform und Regenwasser-basierte Feldmethoden zur späteren Verwendung in entsprechenden Glas Deckglas Bioassays stammen. Jede FE serviert, einen anderen Satz von Informationen bereitzustellen: Antwort von C. Fioriniae mobilisiert floral chemischen Queues in Wasser (wasserbasiert), Erreger Reaktion auf Blüte und Frucht Oberfläche Wachse (Chloroform-basiert) und Feld-basierte Überwachung der floral Regenwasser, Umzug in-vitro- Beobachtungen in einer landwirtschaftlichen Umgebung gesammelt. Die FE ist allgemein als entweder Wasser oder Chloroform-basierte, mit einer entsprechenden Bioassay beschrieben als Ausgleich für die angeborene Unterschiede zwischen diesen beiden Materialien beschrieben. Regenwasser, das aus Blumen gelaufen wurde in einzigartige Geräte für jede Ernte in Anspielung auf die Flexibilität und die Anwendung dieses Ansatzes für andere Anbausysteme. Die Bioassays sind schnell, kostengünstig, einfach und bieten die Möglichkeit, räumlich-zeitliche und ortsspezifische Informationen über das Vorhandensein der stimulierende floral Verbindungen aus verschiedenen Quellen zu erzeugen. Diese Informationen letztendlich informieren besser Disease-Management-Strategien, wie FE verringern den Zeitaufwand für Infektion auftreten, so Einblicke in veränderten Risiken für Erreger Infektion über die Vegetationsperiode.

Die hier vorgestellten Ergebnisse sind ein paar Beispiele für die vielen Tests, die mit dieser Methodik durchgeführt werden können. Abbildung 1 ist ein illustrierter Führer zu den wasserbasierten FE Bioassay und wird ergänzt durch Abbildung 2 die zu Chloroform-basierte FE Bioassay folgt. Abbildung 3 bietet eine visuelle Anleitung, was auf mikroskopische Beurteilung des C. Fioriniae 24 h, in beiden Wasser und Chloroform-basierte Bioassays (gegenüber SDW-Kontrollen) erwartet werden können. Abbildung 4 beschreibt eine 24 h-Zeitverlauf-Studie mit C. Fioriniae in Anwesenheit der Cranberry Sorte "Stevens" ch-FE und bietet visuelle Referenz zu einem Import-Ergebnis dieser Forschung: FE verringert den Zeitaufwand zu Infektion Strukturen im Vergleich zum SDW. Abbildung 5 ist ein Beispiel für Daten, die aus einem Deckglas Bioassay mit Cranberry floral Regenwasser Abfluss (CB "Flower" Rw-FE). Abbildung 6 stellt ein weiteres wichtiges Ergebnis: floral Eierstock ch-FE war viel mehr stimulierende als Obst ch-FE, was die Bedeutung von Bloom im Lebenszyklus des C. Fioriniae. Zusätzliche Fotos und Filme bieten wichtige Visuals von die Blumen verwendet in den Extraktionen und floralen Regenwasser Sammlung Geräte/Bereitstellung, zusätzlich zu Filmen, die das aktive und passive - Extraktion (visualisieren Wasserbasis) Prozesse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Abbildung 1 : Allgemeine Übersicht über die wasserbasierten floral extrahieren (FE) Bioassay. Dieser Assay für wasserbasierte floral Extrakte mit Heidelbeere und Cranberry Blumen genutzt wurde: aktiv -floral Auszüge (aktiv-FE), passiv -floral Auszüge (pass-FE) und floralen Regenwasser Abfluss (Rw-FE). -FE Teil bildet in der Regel den experimentellen/Variable Faktor. Umgekehrt - FE Teil kann konstant bleiben und Zeit Punkte/Stunden Post-Impfung kann ausgewertet werden. Präferenz hat 4 Feld-Analyse bei 200 X Vergrößerung erzielt. Abkürzungen: Sterile deionisiertes Wasser, SDW; Fläche pro Gesichtsfeld, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Abbildung 2 : Allgemeine Übersicht über die Chloroform-basierte floral extrahieren (ch-FE) Bioassay. Dieser Test wurde für Heidelbeeren und Preiselbeeren (Eierstöcke, Blumen und Früchte) verwendet. Nur eine Art von wässrigen Behandlungsansatzes diente in diesem Assay, 1 Teil Spore-Aufhängung, 2 Teile SDW (zu conidial Konzentration durch ch-FE Verdunstung konsistent zu halten). Dieser Test kann verwendet werden, um mehrere ch-FE (Wachse aus verschiedenen pflanzlicher Oberflächen) oder mehrere Zeit Punkte/Stunden nach Impfung mit einem einzigen ch-FE zu vergleichen. Abkürzungen: Sterile deionisiertes Wasser, SDW; Van Tieghem [Glas] Zellen, VanT. Zelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Abbildung 3 : Visueller Vergleich der Colletotrichum Fioriniae in Gegenwart von Wasser-basierte FE und ch-FE. In diesem Assay-Heidelbeere 'Bluecrop' (aktiv-FE, wässrige) (Pilz Isolat: BB #10) und Cranberry "Stevens" Chloroform-basierte (ch-FE) (Pilz Isolat: CB-PMAP182) floral Extrakte SDW Kontrollen verglichen wurden. Eine dramatische Zunahme der sekundären Conidiation (Ringe) und Appressorium Bildung (Pfeilspitzen) wurden beobachtet, beim Vergleich von Konidien in Anwesenheit von SDW (Steuerung) (A) auf aktiv-FE (B) bei 24 h nach Impfung. Sekundäre Conidiation war jedoch nicht so offensichtlich, vergleicht man das Chloroform Bioassay SDW-Steuerelement (C) ch-FE (D); C. Fioriniae Wachstum verlagert vielmehr Appressorial Bildung. Gezeigt wird eine gemeinsame Antwort auf jede Extraktion Art, wässrige und Chloroform-basierte, unabhängig von der Host/Blumenarten beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Abbildung 4 : Zeitverlauf Studie (24 h) mit Colletotrichum Fioriniae in Anwesenheit von ch-FE. In diesem Test wurden ein SDW Kontrolle (A-D) und Cranberry "Stevens" ch-FE (E-F) auf 0, 6, 12 und 24 h nach Impfung (ein Beispiel von Variablen Zeitpunkten anstatt zu vergleichen mehrere FE) Sichtprüfung. Appressorium Formation (Pfeilspitzen) begann um 6 Uhr in der ch-FE und stetig in der gesamten nachfolgenden Zeitpunkte. Diese Ergebnisse entzieht sich als wichtiger Faktor der Erreger Biologie während der Blütezeit: Blumen reduzieren den Zeitaufwand Infektion um Strukturen zu bilden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Abbildung 5 : Grafische Darstellung der Daten mit Rw-FE in einem Bioassay. Regenwasser laufen weg von Cranberry Blumen (CB "Flower" Rw-FE) und Jungfrau Regenwasser, das nicht, jede Cranberry Pflanzengewebe ("Ground" Rw-FE) aus einem Einzelereignis Benetzung plus ein standard aktiv, Cranberry wasserbasierte floral-Extrakt (CB aktiv berührt hatte -FE) (Positivkontrolle) und SDW (Negativkontrolle) waren eine wässrige Deckglas Bioassay unterzogen und bewertet für C. Fioriniae Wachstum. CB "Blume" Rw-FE hatte das gleiche Maß an sekundäre Conidiation und Appressorium Bildung als die standard CB aktiv-FE in 24 h nach Impfung, darauf hinweist, dass die Sammlung Geräte effektiv bei der Erfassung von floraler Stimulanzien während freigegeben waren ein Benetzung-Event. Insgesamt Konidien besteht aus primären (hinterlegt), Konidien und neu gebildete sekundäre Konidien. Buchstaben geben an, dass signifikante Unterschiede bei p < 0,05 nach Fischers wenigsten signifikanten Unterschied testen (LSD); Großbuchstaben, total Konidien; Kleinbuchstaben, Appressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Abbildung 6 : Cranberry Phänologie basierte ch-FE Bioassay, Sichtprüfung. Disease-Management für Obst Pilze oft Fäulnis beinhaltet Fungizidanwendungen Blüte Zeit. Hier wurden Cranberry Chloroform-basierten-Extrakte (ch-FE) aus mehreren Entwicklungsstadien von Cranberry ("Stevens") für die Wirkung der Oberfläche Wachse auf C. Fioriniae in 24 h nach Impfung visuell bewertet. Eierstöcke gesammelt im Juni (A), unreife Früchte gesammelt im Juli und August (B, C), geernteten Früchte gesammelt im Oktober (D), und ein SDW-Steuerelement (E) für Appressorial Bildung (Pfeilspitzen) geprüft wurden. Eierstock ch-FE hatte die größte Stärke der Appressorial Formation, darauf hinweist, dass diese Pflanze Phänologie (Bloom) von entscheidender Bedeutung für den Lebenszyklus von C. Fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Ergänzende Abbildung1: Blueberry Blütenstand. Heidelbeere Blumen sammelten für Extraktionen in voller Blüte (April-Mai in New Jersey, USA) (siehe 'Bluecrop'). Beachten Sie die Überlappung der Blumenkronen/Eierstöcke aus angrenzenden Blumen und die Gesamtarchitektur des Blütenstandes im Vergleich zu ergänzenden Abbildung2 (Cranberry aufrecht). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Ergänzende Abbildung2: Cranberry aufrecht. Cranberry Blumen wurden für Extraktionen in voller Blüte (Juni-Juli in New Jersey, USA) (siehe "Stevens") gesammelt. Beachten Sie die abwechslungsreiche Blume Stufen auf einen einzigen Cranberry Blütenstand (aufrecht) und die Haken, Wassertropfen, die Beibehaltung der Form des Corolla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Ergänzende Abbildung 3: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Blume). Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung, platziert direkt unter einem Cluster der Blütenstände abgeschlossen. Beachten Sie die kunststoffummantelten Draht verwendet, um das Gerät vertikal auszurichten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Ergänzende Abbildung 4: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Stem). Abgeschlossene Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung, halbem Weg nach unten den Stamm zwischen Blütenstands und die Krone des Busches platziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Ergänzende Abbildung 5: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Krone). Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung, platziert an der Basis des Busches (Krone) abgeschlossen. Hinweis Kunststoff beschichtete Drähte können ggf. nicht entfernt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Ergänzende Abbildung 6: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Boden). Natives Regenwasser Sammelvorrichtung, platziert neben Heidelbeere Büsche abgeschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Ergänzende Abbildung 7: Cranberry Regenwasser Bereitstellung (Nahaufnahme). Cranberry floral Regenwasser Sammelvorrichtung, mit zwei Ständern, die versteckt unter der ordentlich gekreuzten Kabelbinder abgeschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Ergänzende Abbildung 8: Cranberry Regenwasser Bereitstellung. Multiple abgeschlossen Cranberry floral Regenwasser Geräte in einem Moor eingesetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Ergänzende Film 1: aktive, auf Wasser basierende floral Extrakte (aktiv -FE). Zusätzliche video-Unterstützung folgende Schritte 2,3-2.5.1. Heidelbeere 'Bluecrop' Blumen wurden verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Ergänzende Movie 2: Passive, wasserbasierte floral Extrakte (pass-FE). Zusätzliche video-Unterstützung folgende Schritte 3.3 3.4. Heidelbeere 'Bluecrop' Blumen wurden verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Ergänzende Movie 3: Bereitstellung von Cranberry floral Regenwasser Sammlung Geräten. Zusätzliche video-Unterstützung nach Schritt 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>

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Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Hier werden Bioassays zur Überwachung der Entwicklung der pilzliche Erreger, Colletotrichum Fioriniae, im Beisein von Heidelbeeren oder Preiselbeeren floral Auszüge auf Glasdeckgläser beschrieben. Wasser, Chloroform und Feld Regenwasser - basierte floral Extraktion, die Techniken detailliert sind, sowie Einblick, wie diese Information angewendet werden kann.

Colletotrichum fioriniae Entwicklung in Wasser und Chloroform-basierte Heidelbeere und Cranberry Floral Extrakte

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Dieses Protokoll bietet ein kostengünstiges und anpassungsfähiges System zur Bewertung der zeitlichen Dynamik fluorochemischer Hinweise auf Colletotrichum fiorniae und andere Pflanzenpathogene, die den Begriff Blüte infizieren. Neuartige Bodenregenwassersammelgeräte ermöglichen es dem Benutzer, natürliche Stimulanzien und Bedingungen, die die Pathogenentwicklung beeinflussen, nahezu standortspezifisch in Echtzeit zu überwachen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer Kultur von Colletotrichum fiorniae von einem natürlich infizierten Host, wie im Textprotokoll beschrieben.Wenn Kolonien zu sporulaten beginnen, streifen Conidia auf einen anderen V 8 Saft-Agar, der eine Zellkulturschale enthält, um eine sporulierende Kultur mit hoher Dichte zu erzeugen. Verwenden Sie nach sieben Tagen Wachstum eine Standard-Sterilschleife, um eine kleine Menge Conidia aus der Kultur mit hoher Dichte zu sammeln, indem Sie die Schleife leicht zur Konidialmasse berühren. Rühren Sie dies in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit 10 Milliliter sterilem entionisiertem Wasser.Wirbel dieses Beispiel für 10 Sekunden. Mit einer Standardpipette mehrmals nach oben und unten tauchen, um die Probe weiter zu mischen. Legen Sie dann einen Tropfen der wirbelnden Probe auf das Hämozytometer und schätzen Sie die Sporenkonzentrationen.Stellen Sie die Konzentration auf 0,1 Millionen Conidia pro Milliliter sterilen destillierten Wassers mit einem Endvolumen von fünf Millilitern ein. Dies wird als Sporensuspension bezeichnet und wird erst unmittelbar vor der Verwendung in beiden Bioassays hergestellt. Um die chloroformbasierte Floral-Extraktion durchzuführen, reinigen Sie alle Komponenten zweimal mit 95% Ethanol.Reinigen Sie die Komponenten dann zweimal mit Chloroform, um eine Kontamination für jede Extraktion zu verhindern. Reinigen Sie die PTFE-gefütterten Kappen nicht mit Chloroform, da sie dadurch beschädigt werden. Nach der Reinigung die Komponenten beiseite stellen, um auf den Kopf zu trocknen.Kombinieren Sie ein Teil verarbeitete Blüten zu neun Teilen Chloroform in einem Becher durch Zugabe von Blumen und dann Chloroform. 30 Sekunden lang sanft wirbeln und durch einen Edelstahlschirm in den zweiten Becher abseihen. Gießen Sie den Chloroform-basierten Extrakt aus dem zweiten Becher in das Glaskulturrohr und befestigen Sie die PTFE-Kappe.Wickeln Sie die Kappe mit Parafilm, um Verdunstung zu verhindern. Bewahren Sie den resultierenden Chloroform-basierten Blumenextrakt in der Dunkelheit auf, um den Lichtabbau bei vier Grad Celsius bis zum experimentellen Gebrauch zu reduzieren. Wiederholen Sie Extraktionen mit mehreren Samples, um Replikationen bereitzustellen.Um ein Sammelgerät für jede ausgewählte Position zu erstellen, verwenden Sie ein Schrittbit, das an eine Bohrmaschine angeschlossen ist, um ein Loch an der Unterseite eines Sprühbechers zu bohren. Dann schneiden Sie eine gerade Linie von der Oberseite des Lochs bis zum Mund der Sprühbecher. Bohren Sie nun vier äquidistante Löcher, die groß genug sind, um den kunststoffbeschichteten Draht an den Mund des Sprühbechers zu fädeln.Befestigen Sie ein Ende der kunststoffbeschichteten Drähte, so dass ein Ende frei bleibt. Bohren Sie ein Loch, das groß genug ist, um das Farbspray oder den Becheradapter in einen 50-Milliliter-Zentrifugendeckel zu fädeln. Versiegeln Sie die Adaptergewinde mit Parafilm, um Leckagen zu vermeiden.Befestigen Sie diese sowohl an der Zentrifugenkappe als auch an dem Gewindeteil des Sprühbechers. Dann das verklebende 50-Millimeter-Zentrifugenrohr befestigen. Erstellen Sie vier Sammelgeräte pro Sampling-Speicherort.Stellen Sie Geräte an ausgewählten Standorten bereit, indem Sie Sprühbecher so flexen, dass sie auf Stiele passen. Richten Sie die geschnittene Seite des Sprühbechers nach oben mit den kunststoffbeschichteten Drähten aus, die an anderen Stielen befestigt sind. Dadurch wird sichergestellt, dass Wasser, das über die Blumen geht, eingefangen wird.Um Regenwasser aus Preiselbeerblüten zu sammeln, durchbohren Sie zunächst acht äquidistante Löcher um den Mund des Trichters mit einer Metallsonde. Fügen Sie Twist-Krawatten in vier der Löcher ein. Befestigen Sie die anderen Enden an der gegenüberliegenden Position dieses Lochs und bilden Sie ein sauberes Kreuzungsmuster.Den Trichter mit Parafilm abwickeln und beiseite stellen. Bohren Sie ein Loch, das groß genug ist, um den Trichter nach unten in eine 50 Milliliter Zentrifugenkappe mit einem Schritt einzufügen. Setzen Sie den vorbereiteten Trichter in die Zentrifugenkappe ein.Entfernen und ersetzen Sie nach Regenfällen oder Überkopfbewässerung den unteren Rohrteil des Zentrifugenrohrs. Die Regenwassersammelrohre sollten nach Benetzungsereignissen schnell gewechselt werden, da sie anfällig für den Abbau durch natürliche Verunreinigungen sind, die im Abfluss mobilisiert werden, wie Bakterien und andere Pilze. Legen Sie zwei Schichten Papierscheiben in Kulturgerichte und tränken Sie mit zwei Milliliter sterilen destillierten Wasser.Als nächstes mischen Sie gleiche Mengen steriles destilliertes Wasser und blumenbasierten Extrakt auf Wasserbasis in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhren. Dann fügen Sie ein gleiches Volumen der Sporensuspension zu den vorbereiteten zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhren hinzu. Die resultierende Zubereitung wird als wässrige Behandlungsmischung bezeichnet.Für die Kontrolle, lassen Sie die florale Extrakt-Portion weg und ersetzen Sie mit sterilem destilliertem Wasser, um die Konidialkonzentrationen konsistent zu halten. Legen Sie nun vorgereinigte Glasabdeckungen auf die eingeweichten Papiertücher innerhalb der Zellkulturschale. Legen Sie ein 40-Mikroliter-Tröpfchen wässriger Behandlungsmischung auf die Mitte eines Deckellipss.Wiederholen Sie dies für die gewünschten Behandlungen einschließlich der Kontrolle. Schließen Sie dann das Zellkulturgericht. Sobald alle Behandlungen und Repliken abgegeben wurden, legen Sie alle nachgebildeten Zellkulturgerichte in einen versiegelten Plastikbehälter und bebrüten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln.Zu vorgegebenen Zeitpunkten 10 Mikroliter eines Fixativs zu den Tröpfchen hinzufügen, die das Wachstum stoppen und die Halterung halb erhalten. Sobald ein Fixativ hinzugefügt wurde, kehren Sie sorgfältig die Abdeckungen invertiert jede von ihnen Tröpfchen Seite nach unten auf einem Glasmikroskop-Dia, um mikroskopische Untersuchung zu erleichtern. Wenn sich alle Abdeckungen auf den Glasmikroskop-Dias befinden, lassen Sie sie 20 Minuten lang in der Durchflusshaube absetzen und teilweise trocknen.Zählen Sie alle Aufdeckungen auf dem Deckblatt vorhandenen Konidien einschließlich Primärkonidie, keimter Konidie n. Chr. und neu gebildeter Sekundärkonidie sowie Appressorien. Arbeiten Sie entweder mit der 400-fachen Vergrößerung oder mit einer Gesamtfläche von 3.808 Quadratmillimetern. In einer laminaren Durchflusshaube zwei gleiche Mengen sterilen destillierten Wassers und ein Volumen Sporensuspension zu einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzufügen.Legen Sie diese wässrige Behandlungsmischung für Chloroform-basierte Blumenextrakt-Bioassays beiseite. In einer Dunstabzugshaube legen Sie eine Van T Cell auf einen Glasdeckel in der vorbereiteten Kunststoffzellenkulturschale. Geben Sie 33 Mikroliter des gewünschten Chloroform-basierten Blumenextrakts in die Mitte der Zelle und lassen Sie sie trocknen.Berühren Sie nicht die Wände der Zelle. Für die Kontrollbehandlung, fügen Sie natives Chloroform. Sobald der auf Chloroform basierende Blumenextrakt getrocknet ist, geben Sie 99 Mikroliter der vorbereiteten wässrigen Behandlungsmischung mit einer Standardpipette in die Mitte der Van T Cell.Dann schließen Sie alle Zellkultur-Gerichte und brüten. Zu vorgegebenen Zeitpunkten 15 Mikroliter eines Fixativs in die Van T-Zelle geben und mindestens fünf Minuten sitzen lassen, um eine ausreichende Pilzfärbung zu gewährleisten. Entfernen Sie danach vorsichtig die Van T Cell.Führen Sie wie bisher Deckslip-Inversions- und Datenerfassungsschritte durch. Bei der mikroskopischen Auswertung von C.fiorniae bei 24 Stunden nach der Inokulation, Vergleich von Conidie in Gegenwart von sterilem destilliertem Wasser mit Wasser-basierte Blumenextrakt zeigt eine dramatische Zunahme der sekundären Konidiation und Appressoriumbildung. Die sekundäre Konidiation war jedoch nicht so offensichtlich, wenn man die chloroformbioassay sterile destillierte Wasserkontrolle mit Chloroform-basierten Extrakten vergleicht.Vielmehr verschob sich das C.fiorniae Wachstum in Richtung appressoriale Bildung. In diesem Test wurden eine sterilde destillierte Wasserkontrolle und Cranberry-Chloroform-basierte Blumenextraktionen visuell bei Null, sechs, 12 und 24 Stunden nach der Impfung inspiziert. Die Appressoriumbildung begann um sechs Stunden im Chloroform-basierten Blumenextrakt und nahm während der folgenden Zeitpunkte stetig zu.Dieses Ergebnis unterstützt die Feststellung, dass Blumen die Zeit reduzieren, die benötigt wird, um Infektionsstrukturen zu bilden. Das Krankheitsmanagement für Fruchtfäulende Pilze beinhaltet oft Blühenzeitfungizid-Anwendungen. Hier wurden Cranberry-Chloroform-basierte Extrakte aus mehreren Wachstumsstadien von Cranberry nach der Impfung nach der Impfung visuell auf die effektiven Oberflächenwachse auf C.fiorniae untersucht.Eierstöcke, die im Juni gesammelt wurden, unreife Früchte, die im Juli gesammelt wurden, und im August geerntete Früchte, die im Oktober gesammelt wurden, und eine sterile destillierte Wasserkontrolle wurden auf die Appressorialbildung untersucht. Ovary Chloroform-basierte Extrakte hatten die größte Größe der appressorialen Bildung, die die Bedeutung der Blüte im Lebenszyklus von C.fiorniae zeigt. Der Erreger ist der wichtigste Bestandteil dieses Protokolls.Pilze sollten routinemäßig in frische Medien gebracht werden, um die Konsistenz zwischen den Versuchen zu erhalten. Jede Arbeit mit Chloroform muss aus Sicherheitsgründen in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden. Dazu gehören die Herstellung von Materialien und Glaswaren, Extraktionsverfahren und die Leitfähigkeit des Chloroform-basierten Bioassays.Kombinationen von Zeitpunkten, Krankheitserregern, floralen Regenwassersammlungen oder Wirtsextraktionen können verwendet werden, um verschiedene Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu bewerten. Die Regenwassersammelgeräte und die dazugehörigen Bioassays werden es anderen ermöglichen, mit Hoststimulanzien zu arbeiten, die bei Regenereignissen in zahlreichen Pfadsystemen mobilisiert werden.

Research

JoVE Journal

Environment

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Forschung

Umwelt

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Charakterisierung und Anwendung von Passivsammler für die Überwachung von Pestiziden in Wasser

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Boden Lysimeter Ausgrabung Gekoppelte hydrologische, geochemische und mikrobiologische Untersuchungen

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Continuous Instream Monitoring of Nutrients and Sediment in Agricultural Watersheds

Kontinuierliche Instream Überwachung von Nährstoffen und Sediment in landwirtschaftlichen Wasserscheiden

Pollutant concentrations and loads in watersheds vary considerably with time and space. Accurate and timely information on the magnitude of pollutants in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Messung und Mapping-Muster von Erosion und Ablagerung im Zusammenhang mit Boden-Karbonat-Konzentrationen unter Landbewirtschaftung

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protokoll für akute und chronische Ökotoxizität Prüfung von Türkis Killifische Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Bau eines Low-Cost mobilen Inkubator für Feld und Labor

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...