このプロトコルは、用語ブルームに感染するコレトリクムフィオルニアおよび他の植物病原体のフッ素化学的手掛かりの時間的ダイナミクスを評価するための安価で適応可能なシステムを提供する。新しい床雨水収集装置は、ユーザーが自然な覚醒剤と病原体の発達に影響を与える条件をほぼリアルタイムのサイト固有の方法で監視することを可能にする。テキストプロトコルに記載されているように、自然に感染した宿主からのColletotrichum fiorniaeの培養からこの手順を開始します。
コロニーが胞状になり始めると、細胞培養皿を含む別のV 8ジュース寒天にコニディアの筋が高密度の胞子培養を生み出す。7日間の成長の後、標準的な滅菌ループを使用して、ループを軽く円錐質量に軽く触れることによって、高密度培養から少量のコニディアを収集する。これを10ミリリットルの無菌脱イオン水を含む15ミリリットルの遠心分離管にかき混ぜます。
このサンプルの渦は10秒間です。標準的なピペットを使用して、さらにサンプルを混合するために何度も上下に突っ込みます。次に、渦液サンプルをヘモサイトメーターに一滴置き、胞体濃度を推定します。
5ミリリットルの最終体積で無菌蒸留水のミリリットル当たり0.1百万コニディアに濃度を調整します。これは胞毛懸濁液と呼ばれ、どちらのバイオアッセイでも使用する直前に行われます。クロロホルムベースの花抽出を行うために、95%エタノールですべての成分を2回洗浄してください。
その後、各抽出のための汚染を防ぐためにクロロホルムで成分を2回洗浄します。PTFEの並んだキャップはクロロホルムで破損するので清掃しないでください。クリーニング後、コンポーネントを逆さまに乾燥させます。
1つの部分加工花をビーカーのクロロホルムの9つの部分に組み合わせて、花を加え、クロロホルムを加えます。30秒間静かに旋回し、ステンレス製のスクリーンを通して2番目のビーカーにひずみます。2番目のビーカーからクロロホルムベースのエキスをガラス培養チューブに注ぎ、PTFEキャップを貼り付けます。
キャップをパラフィルムで包み、蒸発を防ぎます。得られたクロロホルムベースの花エキスを暗闇の中に保管し、実験的使用まで摂氏4度で光の劣化を減らします。反復を提供するために、複数のサンプルで抽出を繰り返します。
選択した場所ごとに収集装置を作成するには、ドリルプレスに取り付けられたステップビットを使用して、スプレーカップの下部に穴を開けます。その後、穴の上からスプレーカップの口まで直線を切ります。今度はスプレーカップの口にプラスチックコーティングされたワイヤーを通すのに十分な大きさの4つの等遠い穴を開けます。
プラスチック製の塗装されたワイヤの一端を取り付け、一端を自由に残します。ペイントスプレーまたはカップアダプタを50ミリリットルの遠心分離キャップ蓋に通すのに十分な大きさの穴を開けます。漏れを防ぐために、アダプタースレッドをパラフィルムで密封します。
これを噴霧器カップの遠心キャップとねじ部分の両方に取り付けます。次に、合致した50ミリメートルの遠心管を取り付けます。サンプリング場所ごとに 4 つの収集デバイスを作成します。
ステムにフィットするように噴霧器のコップを曲げることによって選択された場所で装置を展開する。他の茎に取り付けられたプラスチック製の被覆線を使用して、スプレーカップのカット側を上向きにします。これは花の上を通過する水が捕獲されることを保障する。
クランベリーの花から雨水を集めるために、最初の熱は金属プローブを使用して漏斗の口の周りに8つの等距離の穴を穿刺します。4 つの穴にツイスト タイを挿入します。その穴の反対側の位置にもう一方の端を取り付けて、きちんとした交差パターンを形成します。
漏斗をパラフィルムで蒸気で包み、脇に置きます。漏斗の茎をステップビットで50ミリリットルの遠心分離機キャップに挿入するのに十分な大きさの穴をドリルダウンします。準備した漏斗を遠心分離キャップに挿入します。
降雨または頭上の灌漑の後、遠心分離管の底管部分を取り外して交換してください。雨水回収管は、細菌や他の真菌などの流出で動員された天然汚染物質による分解を起こしやすいので、湿潤イベントの後にすぐに交換する必要があります。培養皿の中に紙のディスクの2つの層を配置し、滅菌蒸留水の2ミリリットルで浸します。
次に、2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に無菌蒸留水と水ベースの花エキスの等しい量を混ぜます。次に、準備した2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に胞胞体懸濁液の等量を加える。得られた調製物を水性処理混合物と呼ぶ。
コントロールのために、花エキス部分を省略し、一貫性のある経度濃度を維持するために滅菌蒸留水に置き換えます。今、細胞培養皿内の浸したペーパータオルの上に事前に洗浄されたガラスのカバーリップを置きます。40マイクロリットルの水性処理混合物をカバースリップの中央に置きます。
コントロールを含む所望の治療のためにこれを繰り返します。次に、細胞培養皿を閉じます。すべての治療と複製が分配されたら、すべての複製された細胞培養皿を密閉されたプラスチック容器に入れ、暗闇の中で摂氏25度でインキュベートします。
事前に決定された時点で、液滴に固定液の10マイクロリットルを加え、成長を止め、マウントを半保存します。固定剤を加えたら、慎重にカバースリップをガラス顕微鏡スライド上の液滴側に置き、顕微鏡検査を容易にします。すべてのカバーリップがガラス顕微鏡スライド上にある場合は、フローフードで20分間落ち着き、部分的に乾燥させます。
一次コニディア、発芽したコニディア、新たに形成された二次コニディア、ならびにアプレッサリアを含むカバースリップに存在するすべてのコニディアを数える。400倍の倍率または200倍の面積3.808平方ミリメートルのいずれかで動作します。層流フードに、2ミリリットルマイクロ遠心チューブに2つの等量の無菌蒸留水と1ボリュームの胞毛懸濁液を加えます。
クロロホルムベースの花エキスバイオアッセイのために、この水性処理混合物を脇に置きます。ヒュームフードで、準備されたプラスチック細胞培養皿の中のガラスカバースリップにヴァンTセルを置きます。所望のクロロホルムベースの花エキスの33マイクロリットルを細胞の中央に分配し、乾燥させます。
セルの壁に触れないでください。コントロール治療のために、バージンクロロホルムを追加します。クロロホルムベースの花エキスが乾燥したら、調製した水処理混合物の99マイクロリットルを標準ピペットを含む99マイクロリットルをVan T Cellの中央に分配します。
その後、すべての細胞培養皿を閉じて、インキュベートします。事前に決定された時点で、Van T Cellに固定剤の15マイクロリットルを加え、適切な真菌染色を確実にするために少なくとも5分間座らせます。その後、慎重にヴァンTセルを取り外します。
以前と同様に、カバースリップ反転とデータ取得手順を実行します。接種後24時間でC.fiorniaeを顕微鏡で評価すると、滅菌蒸留水と水系花エキスの存在下でのコニディアの比較は、二次連結およびアププレソリウム形成の劇的な増加を明らかにする。しかし、二次結数は、クロロホルム系抽出物と滅菌蒸留水の制御を比較する際に、それほど明白ではなかった。
むしろ、C.フィオルニアの成長はアポペリック形成にシフトした。このアッセイでは、無菌蒸留水のコントロールとクランベリークロロホルムベースの花抽出を、接種後0時間、6時間、12時間、24時間で視覚的に検査した。アプレソリウムの形成は、クロロホルムベースの花エキスで6時間で始まり、その後のタイムポイントを通じて着実に増加した。
この結果は、花が感染構造を形成するために必要な時間を短縮するという発見を支持する。果実腐敗菌の疾患管理は、多くの場合、ブルームタイム殺菌剤の適用を伴う。ここで、クランベリーの複数増殖段階からのクランベリークロロホルムベースの抽出物は、接種後24時間でC.fiorniae上の有効表面ワックスについて目視評価した。
6月に採取した卵巣、7月に採取した未熟果実、8月には10月に採取した果実を収穫し、無菌蒸留水のコントロールを経て、無菌蒸留水の制御を行い、アペソリン性形成について検査を行った。卵巣クロロホルムベースの抽出物は、C.fiorniaeのライフサイクルにおける花の重要性を示すアポプレッサ形成の最大の大きさを有していた。病原体はこのプロトコルの最も重要な構成要素である。
試験間の一貫性を保つために、真菌を日常的に新鮮な培地に移す必要があります。クロロホルムを使用する作業は、安全上の理由からヒュームフードで行う必要があります。これには、材料およびガラス製品の調製、抽出手順、クロロホルムベースのバイオアッセイの伝導が含まれます。
ポイント、病原体、花の雨水コレクション、または宿主抽出の組み合わせは、様々な宿主病原体相互作用を評価するために利用することができる。雨水収集装置および関連するバイオアッセイは多数のパスシステムの雨のイベントの間に動員される宿主の覚醒剤と働くことを可能にする。
