Name: quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

私たちは優れたテクニカル サポート サポート ヴァイスシュヴァルツを感謝します。著者は、エルメスの Pofantis と Andoniya Petkova によるサポートを認めます。著者は、LSM800 と技術援助、特に博士ニルス Halbsgut の使用のための欧州の神経科学研究所もありがとうございました。この仕事は大学医療センター ゲッティンゲンで賄われていた。JSV は、顕微鏡によるナノスケールの分子生理学の脳 (CNMPB) センターでサポートを認めています。

このプロトコルは、生きている動物実験を行いません。脳サンプルを入手するために動物の安楽死させる実験は、承認番号 T 10/30 の下でローカル動物保護当局 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin ゲッティンゲン) によって承認されました。
注: このプロトコルの 3 の成人男性 c57bl/6 マウスが使用されました。
1. サンプル準備
<ol><li>定着剤および 0.1 M...

<ol>
	<li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types.">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).</li><li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain.">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li><li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms.">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity.">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li><li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse.">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data.">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li><li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve.">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li><li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins.">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li><li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+p38:+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells.">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li><li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone.">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li><li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus.">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li><li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicular+GABA+transporter,+VGAT,+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons.">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic,+Presynaptic,+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex.">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li><li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+:+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95.">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li><li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses.">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li><li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses.">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li><li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li><li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus.">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li><li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network:+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence.">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li><li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tprg,+a+gene+predominantly+expressed+in+skin,+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63.">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li><li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation:+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis.">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li><li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses.">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles.">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>K&#246;rber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover.">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li><li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+in+brain+sections:+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons.">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy.">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li><li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy.">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li></ol>

メソッドは、既知の分布とマーカー蛋白質の豊かさに対する興味の蛋白質の分布の定量化を目指すを紹介しました。免疫蛍光染色染色強度の異なるスライスの間の高い可変性を示すことができます。ここで説明した定量化手法半球間なかに興味の蛋白質の比率を決定することによってこの問題を回避できます。したがって、スライス全体染色強度の違いキャンセルされ、定量的な説明を可能?...

ニューロン間の通信は、シナプスと呼ばれる特殊な接触部位で発生します。シナプスには、無数組み合わせによって、シナプス伝達の異なった蛋白質にはが含まれています。それらの蛋白質のいくつかは神経系全体の不均質分布を示しシナプス1には存在しません。そのような蛋白質のための 1 つの例は Munc13 は、シナプス小胞のプライミング プロセスに関与しています。2脳全体に分散不均一、Munc13 の異なるアイソ フォームがあるし、特定のアイソ フォームの存在の有無に影響を与える短期シナプスとシナプス小胞ダイナミクス3,4,5します。 したがって、極めて重要な脳の領域間で異なるシナプス蛋白質の存在を識別することができるためです。
シナプス蛋白質の - 今のところ - 定量化のための選択の方法は、質量分析法とウエスタンブロットというよりも、免疫組織化学6,7,8,9。量と (すなわち、ヴィルヘルムら特定の蛋白質の局在化の両方を評価するためにお互いを補完するためにいくつかのケースでいくつかのメソッドを使用します。10). ここで述べる手法によりローカリゼーションと単に蛍光染色を用いて、生化学的方法を使用を必要とせず興味の蛋白質の定量。ここでもう一つの利点は小さい領域上の定量化を行うことができ、したがって、それらよりも、具体的、他の方法で達成します。ただし、信頼性の高いリファレンス タンパク質が興味の蛋白質の分布を評価するために必要なことを考慮する必要があります。
免疫組織化学的蛍光染色異なる神経細胞コンパートメント内にあるだけでなく、脳の領域にわたって日常的にタンパク質の局在を識別することができます。別のコンパートメントを識別するために特定のマーカーが使用されます。通常、synapsin、シナプトフィジン11に対する抗体はファゴット抗体ラベル シナプス前ターミナル12のアクティブ ゾーン間シナプス小胞のラベルに使用できます。小胞性の GABA トランスポーター vgat (ノックアウト)、小胞グルタミン酸トランスポーター (vGluT) などの小胞輸送は、それぞれ興奮13と14抑制シナプス前ターミナルをラベルに使用されます。シナプス後側、シナプス ターミナルとシナプス後密度タンパク質 95 (PSD95)15,16,17または gephyrin18に対する抗体をマークするホーマー タンパク質に対する抗体を用いることができます。,19,興奮性、抑制性シナプス ターミナルにそれぞれラベル20を使用できます。関心と上述のものなどのマーカー蛋白質に対する抗体を使用して、このようなタンパク質の局在を決定できます。これまで多くの研究は、質的方法21でこれを行っています。ただし、特定のシナプス蛋白質の特異的分布を確実に判断するには、いずれかの必要がありますのみ決定その存在または不在だけでなく、その相対濃度。サイズの不均一性と密度シナプスのシナプス マーカーと興味の蛋白質の比率を確立することが重要になります。海馬の非錐体層、小脳分子層などのシナプスの豊富な地域がシナプス蛋白質、その蛋白の強い存在のためにないが、シナプスの密度が高いためだけの高密度が表示されますそれ以外の場合、それぞれのシナプスは (例えば、Wallrafen および Dresbach の1)。(例えば、TGN3822) 神経細胞体でタンパク質、海馬錐体細胞層や神経細胞の細胞体の高濃度のため海馬や小脳顆粒細胞層で強力なプレゼンスを通常表示する一方、それらの領域。したがって、構造、この非均一に分布はこの場合、シナプス、自体興味の蛋白質の分布の偽の推定につながることができます。さらに、免疫組織化学的染色のサンプル間で強度を染色に本質的な可変性があります。ここで説明されているプロトコルはこれを考慮し、免疫組織化学的方法から生じるその他の注意事項と同様に、そのようなバイアスを回避できます。
私たちの最近の研究は、我々 は 16 異なる脳領域1にわたって Mover (TPRGL23または SVAP3024とも呼ばれます) の差分式を記述するこのメソッドを使用しています。発動機は脊椎動物に固有のシナプス蛋白質シナプス小胞との関連で見つけることができますし、神経伝達物質のリリース25,26,27に影響を与えます。シナプス小胞の豊かさに発動機式シナプス小胞参照マーカーとしてシナプトフィジンの染色関連ている。特に中隔核, 腹側フトゲツツガムシと扁桃体に発動機の高レベルを見つけた。海馬はわかった海馬内計算と入力と出力層の低レベルに関連付けられているレイヤーのレベルが高い、Mover の不均質分布

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="737">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:187px;">30120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 087721H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">plastic pipette (disposable)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="right">861,176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1000 mL pipette</td>
			<td style="width:167px;">Rainin</td>
			<td style="width:187px;">&#160;17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2 ml pipette</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td align="right">3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menzel microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10144633CF</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (10X)</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P6148-1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue Tek</td>
			<td>Sakura&#160;</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,063,460,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S26-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">rabbit anti-Mover</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_10804285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guinea pig anti-Synaptophysin</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_1210382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">donkey anti-rabbit AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2492288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2337438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mowiol4-88</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ZEN2 blue software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscopy software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FIJI</td>
			<td style="width:167px;">ImageJ</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence

有無または特定のシナプス蛋白質のレベル、重度なシナプス伝達に影響を与えます。蛋白質の機能を解明、に加えてまたその分布を決定することが重要です。ここでは、蛍光抗体法、共焦点顕微鏡、シナプス蛋白質 (TPRGL または SVAP30 とも呼ばれます) の発動機の分布を決定するためのコンピュータ ベース解析を用いたプロトコルについて述べる.我々 はシナプス小胞の豊かさに対する定量的方法で発動機の分布の決定によりシナプス小胞タンパク質シナプトフィジンの発動機の分布を比較します。特に、このメソッドは、異なる研究内または異なる抗体または顕微鏡を用いたタンパク質の分布の比較を許可する実装潜在的可能性があります。本手法は、絶対蛍光レベルではなく、比率を生成することによって蛍光染色の固有の変動を回避できます。また、述べるメソッドにより、さまざまなレベルでのタンパク質の分布を分析する研究者: 海馬のまたは感覚の異なるレイヤーなどの一つの脳領域で異なるサブ領域に脳を全脳スライスから野。Mover は、シナプス小胞に関連付けられている脊椎動物に固有のタンパク質です。この方法では、頭脳区域、扁桃体、中隔核、腹側フトゲツツガムシとまた海馬の異なる層などの単一の脳領域内で高レベルの分散不均一の発動機を紹介します。

染色パターンの別のマーカーの代表は、図 1に見ることができます。パターンは、タンパク質の分布に応じて異なります。5 つの吻尾側レベルの例の列 (A)-(E)。最初の行に示すように、代表的な DAPI 染色: DAPI は細胞の DNA に付着し、従って核が染色します。点状のパターンでこの結果します。高細胞密度の領域は、低細胞...

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Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

ここでは、蛍光染色を使用してマーカー蛋白質、共焦点顕微鏡、コンピューターによる解析を基準にしてシナプス蛋白質の分布を決定する定量的アプローチについて述べる。

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

ここでは、免疫蛍光、共焦点顕微鏡、およびコンピュータベースの分析を用いて、参照タンパク質に対するシナプスタンパク質の分布を決定するプロトコルについて説明する。我々の方法は、絶対蛍光レベルではなく比を用いて免疫蛍光染色の固有の変動性を回避する。さらに、この方法を使用すると、異なるレベルでのタンパク質分布の不均一性を分析することができます。脳全体のスライスから脳領域、海馬の異なる層などのサブ領域まで。この技術は、マウス以外の脳およびモデル系以外の異なる組織におけるタンパク質分布を決定するために適応することができる。原稿に記載されているように、以前に単離された固定されたマウス脳を洗浄することから始めます。その後、脳を30%スクロース0.1モルPBで15ミリリットル反応チューブに移します。クライオは、脳を48時間、または沈むまで摂氏4度でインキュベートします。その後、関心のある領域に応じてクライオ保護脳をトリミングするために鋭い刃を使用します。その後、クライオ型に脳を配置し、それを埋め込むために最適な切断温度化合物を追加し、泡を避け、切断のコロナ平面を持つように脳を適切に向けます。氷結型をマイナス80°Cの冷凍庫に入れ、固形物を凍らせるまで置きます。凍結した組織をクライオミクロトームに取り付け、セクションの少なくとも15分前に待ってミクロトーム温度に平衡化します。25マイクロメートルの厚いコロナスライスに脳を切断し始めます。脳組織に触れることなく、慎重に最初のスライスのOCTにガラスフックを使用してください。OCT はガラスフックにくっつきます。最初の井戸に脳のスライスを転送するためにガラスフックを使用してください。0.1モルPBで満たされた24ウェルプレートにウェルあたり3つの隣接スライスを収集します。スライスは最大2週間染色されるまで摂氏4度で保管します。免疫染色のためのスライスを準備するには、脳スライスに描画することなく、1つの井戸からPB溶液を除去するためにプラスチックピペットを使用しています。その後、1000マイクロリットルのピペットを使用して、250マイクロリットルの新鮮なPBを追加して、余分なOCTを洗浄します。スライスを乾燥させないように、その時に井戸ごとにこの洗浄を繰り返します。次に、プラスチック製のピペットを使用して、PB溶液を第1のウェルから除去します。1000マイクロリットルのピッドを使用して、よく働く井戸あたり250マイクロリットルのブロッキングバッファを再びうまく働かします。シェーカーの室温でプレートを3時間インキュベートします。インキュベーション中に、反応管に1ウェルあたり250マイクロリットルの抗体バッファーを加える。次に、2マイクロリットルのピペットを使用して、適切な量の抗体を溶液に直接ピペット化し、数回軽く上下にピペットして混合します。次に、この希釈抗体をボルテックスして適切な混合を確認できない。プラスチック製のピペットでブロッキングバッファーをうまく取り除き、井戸当たり250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えます。一晩で摂氏4度でシェーカーにプレートをインキュベートします。翌日、プラスチック製のピペットで抗体溶液を除去します。300マイクロリットルの洗浄バッファーを1ウェルあたり1回1回洗浄し、各1回10分間を室温でシェーカーで洗浄します。洗浄中、暗闇で働き、蛍光体を反応管内で2番目の抗体に対して、一次抗体と同じ方法で希釈する。洗浄が完了した後、プラスチックピペットで洗浄バッファーを除去し、ウェルあたり250マイクロリットルの二次抗体溶液を添加する。室温で暗闇の中で90分間インキュベートします。完成後、プラスチックピペットで抗体溶液を除去します。洗浄バッファー1と同じ方法で洗浄バッファー2でセクションを3回洗浄します。この洗浄の間に希釈DAPIは0.1モルPBで、1〜2000濃度を達成した。プレートから洗浄バッファーを取り出した後、250マイクロリットルのDAPI溶液を加え、シェーカー上の室温で5分間インキュベートする。プラスチックピペットでDAPI溶液を除去した後、1000マイクロリットルのピッドを使用して、1ウェルあたり0.1モルPBの500マイクロリットルを追加します。顕微鏡スライドをステレオスコープの下に置きます。細かいブラシを使用して、スライドに0.1モルPBの3つの別々の滴を追加します。ブラシを使用すると、スライド上のドロップごとに1つのスライスを配置し、スライスを平らにして方向を付けます。すべてのスライスが正しく配置された後、紙のティッシュを使用して余分なPBを除去し、スライスを完全に乾燥させることなく慎重に乾燥させます。その後、スライドに埋め込み培地の80マイクロリットルを追加し、慎重に脳のスライスを埋め込むためにカバースリップでそれをカバーします。スライドを覆って光の露出を避け、煙のフードで1〜2時間乾燥させ、共焦点顕微鏡の準備ができるまで4°Cの顕微鏡スライドボックスに保管します。原稿に記載されているように異なるチャネルのための全体の脳スライスの仮想組織を取得した後、ファイルをクリックしてフィジーにすべての単一のチャンネルまたは1つの画像をロードし、その後開きます。次に、自由な手の選択ツールを使用して、DAPI チャネル内の 1 つの半球を線分化します。編集をクリックしてから選択し、マスクを作成して、選択した領域のマスクを作成します。次に、分析をクリックし、粒子を測定して、単一チャネルの平均蛍光強度を決定します。各チャンネルの平均蛍光強度値を決定するために、単一のチャンネルを選択することを確認します。その後、単一チャネルの平均蛍光強度をスプレッドシートにコピーします。対象領域における単一チャネルの平均蛍光強度を決定するために、フリーハンド選択ツールで領域を線引する。核脳の切片を染色するDAPIで染色した後、細胞密度が低い領域よりも、穿刺パターンと高い細胞密度の領域が明るくなります。Mover抗体による染色は、シナプトフィシンがより均質な分布を明らかにした脳全体の明るいホットスポット領域と調光領域を有する不均一な分布を明らかにした。画像のオーバーレイは、シナプトフィシンを示す緑色蛍光と比較したMoverタンパク質を示す赤色蛍光の差分布を示した。定量分析後、半球および対象領域にわたる異なるチャネルの蛍光強度値が、MoverとSynaptophysinの両方について決定された。シナプトフィシン蛍光値に対する引越し物蛍光値の比率は、シナプス小胞に対する高い、低いMoverレベルの領域を有するMoverの不均一な分布を示す。相対的なMoverの豊富さ半球全体と比較して関心のある1つの領域の比率とパーセンテージに翻訳された割合は、平均に対する1つの関心領域にどれだけのMoverが存在するかを示した。相対的な移動量は、海馬のサブフィールド内の異なる層について決定された。対象となる3つの領域は、それぞれの層の比と対応する半球の比率を比較することによって定量化される。この手順は、簡単に適応し、追加の目的のタンパク質の細胞内分布を決定する追加の超分解能顕微鏡などの異なるイメージング技術と組み合わせることができます。この技術は、遺伝子組み換えや薬物処理動物などの異なるモデルシステムにも適用できます。これにより、異なる実験条件または種間の比較アプローチが可能になります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

の活動の定量化シス</em植片エレクトロポレーションによってマウス網膜で>調節エレメント

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

神経科学

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

マウスの脳の側脳室における上衣繊毛のライブイメージング

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...