Name: quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Nous remercions Irmgard Weiss excellente assistance technique. Les auteurs remercient Hermes Pofantis et du Andoniya Petkova. Les auteurs remercient également l’Institut européen des neurosciences pour l’utilisation de la LSM800 et l’assistance technique, notamment par le Dr Nils Halbsgut. Ce travail a été financé par l’université médicale centre de Göttingen. JSV reconnaît la prise en charge par le centre pour la microscopie nanométrique et physiologie moléculaire de la cerveau (CNMPB).

Ce protocole n’implique pas d’expériences sur des animaux vivants. Expériences portant sur l’euthanasie des animaux pour prélever des échantillons de cerveau ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T 10/30.
Remarque : Pour ce protocole, 3 souris C57BL/6 mâles adultes ont été utilisées.
1. préparation de l’échantillon
<ol><li>Préparer le fix...

<ol>
	<li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types.">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).</li><li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain.">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li><li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms.">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity.">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li><li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse.">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data.">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li><li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve.">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins.">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li><li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+p38:+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells.">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li><li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicular+GABA+transporter,+VGAT,+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons.">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic,+Presynaptic,+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex.">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li><li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+:+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95.">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li><li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses.">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li><li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses.">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li><li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. 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C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network:+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence.">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li><li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tprg,+a+gene+predominantly+expressed+in+skin,+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63.">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li><li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation:+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis.">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li><li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses.">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles.">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>K&#246;rber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover.">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li><li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+in+brain+sections:+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons.">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy.">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li><li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy.">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li></ol>

La méthode présentée ici vise à quantifier la distribution d’une protéine d’intérêt par rapport à l’abondance d’une protéine marqueur avec une aire de répartition connue. Immunofluorescence souillant peut montrer une forte variabilité des intensités entre les différentes tranches de coloration. La méthode de quantification décrite ici contourne ce problème en déterminant la proportion de la protéine d’intérêt à la moyenne dans l’ensemble de l’hémisphère. Par conséquent, différentes ...

Communication entre les neurones se passe à des sites de contact spécialisées appelées synapses. Synapses contiennent une multitude de différentes protéines qui orchestrent la transmission synaptique. Certaines de ces protéines présentent une distribution hétérogène dans le système nerveux et ne sont pas présents dans chaque synapse1. Un exemple d’une telle protéine est Munc13, qui est impliqué dans le processus d’amorçage de vésicules synaptiques. Il existe différentes isoformes de Munc13, qui sont hétérogène dans tout le cerveau2, et la présence ou l’absence des isoformes spécifiques peut influer sur la plasticité synaptique à court terme et la vésicule synaptique dynamique3, 4 , 5. par conséquent, il est d’une importance vitale pour pouvoir identifier la présence de différentes protéines synaptiques dans certaines zones du cerveau.
Les méthodes de choix pour la quantification des protéines synaptiques - jusqu'à présent - sont la spectrométrie de masse et de Western Blot, plutôt que d’immunohistochimie6,7,8,9. Dans certains cas, plusieurs méthodes sont utilisées pour se compléter mutuellement afin d’évaluer la quantité et la localisation des protéines spécifiques (p. ex., Wilhelm et al. 10). la méthode que nous décrivons ici permet la localisation et quantification des protéines d’intérêt sans avoir besoin d’utiliser toute méthode biochimique, employant simplement les salissures par immunofluorescence. Un autre avantage ici est que la quantification peut être faite sur des zones beaucoup plus petites et, donc, plus précise, que ceux réalisés par d’autres méthodes. Cependant, il faut prendre en considération qu’une protéine de référence fiable est nécessaire pour évaluer la distribution de la protéine d’intérêt.
Une coloration fluorescente par immunohistochimie permet d’identifier systématiquement la localisation des protéines dans certaines zones du cerveau ainsi que dans différents compartiments neuronales. Pour identifier les différents compartiments, marqueurs spécifiques sont utilisés. En général, anticorps contre synapsine et synaptophysine11 peuvent être utilisés pour étiqueter des vésicules synaptiques, tandis que les anticorps contre basson étiqueter la zone active d’un présynaptique borne12. Transporteurs vésiculaires, tels que les transporteurs de glutamate vésiculaire (vGluT) ou le transporteur vésiculaire de GABA (vGAT), sont utilisés pour étiqueter les excitateurs13 et inhibitrice14 terminaisons présynaptiques, respectivement. Côté postsynaptique, anticorps dirigés contre la protéine Homer peuvent être utilisées pour marquer les bornes postsynaptiques et anticorps contre densité postsynaptique protéine 95 (PSD95)15,16,17 ou gephyrin18 , 19 , 20 peut marquer les bornes postsynaptiques excitateurs ou inhibiteurs, respectivement. En utilisant des anticorps contre une protéine d’intérêt et de marqueurs tels que ceux décrits ci-dessus, on peut déterminer la localisation de cette protéine. De nombreuses études à ce jour l’ont fait dans une manière qualitative21. Toutefois, pour déterminer de manière fiable la distribution différentielle d’une protéine synaptique spécifique, il faut non seulement déterminer sa présence ou absence, mais aussi sa concentration relative. L’hétérogénéité de la taille et la densité des synapses rendent important d’établir un rapport entre le marqueur synaptique et la protéine d’intérêt. Dans le cas contraire, les régions riches en synapse tels que les couches non pyramidaux de l’hippocampe et la couche moléculaire du cervelet montrera une densité élevée de protéines synaptiques, uniquement en raison de la densité plus élevée des synapses mais pas en raison d’une forte présence de cette protéine dans chaque synapse (p. ex., Wallrafen et Dresbach1). En revanche, les protéines dans le soma neuronal (par exemple, TGN3822) affichera généralement forte présence dans la couche de cellules pyramidales hippocampe ou la couche de cellules hippocampiques ou cérébelleux granule en raison de la forte concentration de corps des cellules neuronales dans ces domaines. Par conséquent, cette répartition non homogène des structures, synapses dans ce cas, peut conduire à une fausse estimation de la distribution de la protéine d’intérêt elle-même. En outre, il y a une variabilité intrinsèque en intensités de coloration dans les trois échantillons de salissures immunohistochimiques. Le protocole décrit ici tienne compte de cela et évite ces préjugés, mais aussi autres avertissements résultant de méthodes immunohistochimiques.
Dans notre récente étude, nous avons utilisé cette méthode pour décrire l’expression différentielle de Mover (également appelée TPRGL23 SVAP3024) l’ensemble 16 cerveau différents domaines1. Mover est une protéine synaptique vertébré spécifiques qui se trouvent en association à des vésicules synaptiques et influence la neurotransmetteur dégagement25,26,27. Nous avons lié l’expression Mover à l’abondance des vésicules synaptiques, par coloration pour synaptophysine comme un repère de vésicules synaptiques. Nous avons trouvé des niveaux élevés de Mover en particulier dans les noyaux septums, le pallidum ventral et l’amygdale. Dans l’hippocampe, nous trouvons une répartition hétérogène des Mover, avec des niveaux élevés dans les couches associées calcul intra-hippocampique et faibles concentrations dans les couches d’entrée et de sortie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="737">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:187px;">30120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 087721H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">plastic pipette (disposable)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="right">861,176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1000 mL pipette</td>
			<td style="width:167px;">Rainin</td>
			<td style="width:187px;">&#160;17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2 ml pipette</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td align="right">3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menzel microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10144633CF</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (10X)</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P6148-1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue Tek</td>
			<td>Sakura&#160;</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,063,460,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S26-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">rabbit anti-Mover</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_10804285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guinea pig anti-Synaptophysin</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_1210382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">donkey anti-rabbit AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2492288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2337438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mowiol4-88</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ZEN2 blue software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscopy software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FIJI</td>
			<td style="width:167px;">ImageJ</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence

La présence, l’absence ou niveaux de protéines synaptiques spécifiques peuvent influencer considérablement la transmission synaptique. En plus d’élucider la fonction d’une protéine, il faut également déterminer sa diffusion. Nous décrivons ici un protocole utilisant l’immunofluorescence, microscopie confocale et l’analyse assistée par ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique Mover (également appelé TPRGL ou SVAP30). On compare la distribution de Mover à celui de la vésicule synaptique protéine synaptophysine, déterminant ainsi la distribution de Mover de manière quantitative par rapport à l’abondance des vésicules synaptiques. Notamment, cette méthode pourrait potentiellement être mises en œuvre pour permettre une comparaison de la distribution des protéines à l’aide d’anticorps différents ou microscopes ou à travers différentes études. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des salissures par immunofluorescence en cédant un rapport plutôt que des niveaux de fluorescence absolue. En outre, la méthode que nous décrivons permet au chercheur d’analyser la distribution d’une protéine à différents niveaux : des tranches de cerveau entier de régions du cerveau dans différentes sous-régions dans la zone d’un cerveau, telles que les différentes couches de l’hippocampe ou sensorielles cortex. Mover est une protéine spécifique vertébré associé de vésicules synaptiques. Avec cette méthode, nous montrons que le déménageur est hétérogène dans les zones du cerveau, avec des concentrations élevées dans le pallidum ventral, les noyaux septums et l’amygdale et aussi dans les zones du cerveau unique, telles que les différentes couches de l’hippocampe.

Représentant de modèles de différents marqueurs de coloration peut être vu dans la Figure 1. Le modèle varie en fonction de la répartition de la protéine. Exemples de cinq niveaux rostro-caudal sont indiqués dans les colonnes (A)-(E). Une souillure de DAPI représentatif est montrée dans la première rangée : DAPI adhère à l’ADN d’une cellule et donc les noyaux sont colorés. Il en résulte un motif ponctué....

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Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Ici nous décrivons un protocole employant l’immunofluorescence, la microscopie confoccale, et l’analyse basée sur ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique par rapport à une protéine de référence. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des taches d’immunofluorescence en utilisant un ratio plutôt que des niveaux absolus de fluorescence. En outre, avec cette méthode, vous pouvez analyser l’hétérogénéité de la distribution des protéines à différents niveaux.Des tranches entières du cerveau aux régions du cerveau, en en plus des sous-régions comme les différentes couches de l’hippocampe. Cette technique peut être adaptée pour déterminer la distribution des protéines dans différents tissus autres que le cerveau et les systèmes modèles autres que les souris. Commencez par laver le cerveau de souris précédemment isolé et fixe tel que décrit dans le manuscrit.Puis transférer le cerveau à un tube de réaction de 15 millilitres avec 30% saccharose 0,1 molar PB. Pour cryo protéger le cerveau l’incuber à 4 degrés Celsius pendant 48 heures ou jusqu’à ce qu’il coule. Après cela, utilisez une lame tranchante pour couper le cerveau cryo protégé en fonction de la zone d’intérêt. Ensuite, placez le cerveau dans un moule cryo et ajouter optimal composé de température de coupe pour l’intégrer en s’assurant d’éviter les bulles et orienter le cerveau correctement afin d’avoir un plan coronal de coupe.Placez le moule cryo dans le congélateur de moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit gelé solide. Monter le tissu congelé sur la microtome cryo et attendre au moins 15 minutes avant la section pour l’équilibrer à la température de microtome. Commencez à couper le cerveau en 25 micromètres de tranches coronal épaisses.Utilisez soigneusement un crochet en verre à l’OCT de la première tranche sans toucher le tissu cérébral. L’OCT collera au crochet en verre. Utilisez le crochet en verre pour transférer la tranche du cerveau dans le premier puits.Recueillir trois tranches adjacentes par puits dans une assiette de 24 puits remplie de 0,1 molaire PB. Conserver les tranches à quatre degrés Celsius jusqu’à coloration jusqu’à deux semaines. Pour préparer les tranches pour la coloration immuno utiliser un pipet en plastique pour enlever la solution PB d’un puits sans dessiner dans les tranches du cerveau. Ensuite, utilisez un pipet de 1000 micro litres pour ajouter 250 microlitres de PB frais pour les laver de l’excès d’OCT.Répétez ce lavage pour chaque puits à la fois pour éviter de sécher les tranches. Ensuite, utilisez un tuyau en plastique pour enlever la solution PB du premier puits. Utilisez un pipet de 1000 microlitres pour ajouter 250 microlitres de tampon de blocage par puits qui fonctionne bien à nouveau.Incuber la plaque à température ambiante sur un shaker pendant trois heures. Pendant l’incubation ajouter 250 microlitres de tampon anticorps par puits à un tube de réaction. Ensuite, utilisez un pipet de 2 microlitres pour ajouter la quantité appropriée d’anticorps pipetting directement dans la solution et doucement pipet de haut en bas à plusieurs reprises pour mélanger.Puis vortex cet anticorps dilué pour ne pas assurer un bon mélange. Bien fonctionner en enlevant bien le tampon de blocage avec un tuyau en plastique et ajouter 250 microlitres de solution d’anticorps primaire par puits. Incuber la plaque sur un shaker à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, retirez la solution d’anticorps à l’avec un pipet en plastique. Laver les tranches avec 300 microlitres de tampon de lavage un par puits trois fois dix minutes chacun laver sur un shaker à température ambiante. Pendant le lavage, en travaillant dans l’obscurité, diluer le fluor pendant quelques secondes anticorps dans un tube de réaction de la même manière que précédemment fait avec l’anticorps primaire.Après avoir terminé le lavage enlever le tampon de lavage avec un pipet en plastique et ajouter 250 microlitres de solution d’anticorps secondaire par puits. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 90 minutes. Après l’incubation terminée enlever la solution anticorps avec un pipet en plastique.Lavez les sections trois fois avec le tampon de lavage deux de la même manière qu’avec le tampon de lavage un. Au cours de ce lavage diluer la tache DAPI dans 0,1 molaire PB pour atteindre une concentration d’un à 2000. Après avoir retiré le tampon de lavage de la plaque ajouter 250 microlitres de solution DAPI et incuber à température ambiante sur le shaker pendant 5 minutes.Après avoir enlevé la solution DAPI avec un pipet en plastique utiliser un pipet de 1000 microlitres pour ajouter 500 microlitres de 0,1 molaire PB par puits. Placez une lame de microscope sous un stéréoscope. Utilisez une brosse fine pour ajouter trois gouttes distinctes de 0,1 molaire PB sur la lame.À l’aide de la brosse, déposer une tranche par goutte sur la lame, puis aplatir et orienter les tranches. Après que toutes les tranches sont placées correctement utiliser un tissu de papier pour enlever l’excès de PB et sécher soigneusement sans sécher les tranches complètement. Ajouter ensuite 80 microlitres de milieu d’intégration sur la glissière et la couvrir soigneusement d’un glissement de couverture pour intégrer les tranches de cerveau.Couvrez les glissières pour éviter l’exposition à la lumière et laissez-les sécher dans le capot des vapeurs pendant une à deux heures, puis rangez-les dans une boîte de diapositives au microscope à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la microscopie confoccale. Après avoir acquis des tissus virtuels de la tranche entière du cerveau pour différents canaux tels que décrits dans le manuscrit charger tous les canaux simples ou une image dans FIDJI en cliquant sur fichier, puis ouvrir. Utilisez ensuite l’outil de sélection des mains libres pour délimité un hémisphère dans le canal DAPI.Cliquez sur modifier, puis sélectionner, puis créer un masque pour créer un masque de la région sélectionnée. Cliquez ensuite sur analyser puis mesurez les particules pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux simples. S’assurer de sélectionner des canaux simples pour déterminer les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence pour chaque canal.Après cela, copiez l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux simples dans une feuille de calcul. Déterminer l’intensité moyenne de fluorescence pour les canaux simples dans une zone d’intérêt délimité la zone avec l’outil de sélection des mains libres. Après coloration avec DAPI qui taches sections du cerveau noyaux ont un modèle punctate et les régions à haute densité cellulaire sont plus lumineux que les régions à faible densité cellulaire.La coloration avec l’anticorps mover a indiqué la distribution hétérogène avec les secteurs chauds lumineux et les secteurs de gradateur dans tout le cerveau où synaptophysin a indiqué la distribution plus homogène. Une superposition d’images a montré la distribution différentielle de fluorescence rouge indiquant la protéine Mover comparé la fluorescence verte indiquant synaptophysine. Après analyse de quantification, les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence pour différents canaux à travers les hémisphères et à travers les zones d’intérêt ont été déterminées pour Mover et Synaptophysin.Les ratios des valeurs de fluorescence du déménageur par rapport aux valeurs de fluorescence synaptophysine montrent la distribution hétérogène de Mover avec des zones de niveaux de mover élevés et faibles par rapport aux vésicules synaptiques. L’abondance relative de Mover le rapport dans une zone d’intérêt par rapport à celle de l’hémisphère et traduit en un pourcentage a montré combien Mover est présent dans une zone d’intérêt par rapport à la moyenne. L’abondance relative de Mover a été déterminée pour différentes couches dans les sous-champs de l’hippocampe.Les trois régions d’intérêt sont quantifiées en comparant le rapport entre les couches respectives et le rapport de l’hémisphère correspondant. Cette procédure peut facilement être adaptée et combinée avec différentes techniques d’imagerie telles que la microscopie à super résolution pour déterminer en outre la distribution sous cellulaire de la protéine d’intérêt. Cette technique peut également être appliquée à différents systèmes modèles tels que les animaux génétiquement modifiés ou traités par drogue.Cela peut permettre une approche comparative entre différentes conditions expérimentales ou même des espèces.

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