Name: colletotrichum fioriniae development in water and chloroform-based blueberry and cranberry floral extracts
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts at JoVE.com

Vi tackar den William S. Haines, Sr. begåvad tranbär forskningsfond och New Jersey blåbär och tranbär Research Council, Inc. för stöd. Vi vill också tacka Christine Constantelos (svamp kultur och blommig preparat), Langley Oudemans (blommig preparat, Filmning/fotografering), David Jones (blommig preparat och extraktioner), Jennifer Vaiciunas (vägledning och blommig preparat), Jesse Lynch (blommig preparat), Roxanne Tumnalis (allmänt stöd) och ett flertal student/Sommarpraktikanter.

<ol>
	<li>Pszcz&#243;&#322;kowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland.">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167 (2016).</li><li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast:+a+complex+disease.">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li><li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Colletotrichum+acutatum+species+complex.">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li><li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+(teleomorph:+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.)+infection+of+a+scale+insect.">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li><li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colletotrichum+fioriniae+comb.+&amp;+stat.+nov.,+resolving+a+nomenclatural+muddle.">Colletotrichum fioriniae comb. &amp; stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li><li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum,+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov.">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li><li>Wharton, P. S., Di&#233;guez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+Colletotrichum+acutatum.">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jard&#237;n Bot&#225;nico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li><li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development.">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li><li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases. , (1995).</li><li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology. , (2005).</li><li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum.">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li><li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum.">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li><li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields.">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86 (2002).</li><li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum.">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li><li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves.">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li><li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae.">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li><li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae. , (2015).</li><li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides.">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li><li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community:+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities.">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li><li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria.">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

De bioassays att upptäcka C. fioriniae svar blommig extrakt (FEs) utvecklades för blåbär och tranbär frukt ruttna pathosystems men kan lätt anpassas till andra trädgårdsgrödor. Det protokoll som anges ovan har varit värdefullt att förvärva många viktiga data set inklusive, men inte begränsat till: FE effekter på flera isolat av många patogener, tidsförlopp information som rör svamptillväxt stadier i närvaro av olika FEs, jämförelse av utvinning tekniker, inspektion av enskilda kemikalier på C. fioriniae tillväxt och differentiering, utvärdering av enskilda blomma orgel extrakter, effekter av temperatur på C. fioriniae medan i närvaro av FE, effekter fenologi beroende vax extraktioner och blommig regnvatten effekter. Med hjälp av dessa tekniker har data som genereras också lämnat en mycket tydligare förståelse av C. fioriniae liv arrangerar och delvis förtydligar varför perioden bloom är så kritiskt att kontroll av många frukter ruttna patogener.
Inledningsvis alla blommor bearbetades identiskt till det aktivt-FE, men extraheringen har rört sig mot med hjälp av hela blommor. Blommig dissektion var tidskrävande och hade mycket liten inverkan på bioaktiviteten av den resulterande FEs. Dock blommig individorgan kan och har varit utvärderade använder detta protokoll, men stor omsorg måste tas att inte helt lös upp blommig vävnader (kompletterande film 1, med försiktighetsåtgärder som beskrivs i steg 2,3), eftersom detta kan leda till frisläppt svampar-giftigt/statiska föreningar i FE som kan snedvrida de mikroskopiska utvärderingarna. Mindre invasiva extraktioner som pass -är FE (kompletterande Movie 2) och rw-FE nu mer gynnsam på grund av sin användarvänlighet förvärv. Dessutom kräver dessa utvinning tekniker endast dammsugarfilter att förvärva biologiskt aktiva blommig kemiska signaler.
Blommorna används i alla extraktioner var vanligen kyld för 0-3 dagar före extrahera förberedelse. En utmaning i detta protokoll är tid förvaltning av FE omsättning (fältuppsättningen genom lagring av extrakt). Detta förvärrades av många prover från flera källor och datum. Frusna blommor har inte utvärderats i någon verklig omfattning, som tinade blommorna försämrats och missfärgat. Dock när den vattenbaserade FEs har upprättats, upprepad frysning och upptining har inte visat någon effekt på bioaktiviteten i FE, så så länge som FE är snabbt omfrysning efter bioassay förberedelse (livskraftiga 3-årig FE).
Kloroform-baserat extraktion kan utredningen av patogen Svaren till tredimensionella blommig/frukt ytan vaxer i ett tvådimensionellt plan via ch-FE avdunstning på glas coverslips. Det är dock osannolikt att de faktiska kristallina strukturerna av vaxer deponeras från ch-FE är identiska till ytan där de samlades. Menande, kompletterande tekniker bör genomföras om svamp svar på specifika vax strukturer i vivo är i fokus för undersökningen. Kloroform-baserade extrakt behöver mer lagring underhåll än de vattenbaserade extraktioner. Förutom att hålla i ch-FE extrakt i mörkret, PTFE fodrad cellkulturen röret caps och parafilm tätning wrap behöver kontrolleras regelbundet för avdunstning läckor och ersättas vid behov.
Begreppet övervakning blommig regnvatten är rotad i idén om advancing platsspecifika sjukdom övervakningsverktyg. De regnvatten strömavtagare kan anpassas till många andra växt-arkitekturer, så länge samling enheten fångar regnvatten som har körts bort av blommor. Detta tillvägagångssätt ger information om huruvida blommig stimulering är närvarande på fältet vid varje given tidpunkt och kan övervakas under hela säsongen. Alternativt, samling enheter kan distribueras på flera kapell platser att avgöra hur långt blommig cues har tvättats under varje given vätning-event. I framtiden experiment, rw-FE kommer att diktera när fungicid program ska börja och när de kan säkert slut. Dessutom, genom att övervaka fenologi beroende vax extraktioner (protokoll avsnitt 9), har vikten av bloom perioden till patogen biologi blivit ännu tydligare. Det avsnittet ingick också för att Visa flexibiliteten i dessa bioassays, tillhandahålla metoder som möjliggör en sida-vid-sida jämförelse av värd yta vaxer som är tidsmässigt avgränsade. De data som genereras med hjälp av blommig utvinning tekniker och bioassays utgör konkreta indikatorer av patogen stimulering, specifika kemiska klasser viktigt att patogenen biologi och mål för framtida kontrollstrategier.

Colletotrichum fioriniae orsakar en frukt ruttna både allåkerbär blåbär (Vaccinium corymbosum L.) och den stora amerikanska tranbär (V. macrocarpon Aiton)1,2. Denna patogen var nyligen avgränsas från C. acutatum arter komplexa3,4,5,6 och är en kausal agent för blåbär anthracnos och medlem av tranbär frukt röta komplexa, förutom att orsaka många andra växt sjukdomar världen över7. C. fioriniae har en latent, hemibiotrophic livsstil8, med infektioner som inträffar under blom och symptom utveckling inte blir uppenbara tills frukten är i slutfasen av mognad9. I blåbär och tranbär kontrolleras frukt ruttna endast med fungicid ansökningar under perioden bloom. Patogenen övervintrar i vilande blåbär blommig knopp skalor10 och sporulates under bloom. Conidia flyttas hela trädkronorna via regn-splash spridning11,12 och inokulum uppbyggd har varit starkt korrelerad till bloom perioden13. Svar av Colletotrichum arter till värd blommor är inte unik för Vaccinium, eftersom blommor är viktiga komponenter av citrus post bloom frukt drop (PFD)14 samt jordgubb anthracnos15, i båda fallen som orsakar patogenen till sporulate. Alla dessa fall belysa behovet av effektiva metoder för att utvärdera tidsmässiga dynamiken i blommig kemiska ledtrådar om C. fioriniae och andra patogener som infekterar under bloom. De insikter som tillhandahålls av metoderna som beskrivs här blir allt mer värdefull.
Detta protokoll metoder blommig extrakt (FE) upphandling och guider utvärderingen av C. fioriniae Svaren till FE via glas täckglas bioassays15,16. De blommiga utvinning teknikerna är indelade i två huvudtyper; vatten-baserade extraktioner (aktiv-FE, passiv (pass -FE) och fältet regnvatten-baserade (rw-FE)), och kloroform-baserade (ch-FE)17 extraktioner. De vattenbaserade extraktioner möjliggör inspektion av vatten mobiliserade blommig kemiska signaler. Dessa mobiliserade ledtrådar är sannolikt viktiga komponenter domstolens infektion eftersom FE kraftigt ökar hastigheten på infektion16, förutom att ge fukt krävs för infektionen att inträffa. Dessutom utgör de ett mer naturligt tillstånd som blommig stimulering kan tvättas i hela kapellet under vätning-händelser som tidigare observerats i blåbär och andra gröda system14,16. Kloroform-baserade blommig extraktioner (ch-FE) ger också värdefull information som hänför sig till patogen svar värd yta vaxer17,18, belysa tillväxten tidigt i conidia en gång deponeras på mottagliga mottagande organ (dvs. blommor, äggstockarna och utveckla frukt). Patogen svar på säsongsmässiga förändringar i värd yta vaxer kan också övervakas med hjälp av detta protokoll. Följaktligen skräddarsys bioassays arbetar med antingen vatten-baserade FE eller kloroform-baserade FE för att mildra de inneboende skillnaderna mellan dessa två material.
De data som genereras från bioassays avslöjade att vattenbaserade extraktioner stimulera högre nivåer av sekundära conidiation än kloroform-baserade extraktioner där det fanns en definitiv appressorial svar, därför ifrågasätta flera föreningar närvarande i FE. Intressant, observerades båda dessa tillväxt-svar när använder regnvatten som hade sprungit bort av blåbär och tranbär blommor, som anger flera stimulerande föreningar kan tvättas från ytan av blommor. Således, övervakning för blommig stimulering ger inblick i sannolikheten för patogen framgång i ett jordbrukssystem.
Det slutliga målet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att generera biologiska originalplansinformation på svamp växt patogener som svar på blommiga kemiska signaler, samt initierande metoder som kan utnyttja denna blommiga information till stöd i platsspecifika sjukdom förvaltning och beslutsfattande processer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="933">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="3" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">0.22 &#181;m pore size, acetate sterilizing filter</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">101102-280</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry floral extract (FE) clarification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">200-1000 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">40-200 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">5-40 &#181;l pipette with tips</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, any make within range will be adequate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Harbor Freight</td>
			<td style="width:203px;">97098</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry rainwater (rw-)FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Autoclave</td>
			<td style="width:203px;">Amsco</td>
			<td style="width:203px;">3011</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Bar mesh matting (plastic mesh sheet)</td>
			<td style="width:203px;">Winco</td>
			<td style="width:203px;">BL-240</td>
			<td style="width:203px;">Passive (pass)-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Benchtop timer</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">06-662-47</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Black pressure/vacuum hose</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">62994-795</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:324px;">Buchner funnel</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60240</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Bunsen burner&#160;&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Calcium carbonate</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">C64-500</td>
			<td style="width:203px;">Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:203px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:203px;">RC 5B Plus</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">05-527-90</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">10025-694</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Cheesecloth (grade 50)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">AS240</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:324px;">Chloroform</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">JT9175-3</td>
			<td style="width:203px;">Chemical, trichloromethane: assay grade, &#8805; 99% pure, for molecular biology, peroxide-free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Corn Meal Agar (CMA)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">B11132</td>
			<td style="width:203px;">&#160;Pre-mix media, isolate storage on slants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Cotton-blue stain</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">61335</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Curved forceps (45&#730;)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">10-270</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, flower processing and coverslip inversion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Difco Agar</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">90004-032</td>
			<td style="width:203px;">Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Drill-press</td>
			<td style="width:203px;">Delta</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">EASYpure LF Ultrapure water</td>
			<td style="width:203px;">Barnstead</td>
			<td style="width:203px;">D738</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, deionized water source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Ethanol (95%)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Filter flask (500 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Pyrex</td>
			<td style="width:203px;">No. 5340</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Freezer (set to -20&#730; C)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, storage of active-FE, pass-FE, rw-FE&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Fume hood</td>
			<td style="width:203px;">Hamilton</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, chloroform usage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Funnel (7 X 7 cm)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">60820-110</td>
			<td style="width:203px;">Cranberry rw-FE collection, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Generic glass slide&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">22-038-101</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Generic plastic pump spray bottle</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">16126-454</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection, at least 250 ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass cell culture tubes</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass coverslips (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">12-542B</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Glass-pipette (1-100 &#181;l)</td>
			<td style="width:203px;">Hamilton Co. Inc.</td>
			<td style="width:203px;">#710</td>
			<td style="width:203px;">ch-FE bioassay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Glycerol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">G5516</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:203px;">Bright-Line</td>
			<td style="width:203px;">5971R10</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Incubator (set to 25&#730; C, dark)</td>
			<td style="width:203px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:203px;">50036</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Lactic acid</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:203px;">W261106</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:203px;">Labconco</td>
			<td style="width:203px;">3730400</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, sterile work environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Metal probe (generic)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">05-408-138</td>
			<td style="width:203px;">Aqueous treatment mixture storage and preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Microscope, Leica DMLB</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:203px;">020-519.010</td>
			<td style="width:203px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Mortar (ceramic)</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60313</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Nitrile gloves&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">19-130-1597D</td>
			<td style="width:203px;">Flower collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Paper disks (cut paper towels)</td>
			<td style="width:203px;">Office Basics</td>
			<td style="width:203px;">KCC01510</td>
			<td style="width:203px;">humidity control in bioassay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Parafilm</td>
			<td style="width:203px;">Bemis</td>
			<td style="width:203px;">PM-996</td>
			<td style="width:203px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pestle (ceramic)</td>
			<td style="width:203px;">Coors USA</td>
			<td style="width:203px;">60314</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Phenol crystals</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">A92-100</td>
			<td style="width:203px;">Lactophenol cotton-blue stain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Plastic bags (~100 mm X 152 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Uline</td>
			<td style="width:203px;">S1294</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, flower refrigeration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">FB0875712</td>
			<td style="width:203px;">(Petri dish), bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">60927-228</td>
			<td style="width:203px;">Storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex beakers (100 ml)</td>
			<td style="width:203px;">Pyrex</td>
			<td style="width:203px;">No. 1000</td>
			<td style="width:203px;">Preparation of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex bread-pan</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pyrex graduated cylinder</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, FE preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Refrigerator (set to 4&#730; C)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, storage of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Bioassay conductance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Sharp-pointed dissecting scissors</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">8940</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Stainless steel mesh strainer</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">470149-756</td>
			<td style="width:203px;">Preparation of ch-FE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Step drill bit (step-bit)</td>
			<td style="width:203px;">Dewalt</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Equipment, rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Sterile loop (combi-loop)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">22-363-602&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Culture preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Telephone wire (internal wires)</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Blueberry rw-FE collection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:324px;">Test tube basket&#160;</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:203px;">470137-792</td>
			<td style="width:203px;">Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">V8 Juice</td>
			<td style="width:203px;">Campbell&#39;s Soup Company</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">Fungal media component</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:324px;">Vintage plastic mesh [strawberry] baskets</td>
			<td style="width:203px;">Donation</td>
			<td style="width:203px;">-</td>
			<td style="width:203px;">pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:324px;">Vortex Genie (Vortex)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:203px;">12-812</td>
			<td style="width:203px;">Spore suspension preparation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:324px;">Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles</td>
			<td style="width:203px;">Whatman</td>
			<td style="width:203px;">1001-055</td>
			<td style="width:203px;">Vacuum filter component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">White plastic twist ties (100 mm)</td>
			<td style="width:203px;">Uline</td>
			<td style="width:203px;">S-566W</td>
			<td style="width:203px;">Cranberry rw-FE collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colletotrichum fioriniae development in water and chloroform-based blueberry and cranberry floral extracts

För att noggrant övervaka fenologi för perioden bloom och tidsmässiga dynamiken i blommig kemiska ledtrådar om svamp frukt ruttna patogener, utvecklades blommig extraktionsmetoder och täckglas bioassays utnyttja Colletotrichum fioriniae. I blåbär och tranbär styrs denna patogen optimalt genom att tillämpa fungicider under perioden bloom på grund av den roll blommor spelar i de inledande skedena av infektion. Protokollet beskrivs här beskriver hur blommig extrakt (FE) erhölls med vatten - kloroform- och fältet regnvatten-baserade metoder för senare användning i motsvarande glas täckglas bioassays. Varje FE bidragit till en annan uppsättning information: svar av C. fioriniae mobiliserade blommig kemiska signaler i vatten (vattenbaserad), patogen reaktion på blomma och frukt ytan vaxer (kloroform-baserat), och fältbaserade övervakning av samlat blommig regnvatten, flytta in vitro- observationer till ett jordbrukslandskap. FE i huvudsak beskrivs som antingen vatten - eller kloroform-baserade, med en lämplig bioassay som beskrivs för att kompensera för de inneboende skillnaderna mellan dessa två material. Regnvatten som hade springa iväg blommor samlades i unika enheter för varje gröda, anspelar på den flexibilitet och tillämpningen av denna metod för andra grödor system. Bioassays är snabb, billig, enkel och ger förmågan att generera spatiotemporal och platsspecifika information om förekomst av stimulerande blommig föreningar från olika källor. Denna information kommer i slutändan bättre informera sjukdom förvaltningsstrategier, FE minska den tid som behövs för infektion förekommer, vilket ger inblick i föränderliga risker för patogen infektion under växtsäsongen.

Resultaten presenteras här är några exempel på de många analyser som kan utföras med hjälp av denna metod. Figur 1 är en illustrerad guide till vattenbaserade FE bioassayen, och kompletteras av figur 2 som följer till kloroform-baserade FE bioassayen. Figur 3 ger en visuell guide till vad som kan förväntas vid mikroskopisk utvärdering av C. fioriniae på 24 h, både vatten - och kloroform-baserade bioassays (jämfört SDW kontroller). Figur 4 beskriver en studie på 24 h tid-kurs med C. fioriniae i närvaro av tranbär sorten 'Stevens' ch-FE, och ger visuell referens till en import resultatet av denna forskning: FE minskade den tid som behövs för att bilda infektion strukturer jämfört med SDW. Figur 5 ger ett exempel på data som samlats in från ett täckglas bioassay med tranbär blommig regnvatten (CB ”blomma” rw-FE). Figur 6 representerar ett annat viktigt resultat: blommig äggstock ch-FE var mycket mer stimulerande än frukt ch-FE, om vikten av bloom i livscykeln för C. fioriniae. Kompletterande bilder och filmer ger viktiga visuella av blommorna används i extraktioner och blommig regnvatten samling enheter/distribution, förutom filmer som visualiserar den aktiva och passiva - utvinning ( vattenbaserade) processer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figur 1 : Allmän översikt över den vattenbaserade blommig extrahera (FE) bioassay. Denna analys var utnyttjas för vattenbaserade blommig extrakt med både blåbär och tranbär blommor: aktiv -blommig extrakt (aktiv-FE), passiv -blommig extrakt (passera-FE) och blommig regnvatten (rw-FE). -FE del utgör vanligtvis den experimentella/variabel faktorn. Omvänt-FE portion kan vara konstant och tid punkter/timmar efter inympningen kan utvärderas. Preferens har gjorts mot 4 fält analys på 200 X förstoring. Förkortningar: Sterilt avjoniserat vatten, SDW; Areal per synfält, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figur 2 : Allmän översikt över den kloroform-baserade blommig extrahera (ch-FE) bioassay. Denna analys var utnyttjas för både blåbär och tranbär (blommor, äggstockarna och frukt). Endast en typ av vattenhaltigt behandlingsblandningen användes i denna analys, 1 del sporsuspensionen till 2 delar SDW (att hålla conidial koncentration konsekvent genom avdunstning. ch-FE). Denna analys kan användas för att jämföra flera ch-FE (vaxer från olika växt ytor) eller flera tid punkter/timmar efter inympningen med hjälp av en enda ch-FE. Förkortningar: Sterilt avjoniserat vatten, SDW; Van Tieghem [glass] celler, VanT. cell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figur 3 : Visuell jämförelse av Colletotrichum fioriniae i närvaro av vatten-baserade FE och ch-FE. I denna analys blåbär 'Bluecrop' (aktiv-FE, vattenbaserade) (svamp isolatet: BB #10) och tranbär 'Stevens' kloroform-baserade (ch-FE) (svamp isolatet: CB-PMAP182) blommiga extrakt jämfördes SDW kontroller. En dramatisk ökning av sekundära conidiation (ringar) och appressorium bildning (pilspetsar) observerades när man jämför conidia i närvaro av SDW (kontroll) (A) till aktiv-FE (B) på 24 h efter inympningen. Sekundära conidiation var dock inte lika uppenbart när man jämför kloroform bioassay SDW kontroll (C) till ch-FE (D); snarare, C. fioriniae tillväxt skiftat mot appressorial bildning. Visas är ett gemensamt svar på varje typ av utvinning, vattenbaserad och kloroform-baserade, oavsett host/blommiga arter beskrivs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figur 4 : Tid-rätters studie (24 h) med Colletotrichum fioriniae i närvaro av ch-FE. I denna analys inspekterades visuellt en SDW kontroll (A-D) och tranbär 'Stevens' ch-FE (E-F) på 0, 6, 12 och 24 h efter inympningen (ett exempel på variabla punkter istället för att jämföra flera FE). Appressorium formation (pilspetsar) började på 6 h i ch-FE och ökat stadigt under hela efterföljande tidpunkter. Detta resultat undflyr till en viktig faktor för patogen biologi under perioden bloom: blommor minska den tid som behövs för att bilda infektion strukturer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figur 5 : Grafisk visning av data som samlas in med rw-FE i en bioassay. Regnvatten köra från tranbär blommor (CB ”blomma” rw-FE) och virgin regnvatten som inte hade berört någon tranbär växt vävnader (”Ground” rw-FE) från en enda vätning-event plus en standard aktiva, vatten-baserade blommig Tranbärsextrakt (CB aktiva -FE) (positiv kontroll) och SDW (negativ kontroll) utsattes för en vattenbaserad täckglas bioassay och utvärderas för C. fioriniae tillväxt. CB ”blomma” rw-FE hade samma nivå av sekundär conidiation och appressorium bildning som den vanliga CB active-FE på 24 h efter inympningen, som anger att strömavtagare var effektiva i att fånga blommig stimulantia släppt under en vätning-händelse. Totala conidia består av primär (deponeras), conidia och nybildade sekundära conidia. Bokstäver anger signifikanta skillnader på p < 0,05 enligt Fischers minst signifikant skillnad testa (LSD); versaler, totala conidia; gemener, appressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figur 6 : Tranbär fenologi baserat ch-FE bioassay, okulärbesiktning. Sjukdomsbehandling för frukt ruttna svampar ofta innebär bloom tid fungicid applikationer. Här utvärderades visuellt tranbär kloroform-baserade extrakt (ch-FE) från flera tillväxtstadierna för tranbär ('Stevens') effekten av surface vaxer på C. fioriniae på 24 h efter inympningen. Äggstockarna samlas i juni (A), omogen frukt samlas i juli och augusti (B, C), skördat frukt samlas in i oktober (D)och en SDW kontroll (E) inspekterades för appressorial bildandet (pilspetsar). Äggstocken ch-FE hade största omfattningen av appressorial bildas, som visar att denna anläggning fenologi (bloom) är kritiskt viktigt att den lifecycle av C. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Kompletterande figur1: Blueberry Blomställning. Blåbär blommor samlades för extraktioner under full blom (April-maj i New Jersey, USA) (visas 'Bluecrop'). Observera överlappningen av korolla/äggstockar från intilliggande blommor och den övergripande arkitekturen av Blomställningen jämfört med kompletterande figur 2 (tranbär upprätt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Kompletterande figur 2: tranbär upprätt. Tranbär blommor samlades för extraktioner under full blom (juni-juli i New Jersey, USA) (visas 'Stevens'). Observera de omväxlande blomma stegen på en enda tranbär Blomställning (upprätt), och den krokiga, vatten droplet behålla formen på corolla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Kompletterande figur 3: Blueberry regnvatten distribution (blomma). Färdig blåbär blommig regnvatten samling enhet, placerad direkt under ett kluster av blomställningar. Observera de plastbelagda wire används för att orientera enheten vertikalt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Kompletterande figur 4: Blueberry regnvatten distribution (stem). Avslutade blåbär blommig regnvatten samling anordning, placerat halvvägs ner stjälken mellan en blomställning och kronan på busken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Kompletterande figur 5: Blueberry regnvatten distribution (crown). Färdig blåbär blommig regnvatten samling anordning, placerat vid basen av busken (crown). Obs plast bestruket ledningar kan avlägsnas om det inte behövs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Kompletterande figur 6: Blueberry regnvatten distribution (marken). Avslutade jungfru regnvatten samling enheten, placeras intill blåbär buskar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Kompletterande figur 7: tranbär regnvatten distribution (närbild). Färdig tranbär blommig regnvatten samling enhet, med två stolpar instoppat under de prydligt korsade tråd band. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Kompletterande figur 8: tranbär regnvatten distribution. Flera avslutade tranbär blommig regnvatten-enheter som distribueras i en mosse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Kompletterande film 1: aktiv, vatten-baserade blommig extrakt (aktiv -FE). Kompletterande stöd för video följande steg 2,3-2.5.1. Blåbär 'Bluecrop' blommor användes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Kompletterande Movie 2: passiv, vatten-baserade blommig extrakt (passera-FE). Kompletterande stöd för video följande steg 3.3-3.4. Blåbär 'Bluecrop' blommor användes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Kompletterande film 3: distribution av tranbär blommig regnvatten samling enheter. Kompletterande stöd för video följande steg 6,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts at JoVE.com

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Här beskrivs bioassays syftar till att övervaka utvecklingen av svamp patogener, Colletotrichum fioriniae, i närvaro av blåbär eller tranbär blommig extrakt på glas coverslips. Vatten-, kloroform och fältet regnvatten - baserat blommig utvinning tekniker är detaljerade samt fördjupad insikt i hur denna information kan tillämpas.

Colletotrichum fioriniae Utveckling i vatten och kloroform-baserade blåbär och tranbär blommig extrakt

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Detta protokoll ger ett billigt och anpassningsbart system för att utvärdera den tidsmässiga dynamiken i fluorochemical ledtrådar på Colletotrichum fiorniae och andra växt patogener som infekterar termen bloom. Nya golv regnvatten insamling enheter gör det möjligt för användaren att övervaka naturliga stimulantia och villkor som påverkar patogenutveckling i en nära realtid platsspecifika sätt. Börja detta förfarande med en kultur av Colletotrichum fiorniae från en naturligt infekterad värd som beskrivs i textprotokollet.När kolonier börjar sporulate, strimma conidia på en annan V 8 Juice agar som innehåller cellkultur skålen för att producera en hög densitet sporulating kultur. Efter sju dagars tillväxt, använd en standard steril slinga för att samla en liten mängd conidia från högdensitetskulturen genom att lätt röra slingan till den conidial massan. Rör om detta i ett centrifugeringsrör på 15 milliliter som innehåller 10 milliliter sterilt avjoniserat vatten.Vortexa detta prov i 10 sekunder. Med hjälp av en vanlig pipett, störta upp och ner flera gånger för att ytterligare blanda provet. Placera sedan en droppe av det virvelade provet på hemocytometern och uppskatta sporkoncentrationer.Justera koncentrationen till 0,1 miljoner conidia per milliliter sterilt destillerat vatten med en slutvolym på fem milliliter. Detta kallas sporfjädringen och görs endast omedelbart före användning i antingen bioassay. För att utföra kloroformbaserad blomextraktion, rengör alla komponenter med 95%etanol två gånger.Rengör sedan komponenterna två gånger med kloroform för att förhindra kontaminering för varje extraktion. Rengör inte PTFE-fodrade lock med kloroform eftersom det kommer att skada dem. Efter rengöringen, ställ komponenterna åt sidan för att torka upp och ner.Kombinera en del bearbetade blommor till nio delar kloroform i en bägare genom att lägga till blommor och sedan kloroform. Snurra försiktigt i 30 sekunder och sila genom en rostfri skärm i den andra bägaren. Häll det kloroformbaserade extraktet från den andra bägaren i glasodlingsröret och fäst PTFE-locket.Linda locket med parafilm för att förhindra avdunstning. Förvara det resulterande kloroformbaserade blomextraktet i mörker för att minska ljusnedbrytningen vid fyra grader Celsius tills experimentell användning. Upprepa extraktioner med flera prover för att tillhandahålla replikat.Om du vill skapa en uppsamlingsenhet för varje vald plats använder du en stegbit som är fäst vid en borrpress för att borra ett hål i botten av en spraykopp. Skär sedan en rak linje från toppen av hålet till mynningen av spraykoppen. Borra nu fyra ekvidstiga hål som är tillräckligt stora för att gänga den plastbelagda tråden vid sprutkoppens mynning.Fäst ena änden av de plastbelagda trådarna lämnar ena änden fri. Borra ett hål som är tillräckligt stort för att trä färgsprayen eller koppadaptern i ett 50 milliliter centrifuglockslocklock. Täta adapterns gängor med parafilm för att förhindra att det läcker.Fäst detta på både centrifuglocket och gängad del av sprejkoppen. Fäst sedan den parade 50 millimeter centrifugröret. Skapa fyra samlingsenheter per provtagningsplats.Distribuera enheter på utvalda platser genom att böja sprejkoppar för att passa på stammar. Orientera den skurna sidan av sprejkoppen uppåt med hjälp av de plastbelagda trådarna som är fästa vid andra stjälkar. Detta säkerställer vatten som passerar över blommorna fångas.För att samla regnvatten från tranbär blommor, första värme punktering åtta ekvidstiga hål runt munnen av tratten med hjälp av en metall sond. Sätt i twistband i fyra av hålen. Fäst de andra ändarna till det hålets motsatta plats som bildar ett snyggt korsningsmönster.Linda tratten ner ånga med parafilm och ställ åt sidan. Borra ett hål som är tillräckligt stort för att för in trattens nedstjälv i en centrifugelock på 50 milliliter med en trappstegsmössa med en stegbit. För in den förberedda tratten i centrifuglocket.Efter regn eller överliggande bevattning, ta bort och ersätta botten rör delen av centrifugröret. Regnvattenuppsamlingsrören bör snabbt ändras efter vätningshändelser då de är benägna att nedbrytning från naturliga föroreningar mobiliseras i avrinningen som bakterier och andra svampar. Placera två lager av pappersskivor i kulturrätter och blötlägg med två milliliter sterilt destillerat vatten.Blanda därefter lika stora volymer av sterilt destillerat vatten och vattenbaserat blomextrakt i två milliliter mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan en lika stor volym av sporupphängningen till de beredda två milliliter mikrocentrifugrören. Den resulterande beredningen kallas en vattenhaltig behandlingsblandning.För kontrollen, utelämna blomextrakt del och ersätta med sterilt destillerat vatten för att hålla conidial koncentrationerna konsekvent. Placera nu färdigrenade glasöverdrag ovanpå de indränkta hushållspapperen i cellodlingsskålen. Placera en 40 mikroliter droppe vattenhaltig behandling blandning på mitten av en coverslip.Upprepa detta för önskade behandlingar inklusive kontrollen. Stäng sedan cellodlingsrätten. När alla behandlingar och replikat har dispenserats, placera alla replikerade cellkultur rätter i en förseglad plastbehållare och inkubera på 25 grader Celsius i mörkret.Vid förutbestämda tidpunkter, tillsätt 10 mikroliter av ett fixativt till dropparna stoppa tillväxten och semi-bevara fästet. När en fixativ har lagts till, försiktigt invertera täcken placera var och en av dem droppsidan ner på ett glas mikroskop bild för att underlätta mikroskopisk undersökning. När alla täcken är på glas mikroskopet diabilder, låt dem bosätta sig och delvis torka i flödet huven i 20 minuter.Räkna alla conidia närvarande på täcket inklusive primära conidia, grodda conidia, och nybildade sekundära conidia, samt appressoria. Arbeta på antingen 400 gånger förstoring eller 200 gånger totalt en yta på 3,808 kvadratmillimeter. I en laminär flödeshuva, tillsätt två lika stora volymer sterilt destillerat vatten och en volym sporfjädring till ett två milliliter mikrocentrifugrör.Ställ denna vattenhaltiga behandling blandning åt sidan för kloroform-baserade blomextrakt bioassays. I en rök huva, placera en Van T Cell på ett glas täckskydd i den förberedda plast cell kultur skålen. Dispense 33 mikroliter av önskad kloroform-baserade blomextrakt i mitten av cellen och låt torka.Rör inte cellens väggar. För kontrollbehandlingen, tillsätt jungfrukloroform. När det kloroformbaserade blomextraktet har torkat, dosera 99 mikroliter av den beredda vattenhaltiga behandlingsblandningen med en vanlig pipett i mitten av Van T Cell.Stäng sedan alla cellkulturrätter och inkubera. Vid förutbestämda tidpunkter, tillsätt 15 mikroliter av ett fixativ till Van T Cell och låt den sitta i minst fem minuter för att säkerställa tillräcklig svampfärgning. Efter den tiden, försiktigt bort Van T Cell.Utför coverslip inversion och datainsamling steg som tidigare. Vid mikroskopisk utvärdering av C.fiorniae vid 24 timmar post inokulering, jämförelse av conidia i närvaro av sterila destillerat vatten kontra vatten-baserade blommig extrakt en dramatisk ökning av sekundära conidiation och appressorium bildas. Sekundär konidiering var dock inte lika uppenbart när man jämför kloroform bioassay sterila destillerat vatten kontroll med kloroform-baserade extrakt.Snarare C.fiorniae tillväxt skiftade mot appressorial formation. I denna analys, en steril destillerat vatten kontroll och tranbär kloroform-baserade blommiga extraktioner inspekterades visuellt vid noll, sex, 12 och 24 timmar efter inokulering. Appressoriumbildningen började vid sex timmar i det kloroformbaserade blomextraktet och ökade stadigt under de efterföljande tidspunkterna.Detta resultat stöder konstaterandet att blommor minska den tid som behövs för att bilda infektionsstrukturer. Sjukdomshantering för frukt ruttnande svampar innebär ofta bloom time fungicid applikationer. Här var tranbär kloroform-baserade extrakt från flera tillväxt stadier av tranbär visuellt utvärderas för de effektiva ytan vaxer på C.fiorniae vid 24 timmar post inokulering.Äggstockar som samlades in i juni, omogna frukter som samlades in i juli, och i augusti, skördade frukt som samlats in i oktober, och en steril destillerad vattenkontroll inspekterades för appressorial formation. Äggstock kloroform-baserade extrakt hade den största omfattningen av appressorial formation som anger vikten av blom i livscykeln för C.fiorniae. Patogenen är den viktigaste komponenten i detta protokoll.Svampar bör flyttas till färska medier rutinmässigt för att behålla överensstämmelsen mellan prövningar. Alla arbeten med kloroform måste utföras i en rökhuv av säkerhetsskäl. Detta inkluderar beredning av material och glas, utvinning förfaranden, och konduktion av kloroform-baserade bioassay.Kombinationer av tidspunkter, patogener, blommor regnvatten samlingar, eller värd extraktioner kan utnyttjas för att utvärdera olika värd-patogen interaktioner. Regnvatten samling enheter och tillhörande bioassays kommer att göra det möjligt för andra att arbeta med värd stimulantia mobiliseras under regn händelser i många väg system.

Research

JoVE Journal

Environment

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Metod 1615. Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. I. Insamling av virusprov

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metod 1615 Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. Del III. Virus Detection med RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR-analys för samtidig kvantifiering av<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Och Human fekal-associerade HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Karakterisering och tillämpning av passiva provtagare för övervakning av bekämpningsmedel i vatten

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Jord lysimeter Grävning för kopplade Hydrologiska, geokemiska och mikrobiologiska undersökningar

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Användning av en filterpatron för filtrering av vattenprover och utvinning av miljö DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Continuous Instream Monitoring of Nutrients and Sediment in Agricultural Watersheds

Kontinuerlig Instream övervakning av näringsämnen och Sediment i jordbruket vattendelare

Pollutant concentrations and loads in watersheds vary considerably with time and space. Accurate and timely information on the magnitude of pollutants in ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Mätning och kartläggning mönster jorderosion och nedfall kopplad till jord karbonat koncentrationer Under jordbrukets förvaltning

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Protokoll för akut och kronisk ekotoxicitet testning av den turkos Killifish Nothobranchius furzeri

The killifish Nothobranchius furzeri is an emerging model organism in the field of ecotoxicology and its applicability in acute and chronic ecotoxicity ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Byggandet av en billig mobil inkubator för fält- och laboratoriebruk

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...