Name: quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Vi takker Irmgard Weiss for utmerket kundestøtte. Forfatterne bekrefter støtte av Hermes Pofantis og Andoniya Petkova. Forfatterne takker også europeiske nevrovitenskap Institutt for bruken av LSM800 og teknisk assistanse, spesielt av Dr. Nils Halbsgut. Dette arbeidet ble finansiert av University Medical Center Göttingen. JSV erkjenner støtte av Center for nanoskala mikroskopi og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB).

Denne protokollen involverer ikke eksperimenter på levende dyr. Eksperimenter med euthanizing dyr å få hjernen prøver ble godkjent av lokale Dyrevern myndigheter (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under Valideringsnummeret T 10/30.
Merk: For denne protokollen, 3 voksne mannlige C57BL/6 mus ble brukt.
1. sample forberedelse
<ol><li>Forberede bindemiddel og 0.1 M fosfatbuffer (PB, se tabell 1).</li>
	<li>Fastsette dyret a...

<ol>
	<li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types.">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).</li><li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain.">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li><li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms.">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity.">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li><li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse.">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data.">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li><li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve.">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li><li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins.">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li><li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+p38:+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells.">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li><li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone.">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li><li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus.">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li><li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicular+GABA+transporter,+VGAT,+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons.">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic,+Presynaptic,+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex.">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li><li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+:+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95.">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li><li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses.">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li><li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses.">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li><li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li><li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus.">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li><li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network:+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence.">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li><li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tprg,+a+gene+predominantly+expressed+in+skin,+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63.">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li><li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation:+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis.">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li><li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses.">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles.">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>K&#246;rber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover.">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li><li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+in+brain+sections:+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons.">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy.">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li><li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy.">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li></ol>

Metoden som presenteres her tar sikte på å kvantifisere distribusjon av et protein av interesse i forhold til overflod av en markør protein med en kjent distribusjon. Immunofluorescence flekker kan vise en høy variasjon av flekker intensiteter mellom forskjellige stykker. Kvantifisering tilnærming beskrevet her omgår dette problemet ved å bestemme forholdet mellom protein av interesse for gjennomsnittlige over halvkulen. Derfor ulike flekker intensiteter over skiver er kansellert og la en kvantitativ beskrivelse.<...

Kommunikasjon mellom nerveceller skjer på spesialiserte kontakt områder kalt synapser. Synapser inneholder en rekke ulike proteiner som arrangerer synaptic overføring. Noen av disse proteinene viser en heterogen distribusjon over hele nervesystemet og finnes ikke i hver synapse1. Et eksempel for slik et protein er Munc13, som er involvert i grunning prosessen med synaptic blemmer. Det er ulike isoformene av Munc13, som heterogeneously distribueres gjennom hjernen2, og tilstedeværelse eller fravær av bestemte isoformene kan påvirke kortsiktige synaptiske plastisitet og synaptic vesicle dynamics3, 4 , 5. det er derfor av avgjørende betydning å kunne identifisere tilstedeværelsen av ulike synaptic proteiner over hjernen områder.
Metodene valgfrihet for kvantifisering av synaptic proteiner - så langt - er massespektrometri og Western blotting, snarere enn immunohistochemistry6,7,8,9. I noen tilfeller brukes flere metoder til å utfylle hverandre å vurdere både-antallet og lokalisering av spesifikke proteiner (dvs., Wilhelm et al. 10). metoden som beskrives her gjør at lokalisering og kvantifisering av proteiner rundt uten behov for å bruke noen biokjemiske metode, bare ansette immunofluorescent stainings. En annen fordel her er at kvantifiseringen kan gjøres over områder mye mindre, og derfor mer spesifikk, enn de oppnådd ved andre metoder. Imidlertid må man ta i betraktning at en pålitelig referanse protein er nødvendig å vurdere fordelingen av protein av interesse.
Fluorescerende farging av immunhistokjemi tillater oss å rutinemessig identifisere lokaliseringen av proteiner over hjernen områder og i ulike neuronal avdelinger. For å identifisere de ulike avdelinger, brukes bestemte markører. Vanligvis kan antistoffer mot synapsin og synaptophysin11 brukes til å merke synaptic vabler, mens antistoffer mot fagott etiketten aktive sonen for en presynaptic terminal12. Vesicula transportører, som vesicula glutamat transportører (vGluT) eller vesicula GABA transporter (vGAT), brukes til å merke eksitatoriske13 og hemmende14 presynaptic terminaler, henholdsvis. På postsynaptic side, kan antistoffer mot protein Homer brukes til å merke postsynaptic terminaler og antistoffer mot postsynaptic tetthet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan merke eksitatoriske eller hemmende postsynaptic terminaler, henholdsvis. Ved hjelp av antistoffer mot et protein av interesse og markører som de som er beskrevet ovenfor, kan en avgjøre lokaliseringen av slike protein. Mange studier hittil har gjort dette i en kvalitativ måte21. Imidlertid å pålitelig bestemme differensial fordelingen av en bestemt synaptic protein, må en ikke bare finne sin tilstedeværelse eller fravær, men også sin relative konsentrasjon. Heterogenitet størrelser og tetthet av synapser gjør det viktig å etablere et forhold mellom synaptic markøren og protein av interesse. Ellers viser synapse-rike regioner som ikke-pyramideformet lag av hippocampus og molekylære laget av lillehjernen en høy tetthet av synaptic proteiner, bare på grunn av høyere tettheten av synapser, men ikke på grunn av en sterk tilstedeværelse av dette proteinet i hver synapse (f.eks, Wallrafen og Dresbach1). På den annen side, viser proteiner i neuronal soma (f.eks, TGN3822) vanligvis sterk tilstedeværelse i hippocampus pyramideformet celle laget eller hippocampus eller lillehjernen granule celle lag på grunn av den høye konsentrasjonen av neuronal cellen legemer i disse områdene. Derfor denne ikke-homogene fordelingen av strukturer, i dette tilfellet synapser, kan føre til en falsk estimering av fordelingen av protein rundt seg. Videre er det en iboende variasjon i flekker intensiteter over prøvene i immunohistochemical stainings. Protokollen beskrevet her tar dette i betraktning, og unngår slike fordommer, samt andre advarsler som oppstår fra immunohistochemical metoder.
I vår siste studie, vi har brukt denne metoden for å beskrive differensial uttrykk for Mover (også kalt TPRGL23 eller SVAP3024) over 16 forskjellige hjernen områder1. Mover er en virveldyr-spesifikke synaptic protein som finnes i tilknytning til synaptic blemmer og påvirker nevrotransmitter utgivelsen25,26,27. Vi har knyttet Mover uttrykket til overflod av synaptic blemmer, av flekker for synaptophysin som en synaptic vesicle referanse markør. Vi fant høye nivåer av Mover spesielt i septal kjerner og det ventrale pallidum amygdala. I hippocampus fant vi en heterogen fordeling av Mover, med høy i lagene knyttet intra-hippocampus beregning og lave nivåer i inn- og utgang lag.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="737">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:187px;">30120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 087721H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">plastic pipette (disposable)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="right">861,176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1000 mL pipette</td>
			<td style="width:167px;">Rainin</td>
			<td style="width:187px;">&#160;17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2 ml pipette</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td align="right">3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menzel microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10144633CF</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (10X)</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P6148-1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue Tek</td>
			<td>Sakura&#160;</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,063,460,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S26-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">rabbit anti-Mover</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_10804285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guinea pig anti-Synaptophysin</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_1210382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">donkey anti-rabbit AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2492288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2337438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mowiol4-88</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ZEN2 blue software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscopy software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FIJI</td>
			<td style="width:167px;">ImageJ</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence

Tilstedeværelse, fravær eller nivåer av bestemte synaptic proteinene kan alvorlig påvirke synaptic overføring. I tillegg til Klargjørende funksjonen av et protein, er det viktig å også bestemme distribusjon. Her beskriver vi en protokoll ansette immunofluorescence AC confocal mikroskopi og datamaskin analyse til fordelingen av synaptic protein Mover (også kalt TPRGL eller SVAP30). Vi sammenligne distribusjonen av Mover som i synaptic vesicle protein synaptophysin, dermed å finne fordelingen av Mover på en kvantitativ måte i forhold til overflod av synaptic blemmer. Spesielt kan denne metoden potensielt implementeres for å tillate sammenligning av fordelingen av proteiner med forskjellige antistoffer eller mikroskop eller på tvers av ulike studier. Vår metoden omgår iboende variasjon av immunofluorescent stainings av gir forholdet i stedet for absolutte fluorescens nivåer. I tillegg metoden vi beskrive gjør forskeren analysere fordelingen av et protein på ulike nivåer: fra hele hjernen sektorene til hjernen regioner til forskjellige delområder i én hjerne område, for eksempel de forskjellige lagene av hippocampus eller sensorisk halvdelene. Mover er et virveldyr-spesifikke protein som er forbundet med synaptic blemmer. Med denne metoden viser vi at Mover heterogeneously er distribuert over hjernen områder, med høy det ventrale pallidum septal kjerner og amygdala, og også innen enkelt hjernen, som forskjellige lag av hippocampus.

Representant flekker mønstre av forskjellige merkene kan ses i figur 1. Mønsteret varierer avhengig av distribusjon av protein. Eksempler på fem rostro-caudal nivåer vises i kolonnene (A)-(E). En representant DAPI flekker vises i første rad: DAPI overholder DNA av en celle og dermed kjerner er farget. Dette resulterer i et vises punctate mønster. Områder med en høyt tetthet er lysere enn områder med lav celle tetthet...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Her beskriver vi en kvantitativ tilnærming til å fastslå fordelingen av et synaptic protein i forhold til en markør protein bruker immunofluorescence flekker, AC confocal mikroskopi og datamaskin analyse.

Kvantifisere heterogene distribusjon av et Synaptic Protein i musen hjernen ved hjelp av Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Her beskriver vi en protokoll som bruker immunofluorescence, konfokal mikroskopi og databasert analyse for å bestemme fordelingen av synaptisk protein i forhold til et referanseprotein. Vår metode omgår den iboende variasjonen av immunofluorescensfarginger ved å bruke et forhold i stedet for absolutt fluorescensnivåer. I tillegg med denne metoden kan du analysere heterogeniteten av proteinfordeling på forskjellige nivåer.Fra hele hjerneskiver til hjerneregioner til til og med underregioner som de forskjellige lagene i hippocampus. Denne teknikken kan tilpasses for å bestemme proteinfordelingen i annet vev enn hjernen og modellsystemer enn mus. Begynn med å vaske tidligere isolert og fast musehjerne som beskrevet i manuskriptet.Deretter overfører du hjernen til et 15 milliliter reaksjonsrør med 30% sukrose 0,1 molar PB. For å kryo beskytte hjernen inkubere den ved 4 grader celsius i 48 timer eller til den synker. Deretter bruker du et skarpt blad for å trimme den kryobeskyttede hjernen avhengig av interesseområdet. Deretter plasserer du hjernen i en kryoform og legger til Optimal Cutting Temperature Compound for å bygge den inn, og sørg for å unngå bobler og orientere hjernen riktig for å ha et koronarplan med skjæring.Plasser kryoformen i minus 80 grader celsius fryser til den er frosset fast. Monter det frosne vevet på kryomikrotomen og vent i minst 15 minutter før seksjonen for å likevekte det til mikrotomtemperaturen. Begynn å kutte hjernen i 25 mikrometer tykke koronale skiver.Bruk en glasskrok til OKT av den første skiven forsiktig uten å berøre hjernevevet. OCT vil holde seg til glasskroken. Bruk glasskroken til å overføre hjerneskiven til den første brønnen.Samle tre tilstøtende skiver per brønn i en 24 brønnplate fylt med 0,1 molar PB. Oppbevar skivene ved fire grader celsius til farging i opptil to uker. For å forberede skiver for immunofarging, bruk en plastpipet for å fjerne PB-løsningen fra en brønn uten å tegne i hjerneskiver. Bruk deretter en 1000 mikro liter pipet for å legge til 250 mikroliter frisk PB for å vaske dem av overflødig OCT.Gjenta denne vasken for hver brønn på den tiden for å unngå å tørke ut skivene. Bruk deretter en plastpipetter til å fjerne PB-løsningen fra den første brønnen. Bruk en 1000 mikroliter pipet for å legge til 250 mikroliter blokkerer buffer per godt fungerer godt igjen.Inkuber platen ved romtemperatur på en shaker i tre timer. Under inkubasjonen tilsett 250 mikroliter antistoffbuffer per brønn til et reaksjonsrør. Bruk deretter en 2 mikroliter pipet for å legge til riktig mengde antistoffpipettering det direkte inn i løsningen og forsiktig pipet opp og ned flere ganger for å blande.Deretter vortex dette fortynnede antistoffet for å usikker riktig blanding. Fungerer godt ved å fjerne blokkeringsbufferen med en plastpipet og tilsett 250 mikroliter primær antistoffløsning per brønn. Inkuber platen på en shaker ved fire grader celsius over natten.Neste dag fjerner du antistoffoppløsningen med en plastpipetter. Vask skivene med 300 mikroliter vaskebuffer en per brønn tre ganger ti minutter hver vask på en shaker ved romtemperatur. Under vaskingen, som arbeider i mørket, fortynner fluoret i et par andre antistoffer i et reaksjonsrør på samme måte som tidligere gjort med det primære antistoffet.Etter fullført vask fjerne vaskebufferen med en plastpipet og legge til 250 mikroliter sekundær antistoffløsning per brønn. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 90 minutter. Etter fullført inkubasjon fjerne antistoffoppløsningen med en plastpipet.Vask seksjonene tre ganger med vaskebuffer to på samme måte som med vaskebuffer en. Under denne vasken fortynner DAPI flekken i 0,1 molar PB for å oppnå en en til 2000 konsentrasjon. Etter å ha fjernet vaskebufferen fra platen, tilsett 250 mikroliter DAPI-løsning og inkuber ved romtemperatur på shakeren i 5 minutter.Etter å ha fjernet DAPI-løsningen med en plastpipet, bruk en 1000 mikroliter pipet for å legge til 500 mikroliter på 0,1 molar PB per brønn. Plasser et mikroskoplys under et stereoskop. Bruk en fin børste til å legge til tre separate dråper 0,1 molar PB på lysbildet.Bruk børsten til å plassere en skive per dråpe på lysbildet, og deretter flate og orientere skivene. Etter at alle skiver er plassert riktig, bruk et papirvev for å fjerne overflødig PB og tørke forsiktig uten å tørke skivene helt. Tilsett deretter 80 mikroliter med innebyggingsmedium på lysbildet og dekk det forsiktig med en dekselslip for å bygge inn hjerneskiver.Dekk lysbildene for å unngå lyseksponering og la dem tørke i røykhetten i en til to timer og oppbevar dem deretter i en mikroskopsklieboks på fire grader celsius til de er klare for konfokal mikroskopi. Etter å ha kjøpt virtuelle vev av hele hjernen skive for ulike kanaler som beskrevet i manuskriptet laste alle enkelt kanaler eller ett bilde i FIJI ved å klikke på filen og deretter åpne. Bruk deretter verktøyet for fritt valg for hånd til å avgrense en halvkule i DAPI-kanalen.Klikk på rediger, deretter valg, og opprett deretter maske for å opprette en maske for det valgte området. Klikk deretter på analyser og mål deretter partikler for å bestemme gjennomsnittlig fluorescensintensitet for enkeltkanaler. Pass på å velge enkeltkanaler for å bestemme de gjennomsnittlige fluorescensintensitetsverdiene for hver kanal.Deretter kopierer du den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten for enkeltkanalene til et regneark. For å bestemme gjennomsnittlig fluorescensintensitet for enkeltkanalene i et interesseområde, avgrenser du området med det frie håndvalgverktøyet. Etter farging med DAPI som flekker kjerner hjerneseksjoner har et punktat mønster og regioner med høy celle tetthet er lysere enn regioner med lav celle tetthet.Farging med Mover antistoff avslørte heterogen distribusjon med lyse hot spot områder og dimmer områder i hele hjernen der som Synaptophysin avslørte mer homogen distribusjon. Et overlegg av bilder viste differensialfordelingen av rød fluorescens som indikerer Mover protein sammenlignet grønn fluorescens som indikerer Synaptophysin. Etter kvantifiseringsanalyse betyr fluorescensintensitetsverdier for ulike kanaler på tvers av halvkuler og på tvers av interesseområdene er bestemt for både Mover og Synaptophysin.Forholdet mellom mover fluorescensverdier til Synaptophysin fluorescensverdier viser den heterogene fordelingen av Mover med områder med høye og lave Mover-nivåer i forhold til synaptiske vesikler. Relative Mover overflod forholdet i ett område av interesse i forhold til det over halvkule og oversatt til en prosentandel viste hvor mye Mover er til stede i ett interesseområde i forhold til gjennomsnittet. Relativ Mover overflod ble bestemt for ulike lag i sub feltene i hippocampus.De tre områdene av interesse kvantifiseres ved å sammenligne forholdet i de respektive lagene med forholdet mellom den tilsvarende halvkule. Denne prosedyren kan enkelt tilpasses og kombineres med ulike bildeteknikker som super oppløsning mikroskopi for å i tillegg bestemme sub cellulær distribusjon av protein av interesse. Denne teknikken kan også brukes på ulike modellsystemer som genmodifiserte eller medikamentbehandlede dyr.Dette kan tillate en komparativ tilnærming på tvers av ulike eksperimentelle forhold eller til og med arter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementering Dynamic Clamp med Synaptic og kunstig conductances i mus retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live-Imaging av Ependymal Cilia i sideventriklene av Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

En enkel måte å måle endringer i Reward-søkende atferd med<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Kombinere Optogenetics med kunstig microRNAs å karakterisere effekter av Gene Knockdown Presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Kvantifisere Subcellulære Ubiquitin-proteasomet aktivitet i gnager hjernen

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...