Name: quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Agradecemos Irmgard Weiss excelente assistência técnica. Os autores reconhecem apoio por Hermes Pofantis e Andoniya Petkova. Os autores também agradecer o Instituto Europeu de neurociência para o uso do LSM800 e assistência técnica, especialmente pelo Dr. Nils Halbsgut. Este trabalho foi financiado pela Göttingen centro médico da Universidade. JSV reconhece apoio pelo centro de microscopia de escala nanométrica e fisiologia Molecular do cérebro (CNMPB).

Este protocolo não envolve experimentos em animais vivos. Experimentos envolvendo a eutanásia de animais para obter amostras de cérebro foram aprovados pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob o número de aprovação T 10/30.
Nota: Para este protocolo, foram utilizados 3 camundongos C57BL/6 adultos do sexo masculino.
1. preparação da amostra
<ol><li>Prepare o fixador e tampão de fosfato 0,1...

<ol>
	<li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types.">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).</li><li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain.">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li><li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms.">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity.">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li><li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse.">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data.">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li><li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve.">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li><li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins.">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li><li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+p38:+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells.">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li><li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone.">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li><li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus.">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li><li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicular+GABA+transporter,+VGAT,+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons.">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic,+Presynaptic,+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex.">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li><li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+:+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95.">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li><li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses.">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li><li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses.">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li><li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li><li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus.">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li><li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network:+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence.">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li><li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tprg,+a+gene+predominantly+expressed+in+skin,+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63.">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li><li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation:+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis.">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li><li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses.">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles.">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>K&#246;rber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover.">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li><li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+in+brain+sections:+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons.">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy.">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li><li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy.">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li></ol>

O método aqui apresentado tem como objetivo quantificar a distribuição de uma proteína de interesse em relação à abundância de uma proteína do marcador, com uma distribuição conhecida. Mancha da imunofluorescência pode mostrar uma grande variabilidade de coloração intensidades entre diferentes fatias. A abordagem de quantificação descrita aqui contorna este problema, determinando a proporção da proteína de interesse para a média em todo o hemisfério. Portanto, diferentes intensidades de coloração e...

Comunicação entre os neurônios acontece em sites especializados de contato chamados sinapses. Sinapses contêm uma miríade de diferentes proteínas que orquestrar a transmissão sináptica. Algumas dessas proteínas mostram uma distribuição heterogênea em todo o sistema nervoso e não estão presentes em cada sinapse1. Um exemplo de tal uma proteína é Munc13, que está envolvida no processo de preparação das vesículas sinápticas. Existem diferentes isoformas de Munc13, que são distribuídas de forma heterogénea ao longo do cérebro2, e a presença ou ausência de isoformas específicas pode influenciar a curto prazo plasticidade sináptica e vesícula sináptica dinâmica3, 4 , 5. portanto, é de vital importância para ser capaz de identificar a presença de diferentes proteínas sinápticas em todas as áreas do cérebro.
Os métodos de escolha para quantificação de proteínas sinápticas - até agora - são espectrometria de massa e mancha ocidental, ao invés de immunohistochemistry6,7,8,9. Em alguns casos, vários métodos são usados para se complementam para avaliar tanto a quantidade e a localização de proteínas específicas (ou seja, Wilhelm et al . 10). o método descrevemos aqui permite a localização e quantificação de proteínas de interesse sem a necessidade de usar qualquer método bioquímico, simplesmente empregando colorações de imunofluorescência. Outra vantagem aqui é que a quantificação pode ser feita sobre áreas muito menores e, portanto, mais específicos, do que aqueles obtidos por outros métodos. No entanto, é preciso levar em consideração que uma proteína de referência confiável é necessária para avaliar a distribuição da proteína de interesse.
Coloração fluorescente por imuno-histoquímica permite identificar rotineiramente a localização de proteínas em todas as áreas do cérebro, bem como no âmbito de diferentes compartimentos neuronais. Para identificar os diferentes compartimentos, marcadores específicos são utilizados. Normalmente, os anticorpos contra synapsin e Sinaptofisina11 podem ser usados para rotular vesículas sinápticas, enquanto anticorpos contra Fagote rotular a zona ativa de um terminal pré-sináptica12. Os transportadores vesiculares, tais como os transportadores de glutamato vesicular (vGluT) ou transportador vesicular de GABA (vGAT), são usados para rotular excitatórios13 e inibitórios14 terminais pré-sináptica, respectivamente. No lado pós-sináptica, anticorpos contra a proteína de Homer podem ser empregados para marcar terminais pós-sinápticos e anticorpos contra a densidade pós-sináptica proteína 95 (PSD95)15,16,17 ou gephyrin18 , 19 , 20 pode rotular terminais pós-sinápticos excitatórios ou inibitórios, respectivamente. Usando anticorpos contra uma proteína de interesse e marcadores tais como as descritas acima, pode-se determinar a localização de tais proteínas. Muitos estudos até à data este feito em uma maneira qualitativa21. No entanto, para determinar a distribuição diferencial de uma proteína sináptica específica de forma fiável, um deve não somente determinar sua presença ou ausência, mas também sua concentração relativa. A heterogeneidade de tamanhos e densidade de sinapses tornam importante estabelecer uma relação entre o marcador sináptico e a proteína de interesse. Caso contrário, regiões de sinapse-ricos tais como as camadas não-piramidais do hipocampo e a camada molecular do cerebelo mostrará uma alta densidade de proteínas sinápticas, apenas devido à maior densidade de sinapses, mas não devido a uma forte presença de proteínas na cada sinapse (por exemplo, Wallrafen e Dresbach1). Por outro lado, as proteínas no soma neuronal (por exemplo, TGN3822) mostrará geralmente forte presença na célula piramidal hippocampal camada ou camada de célula grânulo hippocampal ou cerebelar devido a alta concentração de corpos de células nessas áreas. Portanto, esta distribuição não homogênea de estruturas, neste caso as sinapses, pode levar a uma falsa estimativa da distribuição da proteína de interesse em si. Além disso, há uma variabilidade intrínseca as intensidades de coloração através de amostras em colorações imuno-histoquímica. O protocolo descrito aqui leva isso em consideração e evita tais preconceitos, bem como outras limitações que surgem a partir de métodos de imuno-histoquímica.
Em nosso recente estudo, nós usamos este método para descrever a expressão diferencial de motor (também chamado de TPRGL23 ou SVAP3024) através de de áreas cerebrais diferentes 161. Motor é uma proteína sináptica vertebrado-específicos que pode ser encontrada em associação com vesículas sinápticas e influencia a liberação de neurotransmissor25,26,27. Podemos ter relacionado a expressão de Mover para a abundância das vesículas sinápticas, manchando para Sinaptofisina como um marcador de referência de vesícula sináptica. Encontramos altos níveis de motor particularmente em núcleos septais, o pallidum ventral e a amígdala. Dentro do hipocampo, encontramos uma distribuição heterogênea de motor, com altos níveis nas camadas associadas a computação intra-hipocampo e níveis baixos em camadas de entrada e saída.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="737">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:187px;">30120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 087721H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">plastic pipette (disposable)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="right">861,176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1000 mL pipette</td>
			<td style="width:167px;">Rainin</td>
			<td style="width:187px;">&#160;17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2 ml pipette</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td align="right">3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menzel microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10144633CF</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (10X)</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P6148-1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue Tek</td>
			<td>Sakura&#160;</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,063,460,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S26-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">rabbit anti-Mover</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_10804285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guinea pig anti-Synaptophysin</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_1210382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">donkey anti-rabbit AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2492288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2337438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mowiol4-88</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ZEN2 blue software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscopy software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FIJI</td>
			<td style="width:167px;">ImageJ</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence

A presença, ausência ou níveis de proteínas específicas sinápticas severamente podem influenciar a transmissão sináptica. Além de elucidar a função de uma proteína, é vital para determinar também sua distribuição. Aqui, descrevemos um protocolo empregando imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseados em computador para determinar a distribuição da proteína sináptica Mover (também chamado TPRGL ou SVAP30). Comparamos a distribuição de motor para que a vesícula sináptica proteína Sinaptofisina, desse modo, determinar a distribuição de Mover de forma quantitativa em relação a abundância das vesículas sinápticas. Notavelmente, esse método poderia potencialmente ser implementado para permitir a comparação da distribuição de proteínas usando anticorpos diferentes ou microscópios ou em diferentes estudos. Nosso método contorna a variabilidade inerente de imunofluorescência citológicas por rendendo uma relação, ao invés de níveis absolutos de fluorescência. Além disso, descrevemos o método permite que o pesquisador analisar a distribuição de uma proteína em diferentes níveis: de fatias de cérebro inteiro para regiões do cérebro para diferentes sub-regiões na área do cérebro, como as diferentes camadas do hipocampo ou sensorial córtices. Motor é uma proteína de vertebrado específico que está associada com vesículas sinápticas. Com esse método, nós mostramos que o motor é heterogénea em todas as áreas do cérebro, com níveis elevados no pallidum ventral, os núcleos septais e a amígdala e também dentro de áreas do cérebro único, tais como as diferentes camadas do hipocampo.

Representante, manchando os padrões dos diferentes marcadores pode ser visto na Figura 1. O padrão varia de acordo com a distribuição da proteína. Exemplos de cinco níveis de rostro-caudal são mostrados nas colunas (A)-(E). Uma coloração de DAPI representativa é mostrada na primeira linha: DAPI adere ao DNA de uma célula e, portanto, os núcleos estão manchados. Isso resulta em um padrão punctate. Regiões com um...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Aqui descrevemos um protocolo que emprega imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador para determinar a distribuição de proteína sináptica em relação a uma proteína de referência. Nosso método contorna a variabilidade inerente das manchas de imunofluorescência usando uma razão em vez de níveis absolutos de fluorescência. Além disso, com este método você pode analisar a heterogeneidade da distribuição de proteínas em diferentes níveis.De fatias cerebrais inteiras a regiões cerebrais até sub-regiões, como as diferentes camadas do hipocampo. Esta técnica pode ser adaptada para determinar a distribuição de proteínas em diferentes tecidos além do cérebro e sistemas de modelos diferentes dos camundongos. Comece lavando cérebro de rato previamente isolado e fixo, como descrito no manuscrito.Em seguida, transfira o cérebro para um tubo de reação de 15 mililitros com 30% de sacarose 0,1 pb molar. Para crio proteger o cérebro incuba-lo a 4 graus celsius por 48 horas ou até afundar. Depois disso, use uma lâmina afiada para aparar o cérebro protegido criogeno dependendo da área de interesse. Em seguida, coloque o cérebro em um molde criogeno e adicione o composto de temperatura de corte ideal para incorporá-lo certificando-se de evitar bolhas e orientar o cérebro corretamente de modo a ter um plano coronal de corte.Coloque o molde criogeno no congelador de menos 80 graus celsius até que esteja congelado. Monte o tecido congelado no microtome crio e espere pelo menos 15 minutos antes da seção para equilibrá-lo à temperatura do microtoma. Comece a cortar o cérebro em fatias coronais de 25 micrômetros de espessura.Use um gancho de vidro para o OCT da primeira fatia cuidadosamente sem tocar no tecido cerebral. O OCT vai grudar no gancho de vidro. Use o gancho de vidro para transferir a fatia cerebral para o primeiro poço.Colete três fatias adjacentes por poço em uma placa de 24 poços preenchidas com PB molar 0,1. Armazene as fatias a quatro graus celsius até coloração por até duas semanas. Para preparar as fatias para a coloração imuno, use uma tubulação de plástico para remover a solução PB de um poço sem desenhar as fatias cerebrais. Em seguida, use uma tubulação de 1000 micro litros para adicionar 250 microliters de PB fresco para lavá-los de excesso de OUTUBRO.Repita esta lavagem para cada poço no momento para evitar secar as fatias. Em seguida, use uma tubulação de plástico para remover a solução PB do primeiro poço. Use um pipet de 1000 microliteres para adicionar 250 microliters de tampão de bloqueio por bem funcionando bem novamente.Incubar a placa em temperatura ambiente em um agitador por três horas. Durante a incubação adicione 250 microliters de tampão de anticorpos por poço a um tubo de reação. Em seguida, use um pipet de 2 microliter para adicionar a quantidade apropriada de tubos de anticorpos que o tubo diretamente na solução e gentilmente tubos para cima e para baixo várias vezes para misturar.Em seguida, vórtice este anticorpo diluído para a mistura adequada. Trabalhando bem, remova bem o tampão de bloqueio com uma tubulação de plástico e adicione 250 microliters de solução de anticorpos primários por poço. Incubar a placa em um shaker a quatro graus celsius durante a noite.No dia seguinte, remova a solução de anticorpos com uma tubulação de plástico. Lave as fatias com 300 microliters de tampão de lavagem um por poço três vezes dez minutos cada lavagem em um agitador à temperatura ambiente. Durante a lavagem, trabalhando no escuro, diluir o fluor para um segundo anticorpo em um tubo de reação da mesma forma que anteriormente feito com o anticorpo primário.Depois de concluída a lavagem, remova o tampão de lavagem com uma tubulação plástica e adicione 250 microliters de solução de anticorpos secundários por poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 90 minutos. Após a incubação concluída, remova a solução de anticorpos com uma tubulação de plástico.Lave as seções três vezes com tampão de lavagem dois da mesma forma que com o tampão de lavagem um. Durante esta lavagem diluir a mancha DAPI em 0,1 pb molar para alcançar uma concentração de um a 2000. Depois de remover o tampão de lavagem da placa adicione 250 microliters de solução DAPI e incubar à temperatura ambiente no agitador por 5 minutos.Depois de remover a solução DAPI com uma tubulação de plástico use uma tubulação de 1000 microliteres para adicionar 500 microliters de PB molar de 0,1 por poço. Coloque um slide de microscópio sob um estereóscópio. Use uma escova fina para adicionar três gotas separadas de 0,1 molar PB no slide.Usando o pincel coloque uma fatia por gota no slide e, em seguida, achate e oriente as fatias. Depois de todas as fatias serem posicionadas corretamente use um tecido de papel para remover o excesso de PB e seque cuidadosamente sem secar completamente as fatias. Em seguida, adicione 80 microliters de incorporação de meio no slide e cubra-o cuidadosamente com um deslizamento de tampa para incorporar as fatias cerebrais.Cubra os slides para evitar a exposição à luz e deixe-os secar no capô da fumaça por uma a duas horas e, em seguida, armazene-os em uma caixa de slides de microscópio a quatro graus celsius até estar pronto para microscopia confocal. Depois de adquirir tecidos virtuais de toda a fatia cerebral para diferentes canais, como descrito no manuscrito, carregue todos os canais ou uma imagem em FIJI clicando no arquivo e depois abra. Em seguida, use a ferramenta de seleção manual gratuita para delinear um hemisfério no canal DAPI.Clique em editar e, em seguida, selecione a máscara para criar uma máscara da região selecionada. Em seguida, clique em analisar e, em seguida, medir partículas para determinar a intensidade média de fluorescência para canais únicos. Certificando-se de selecionar canais únicos para determinar os valores médios de intensidade de fluorescência para cada canal.Depois disso, copie a intensidade média da fluorescência para os canais únicos em uma planilha. Para determinar a intensidade média da fluorescência para os canais únicos em uma área de interesse, delineie a área com a ferramenta de seleção manual gratuita. Após a coloração com DAPI, que mancha seções cerebrais de núcleos têm um padrão pontual e regiões com alta densidade celular são mais brilhantes do que regiões com baixa densidade celular.A coloração com anticorpo Mover revelou distribuição heterogênea com áreas de hot spot brilhantes e áreas mais fracas em todo o cérebro, onde como a Sinaptofisina revelou distribuição mais homogênea. Uma sobreposição de imagens mostrou a distribuição diferencial da fluorescência vermelha indicando proteína mover comparou fluorescência verde indicando Sinápsia. Após a análise de quantificação, os valores de intensidade de fluorescência para diferentes canais nos hemisférios e em todas as áreas de interesse foram determinados tanto para mover quanto para a sinácia.As razões dos valores de fluorescência do motor para os valores de fluorescência sináptica mostram a distribuição heterogênea do Mover com áreas de altos e baixos níveis de Mover em relação às vesículas sinápticas. A proporção relativa do Mover a razão em uma área de interesse em comparação com a do hemisfério e traduzida em uma porcentagem mostrou o quanto o Mover está presente em uma área de interesse em relação à média. A abundância de Mover relativo foi determinada para diferentes camadas nos sub-campos do hipocampo.As três regiões de interesse são quantificadas comparando a razão nas respectivas camadas com a razão do hemisfério correspondente. Este procedimento pode ser facilmente adaptado e combinado com diferentes técnicas de imagem, como microscopia de super resolução para determinar adicionalmente a distribuição subcelular da proteína de interesse. Esta técnica também pode ser aplicada a diferentes sistemas de modelo, como animais geneticamente modificados ou tratados com drogas.Isso pode permitir uma abordagem comparativa em diferentes condições experimentais ou mesmo espécies.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Neurociência

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...