Name: detection of protease activity by fluorescent peptide zymography
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography at JoVE.com

Finanziamento fornito da The Ohio State University College of Engineering, dipartimento di ingegneria biomedica e il Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital e Richard J. Solove Research Institute.

1. preparazione di strato di Gel di risoluzione
<ol><li>Preparare un poliacrilammide 10% Risoluzione soluzione di gel come da tabella 1. Aggiungere il tetrametiletilendiammina (TEMED) e l'ammonio persolfato (APS) immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.</li>
	<li>Riempire un vassoio del mini-gel vuoto 1,5 mm a metà strada (5 mL) con la soluzione di gel di risoluzione 10%.</li>
	<li>Aggiungere uno strato sottile di isopropanolo (~ 500 µ l) nella ...

<ol>
	<li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes.">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li><li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Gelatinases+(MMP-2+and+MMP-9)+by+Gelatin+Zymography.">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li><li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase.">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li><li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1,+MMP-8,+and+MMP-13.">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li><li>Perera, H. K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Aspartic+Proteinase+Activities+Using+Gel+Zymography.">Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography.</a> Zymography. , 43-52 (2017).</li><li>van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li><li>Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography,+Casein+Zymography,+and+Reverse+Zymography:+Activity+Assays+for+Proteases+and+their+Inhibitors.">Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors.</a> Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).</li><li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels.">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li><li>Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+proteolytic+activity+by+fluorescent+zymogram+in-gel+assays.">Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays.</a> BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).</li><li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate.">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li><li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition.">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li><li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors.">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).</li><li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide.">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li><li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1&#8242;+Positions.">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1&#8242; Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li><li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry.">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li><li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva.">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li><li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases.">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li></ol>

Le attuali tecniche di zymographic si affidano l'incorporazione di substrati nativi in gel di poliacrilammide per la rilevazione di proteolisi. Mentre queste tecniche hanno raccolto l'uso molto diffuso, sono ancora limitati nel numero di proteasi che sono in grado di rilevare. Qui, un protocollo è stato descritto in quali peptidi fluorescenti, proteasi-degradabile sono incorporate la risoluzione di gel di poliacrilammide. Covalente accoppiamento usando una molecola del linker azido-PEG3-maleimide consente la separazione...

Zymography gel è una tecnica biologica utilizzata per misurare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici, quali fluidi corporei o delle cellule di coltura1,2,3. I campioni sono separati dai loro pesi molecolari con l'elettroforesi attraverso un gel di poliacrilammide incorporato con un substrato degradabile. I substrati degradabili comuni includono gelatina, caseina, collagene ed elastina, che sono stati utilizzati per misurare l'attività delle metalloproteinasi di matrice (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, oltre ad una varietà di catepsine1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. dopo elettroforesi, gli enzimi sono rinaturalizzato e permesso di degradare le proteine all'interno del gel. In zymography tradizionale gel, il gel è colorato con un colorante di proteine, come blu di Coomassie, e l'attività della proteasi è rilevato come una perdita di segnale, cioè, bianco bande (degradazione della proteina) su uno sfondo blu scuro.
Qui, descriviamo un protocollo per un metodo alternativo di gel zymography, in cui il substrato degradabile è un breve, peptide fluorogenico covalentemente incorporato in gel di poliacrilammide (Figura 1). La sostituzione di peptidi sintetici come i substrati degradabile consente il rilevamento di una gamma più ampia di proteasi rispetto al tradizionale gel zymography con proteine native9. Covalente del peptide fluorogenico impedisce la diffusione del peptide e la migrazione durante l'elettroforesi del gel, osservato con precedenti metodi9,10. Inoltre, l'uso di un substrato fluorogenico consente rilevazione diretta delle attività della proteasi senza ulteriori macchiatura e passi de-colorazione. L'obiettivo generale di questo metodo è la rilevazione di attività di proteasi in campioni biologici tramite l'incorporazione covalente di peptidi fluorogenici in gel di zymogram.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mm Empty Gel Cassettes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC3510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x Zymography Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>087721B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC201024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammounium Persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>AZ107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP510100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N N N&#39; N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Hypodermic Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Flask (100 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-873-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septum Rubber Stopper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-872-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochlroide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td>
			<td>GE Amersham</td>
			<td>8149-30-9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protease activity by fluorescent peptide zymography

Lo scopo di questo metodo è quello di misurare l'attività proteolitica dei campioni biologici complessi. I campioni sono separati dal peso molecolare tramite l'elettroforesi attraverso un gel di risoluzione incorporato con un substrato degradabile. Questo metodo si differenzia dal tradizionale gel zymography in quanto un peptide fluorogenico estiguuto covalentemente incorporò il gel di risoluzione invece di proteine integrale, come gelatina o caseina. Uso dei peptidi fluorogenici consente il rilevamento diretto di attività proteolitica senza ulteriori passaggi di colorazione. Gli enzimi all'interno i campioni biologici fendono il peptide fluorogenico estiguuto, conseguente a un aumento di fluorescenza. Il segnale fluorescente nel gel è allora imaged con uno scanner standard del gel fluorescente e quantificati tramite densitometria. L'uso di peptidi come il substrato degradabile espande notevolmente le possibili proteasi rilevabile con le tecniche di zymographic.

Utilizzando il metodo descritto qui, due peptidi di proteasi-degradabile fluorescenti sono state incorporate in gel di poliacrilammide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abbreviato come QGIW in tutto il testo e le figure) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abbreviato come LACW in tutto il testo e le figure). ↓ indica il sito di clivaggio. QGIW è un collagene-I derivati sequenza progettato per rilevare le collagenasi cellulare14. LACW è una sequ...

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Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Le attuali tecniche zigografiche rilevano un numero limitato di proteasi. La zimografia peptidica fluorescente utilizza peptidi fluorescenti come substrato degradabile consentendo la misurazione di una maggiore gamma di proteasi. Il vantaggio principale di questo metodo è il suo design modulare.La sequenza del peptide fluorescente determina quali proteasi vengono rilevate e il peptide fluorescente può essere facilmente scambiato con un peptide di una sequenza diversa, una capacità di rilevare altre proteasi. Questa tecnica può aiutare a informare la progettazione dell'uso dei peptidi come cross-linker degradabili in biomateriali ingegnerizzati come quelli utilizzati per la somministrazione di farmaci o applicazioni di ingegneria tissutale. L'incorporazione di questo peptide in questa tecnica può identificare le proteasi secrete dai tessuti che sono responsabili della degradazione dei biomateriali.La dimostrazione di questa tecnica è importante per visualizzare l'approccio multistrato unico rispetto ad altre tecniche di zimografia. A dimostrare questa tecnica sarà, Ameya Deshmukh, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione di gel risolutivo al 10% di poliacrilammide come descritto nella tabella uno del protocollo di testo.Immediatamente prima di versare il gel, aggiungere il TEMED e l'APS. Quindi, riempire e svuotare la mini cassetta gel da 1,5 millimetri a metà strada con la soluzione di gel risolutivo. Aggiungere un sottile strato di isopropanolo nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un gel di livello e prevenire le bolle.Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando la poliacrilammide nel tubo ha completamente solidificato la reazione è completa. Mentre il primo strato di gel risolutivo è la polimerizzazione, recuperare il kit Azido-PEG3-Maleimide dallo stoccaggio a 20 gradi Celsius e consentire ai componenti di raggiungere la temperatura ambiente.Quindi, sciogliere i componenti della fiala due nel volume raccomandato dal produttore di DMSO. E vortice per 30 secondi per garantire che i liquidi siano ben miscelati. Trasferire il contenuto di una fiala in un pallone inferiore rotondo pulito e asciutto da 100 milliletteri che contiene una barra di agitazione.Inserire immediatamente un tappo di setto di gomma con un diaframma che può essere perforato con una siringa nella bocca del pallone. Quindi, inserire due aghi per siringhe calibro 18 nel diaframma. Collegare uno degli aghi della siringa a un serbatoio di gas inerte e consentire al gas di riempire il pallone inferiore rotondo per tre minuti.Quindi, spegnere il gas inerte e staccarlo dall'ago. Usando una siringa, iniettare l'intero contenuto del flaconcino due nel pallone. Rimuovere entrambi gli aghi e la siringa.Lasciare mescolare i componenti per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'agitazione. Dopo questo rimuovere il tappo del setto di gomma e trasferire il contenuto in un tubo di centrifuga pulito da cinque millilitri. Una volta che il primo strato di gel risolutivo ha polimerizzato versare lo strato di isopropanolo.Pipettare un millilitro di acqua deionizzata sopra il gel e quindi versare l'acqua per risciacquare il gel. Recuperare il peptide fluorescente funzionalizzato al tiolo dallo stoccaggio a 80 gradi Celsius. Lasciare scongelare a temperatura ambiente.Preparare una soluzione di gel risolutivo al 10% contenente la molecola del linker Azido-PEG3-Maleimide e il peptide fluorescente come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Immediatamente prima di versare il gel aggiungere il TMED e l'APS. Quindi, riempire metà della porzione rimanente della cassetta di gel con la soluzione di gel risolutivo peptidico.Aggiungere un sottile strato di isopropanolo nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un gel di livello e prevenire le bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Al termine della reazione, versare lo strato isopropanolo.Pipettare un millilitro di acqua deionizzata sopra il gel e quindi versare l'acqua per risciacquare il gel. Se non si utilizzano immediatamente i gel, conservarli immergendoli in una scatola di plastica piena di 100 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius. Avvolgere la scatola in un foglio di alluminio per evitare il fotobleaching.Preparare innanzitutto una soluzione gel di impilamento del 5% come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Immediatamente prima di versare il gel aggiungere il TMED e l'APS. Riempire la porzione vuota rimanente della cassetta di gel con la soluzione di gel impilamento.Inserire rapidamente un pettine di gel da 1,5 millimetri nello strato di gel impilamento assicurandosi che non rimangano bolle intrappolate sotto i pozzi. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Al termine della reazione, rimuovere delicatamente il pettine e il nastro dal retro della cassetta di gel.Per iniziare, sciogliere i campioni nel buffer del campione di zimografia convenzionale. Aggiungere 400 millilitro os 1X tris glicenico SDS running buffer all'apparato gel. Caricare fino a 35 microlitri di campione per pozzo.Eseguire i campioni a 120 volt a quattro gradi Celsius per un'ora e mezza o fino a quando gli standard di peso molecolare indicano che le proteasi di interesse si trovano all'interno dello strato di gel che risolve i peptidi. Dopo questo, rimuovere i gel dalla cassetta di plastica. Lavare i gel tre volte in tampone di ri-naturing a temperatura ambiente sotto delicata agitazione.Ad ogni lavaggio, della durata di 10 minuti. Trasferire i gel in una soluzione tampone in via di sviluppo per 15 minuti. Quindi sostituire la soluzione con un tampone di sviluppo fresco e incubare a 37 gradi Celsius sotto delicata agitazione per 24 ore.Successivamente, utilizzare un imager dello scanner di gel fluorescente con i filtri di eccitazione ed emissione appropriati per l'immagine dei gel. In questo studio alla proteasi fluorescente i peptidi degradabili sono incorporati nei gel di poliacrilammide. QGIW è una sequenza derivata dal collagene progettata per rilevare la collagenesi cellulare, mentre LACW è una sequenza ottimizzata per il rilevamento di MMP-14 e MMP-11.L'imaging fluorescente rivela numerose bande all'interno dei gel peptidici LACW, mentre solo una singola banda è vista nei gel QGIW. Rispetto alla zimografia della gelatina, i gel LACW sono in grado di rilevare più bande proteolitiche, il che dimostra la capacità della zimografia peptidica di rilevare una gamma più ampia di proteasi presenti all'interno di campioni biologici rispetto ai metodi tradizionali che utilizzano substrati nativi. Le cellule nemografiche peptidiche vengono quindi incubate in un tampone di sviluppo contenente GM6001, un inibitore dell'MMP ad ampio spettro, o E64, un inibitore generale della catesina.Il trattamento dei gel peptidici LACW con GM6001, diminuisce l'intensità delle bande. Mentre il trattamento con E64 non ha alcun effetto percepibile. Il trattamento dei gel peptidici QGIQ con GM6001 si traduce in una completa ablazione delle bande precedentemente viste.Mentre E64 non ha alcun effetto. La zimografia della gelatina viene condotta utilizzando MMP-9 purificato e attivato per confrontare la sensibilità della zimografia peptidica con l'attuale gold standard. I gel LACW sono in grado di rilevare le concentrazioni più piccole di MMP-9.Le proteasi richiedono condizioni specifiche per riprotersi e attivarsi. Preparare con cura le soluzioni tampone per garantire che la composizione e il PH siano corretti. Questo metodo può essere integrato dalle tecniche esistenti per verificare l'identità ed eseguire ulteriori analisi delle proteasi misurate.Ciò include l'assorbimento occidentale, la PCR in tempo reale e la spettrometria di massa. Fare attenzione quando si maneggia poliacrilammide. La soluzione non ipnotizzata è considerata una potente neurotossina e i dispositivi di protezione individuale appropriati devono sempre essere indossati durante la manipolazione.

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Rilevamento della progressione del tumore del polmone nei topi mediante Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...