Name: quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Agradecemos a Irmgard Weiss excelente asistencia técnica. Los autores reconocen el apoyo de Hermes Pofantis y Andoniya Petkova. Los autores también agradecen el Instituto Europeo de Neurociencias para el uso de la LSM800 y asistencia técnica, especialmente por el Dr. Nils Halbsgut. Este trabajo fue financiado por la Universidad médica centro de Göttingen. JSV agradece apoyo por el centro de microscopía de la nanoescala y Fisiología Molecular del cerebro (CNMPB).

Este protocolo no implica experimentos en animales vivos. Experimentos con euthanizing animales para obtener muestras de cerebro fueron aprobados por las autoridades locales de protección animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) bajo el número T 10/30.
Nota: Para este protocolo, se utilizaron ratones C57BL/6 de machos adultos 3.
1. preparación de la muestra
<ol><li>Preparar fijador y tampón de fosfato de 0,1 M (PB; ver tabla 1<...

<ol>
	<li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types.">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).</li><li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain.">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li><li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms.">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity.">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li><li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse.">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data.">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li><li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve.">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li><li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins.">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li><li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+p38:+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells.">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li><li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone.">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li><li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus.">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li><li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicular+GABA+transporter,+VGAT,+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons.">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic,+Presynaptic,+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex.">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li><li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+:+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95.">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li><li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses.">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li><li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses.">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li><li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li><li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus.">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li><li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network:+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence.">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li><li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tprg,+a+gene+predominantly+expressed+in+skin,+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63.">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li><li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation:+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis.">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li><li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses.">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles.">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>K&#246;rber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover.">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li><li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+in+brain+sections:+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons.">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy.">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li><li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy.">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li></ol>

El método había presentado aquí tiene como objetivo cuantificar la distribución de una proteína de interés en relación con la abundancia de una proteína del marcador con una distribución conocida. Tinción de inmunofluorescencia puede mostrar una alta variabilidad de la coloración de intensidades entre los diferentes sectores. El enfoque de cuantificación descrito aquí evita este problema mediante la determinación de la proporción de la proteína de interés para el medio a través del hemisferio. Por lo ta...

Comunicación entre las neuronas sucede en sitios especializados de contacto denominados sinapsis. Las sinapsis contienen un gran número de proteínas diferentes que orquestar la transmisión sináptica. Algunas de estas proteínas muestran una distribución heterogénea en todo el sistema nervioso y no están presentes en cada sinapsis1. Un ejemplo de tal proteína es Munc13, que participa en el proceso de cebado de vesículas sinápticas. Existen diferentes isoformas de Munc13, que están distribuidos heterogéneamente en el cerebro2, y la presencia o ausencia de isoformas específicas puede influir en la plasticidad sináptica a corto plazo y vesícula sináptica dinámica3, 4 , 5. por lo tanto, es de vital importancia para poder identificar la presencia de diferentes proteínas sinápticas entre áreas del cerebro.
Los métodos de elección para la cuantificación de proteínas sinápticas - hasta ahora - son la espectrometría de masas y de Western Blot, en lugar de inmunohistoquímica6,7,8,9. En algunos casos, se utilizan varios métodos que se complementan entre sí para evaluar la cantidad y la localización de proteínas específicas (es decir, Wilhelm et al. 10). el método se describe aquí permite la localización y cuantificación de proteínas de interés sin la necesidad de utilizar cualquier método bioquímico, simplemente empleando los stainings inmunofluorescentes. Otra ventaja aquí es que la cuantificación puede realizarse sobre áreas mucho más pequeñas y, por lo tanto, más específicos, que el logrado por otros métodos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que una proteína de referencia confiable es necesario para evaluar la distribución de la proteína de interés.
Fluorescente de tinción por inmunohistoquímica permite identificar rutinariamente la localización de proteínas entre las áreas del cerebro, así como dentro de diferentes compartimientos neuronales. Para identificar los diferentes compartimentos, se utilizan marcadores específicos. Por lo general, los anticuerpos contra la sinapsina y synaptophysin11 pueden utilizarse para etiqueta de vesículas sinápticas, mientras que la zona activa de un terminal presináptico12la etiqueta anticuerpos contra fagot. Transportadores vesiculares, como los transportadores vesiculares de glutamato (vGluT) o el transportador vesicular de GABA (vGAT), se utilizan para etiquetar excitatorios13 e inhibitorio14 terminales presinápticos, respectivamente. En el lado postsináptico, anticuerpos contra la proteína Homer pueden ser empleados para marcar las terminales postsinápticas y anticuerpos contra densidad postsynaptic proteínas 95 (PSD95)15,16,17 o gephyrin18 , 19 , 20 puede etiquetar terminales postsinápticos excitatorios o inhibitorios, respectivamente. Mediante el uso de anticuerpos contra una proteína de interés y marcadores tales como los descritos anteriormente, uno puede determinar la localización de dicha proteína. Muchos estudios hasta la fecha han hecho esto en una forma cualitativa21. Sin embargo, determinar confiablemente la distribución diferencial de una proteína sináptica específica, uno debe no sólo determinar su presencia o ausencia sino también su concentración relativa. La heterogeneidad de tamaños y densidad de las sinapsis, es importante establecer una relación entre el marcador sináptico y la proteína de interés. De lo contrario, muestra una alta densidad de proteínas sinápticas, solamente debido a la mayor densidad de sinapsis pero no debido a una fuerte presencia de esa proteína en regiones ricas en sinapsis como las capas no piramidal del hipocampo y la capa molecular del cerebelo cada sinapsis (por ejemplo, Wallrafen y Dresbach1). Por otro lado, las proteínas en el soma neuronal (p. ej., TGN3822) generalmente presentan fuerte presencia en la capa de células piramidales hipocampales o capa de células de hipocampo o cerebelosas del gránulo debido a la alta concentración de cuerpos celulares neuronales en esas áreas. Por lo tanto, esta distribución no homogénea de las estructuras, en este caso sinapsis, puede conducir a una falsa estimación de la distribución de la proteína del interés propio. Además, hay una variabilidad intrínseca en la tinción de intensidades a través de muestras en los stainings de immunohistochemical. El protocolo descrito aquí tiene esto en cuenta y evita tales sesgos, así como otras advertencias que surgen de métodos inmunohistoquímicos.
En nuestro reciente estudio, hemos utilizado este método para describir la expresión diferencial del motor (también denominado TPRGL23 SVAP3024) a través de 16 cerebro diferentes zonas1. Es una proteína sináptica específica de vertebrados que puede encontrarse en asociación a las vesículas sinápticas e influye neurotransmisor lanzamiento25,26,27. Hemos relacionado la expresión de Mover a la abundancia de vesículas sinápticas, de coloración para el synaptophysin como un marcador de referencia de la vesícula sináptica. Se encontraron altos niveles del motor particularmente en la amígdala, los núcleos septales y el pallidum ventral. En el hipocampo, encontramos una distribución heterogénea de Mover, con altos niveles en las capas asociadas con cómputo intra-hippocampal y bajos niveles en las capas de entrada y salida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="737">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:187px;">30120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 087721H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">plastic pipette (disposable)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="right">861,176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1000 mL pipette</td>
			<td style="width:167px;">Rainin</td>
			<td style="width:187px;">&#160;17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2 ml pipette</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td align="right">3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menzel microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10144633CF</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (10X)</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P6148-1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue Tek</td>
			<td>Sakura&#160;</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,063,460,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S26-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">rabbit anti-Mover</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_10804285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guinea pig anti-Synaptophysin</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_1210382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">donkey anti-rabbit AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2492288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2337438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mowiol4-88</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ZEN2 blue software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscopy software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FIJI</td>
			<td style="width:167px;">ImageJ</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence

La presencia, ausencia o niveles de proteínas sinápticas específicas pueden influir seriamente en transmisión sináptica. Además de dilucidar la función de una proteína, es vital para determinar su distribución. Aquí, describimos un protocolo de empleo de la inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis computarizado para determinar la distribución de la proteína sináptica Mover (también llamado TPRGL o SVAP30). Comparamos la distribución del motor a la de la vesícula sináptica proteína sinaptofisina, determinando la distribución del motor en términos cuantitativos en relación con la abundancia de vesículas sinápticas. En particular, este método podría aplicarse potencialmente para permitir la comparación de la distribución de proteínas con diversos anticuerpos o microscopios o a través de diferentes estudios. Nuestro método evita la variabilidad inherente de los stainings inmunofluorescentes cediendo una relación en lugar de los niveles de fluorescencia absoluta. Además, el método que se describe permite al investigador analizar la distribución de una proteína en diferentes niveles: desde rebanadas de todo el cerebro a regiones del cerebro a diversas subregiones de zona de un cerebro, como las diferentes capas del hipocampo o sensorial cortezas. Es una proteína específica de vertebrados que se asocia con vesículas sinápticas. Con este método, se muestra que Mover es heterogénea en las áreas del cerebro, con altos niveles en el pallidum ventral, el núcleo septal y la amígdala y también en áreas individuales del cerebro, como las diferentes capas del hipocampo.

Representante de patrones de diferentes marcadores de tinción puede verse en la figura 1. El patrón varía en función de la distribución de la proteína. Se muestran ejemplos de cinco niveles rostro caudal en columnas (A)-(E). Un representante de tinción DAPI se muestra en la primera fila: DAPI se adhiere al ADN de una célula y por lo tanto se tiñen los núcleos. Esto resulta en un patrón punteado. Regiones con una al...

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Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Aquí describimos un protocolo que emplea inmunofluorescencia, microscopía confocal y análisis basado en computadora para determinar la distribución de proteína sináptica en relación con una proteína de referencia. Nuestro método elude la variabilidad inherente de las tinciones de inmunofluorescencia mediante el uso de una relación en lugar de niveles absolutos de fluorescencia. Además con este método se puede analizar la heterogeneidad de la distribución de proteínas en diferentes niveles.Desde rebanadas de cerebro enteros hasta regiones cerebrales e incluso subregiones como las diferentes capas del hipocampo. Esta técnica se puede adaptar para determinar la distribución de proteínas en diferentes tejidos distintos del cerebro y sistemas modelo distintos de los ratones. Comience lavando el cerebro de ratón previamente aislado y fijo como se describe en el manuscrito.Luego transfiera el cerebro a un tubo de reacción de 15 mililitros con 30%sacarosa 0.1 molar PB. Para proteger el cerebro incubarlo a 4 grados centígrados durante 48 horas o hasta que se hunda. Después de eso, usa una cuchilla afilada para recortar el cerebro protegido crio, dependiendo del área de interés. A continuación, coloque el cerebro en un molde crio y agregue el compuesto de temperatura de corte óptimo para incrustarlo asegurándose de evitar burbujas y orientar el cerebro correctamente para tener un plano coronal de corte.Coloque el molde crio en el congelador de menos 80 grados centígrados hasta que esté congelado. Montar el tejido congelado en el microtoma crio y esperar al menos 15 minutos antes de la sección para equilibrarlo a la temperatura del microtomo. Comienza a cortar el cerebro en rodajas coronales de 25 micrómetros de espesor.Use un gancho de vidrio al PTU de la primera rebanada cuidadosamente sin tocar el tejido cerebral. El OCT se pegará al gancho de vidrio. Usa el gancho de vidrio para transferir la rebanada cerebral al primer pozo.Recoger tres rodajas adyacentes por pozo en una placa de 24 pozos llena con 0.1 molar PB. Almacene las rodajas a cuatro grados centígrados hasta que se manche durante un máximo de dos semanas. Para preparar las rodajas para la inmunomancha, utilice una pipeta de plástico para eliminar la solución de PB de un pozo sin dibujar en las rebanadas cerebrales. A continuación, utilice un pipeteo de 1000 micro litros para agregar 250 microlitros de PB fresco para lavarlos de exceso de OCT.Repita este lavado para cada pozo en el momento para evitar secar las rodajas. A continuación, utilice una pipeta de plástico para quitar la solución PB del primer pozo. Utilice una pipeta de microlitros de 1000 microlitros para agregar 250 microlitros de búfer de bloqueo por pozo que funcionan bien de nuevo.Incubar la placa a temperatura ambiente en una coctelera durante tres horas. Durante la incubación añadir 250 microlitros de tampón de anticuerpos por pozo a un tubo de reacción. A continuación, utilice una pipeta de 2 microlitrotro para agregar la cantidad adecuada de anticuerpos pipetándolo directamente en la solución y suavemente pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar.A continuación, vórtice este anticuerpo diluido para no asegurar la mezcla adecuada. Funcionando bien quitando bien el tampón de bloqueo con una pipeta de plástico y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos primarios por pozo. Incubar el plato en una coctelera a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente retire la solución de anticuerpos con una pipeta de plástico. Lavar las rodajas con 300 microlitros de tampón de lavado uno por pozo tres veces diez minutos cada uno lavar en una coctelera a temperatura ambiente. Durante el lavado, trabajando en la oscuridad, diluir el flúor para un par de segundos anticuerpos en un tubo de reacción de la misma manera que se hacía anteriormente con el anticuerpo primario.Después de completar el lavado, retire el tampón de lavado con una pipeta de plástico y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos secundarios por pozo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de la incubación completa, retire la solución de anticuerpos con una pipeta de plástico.Lave las secciones tres veces con el tampón de lavado dos de la misma manera que con la tampón de lavado uno. Durante este lavado diluye la mancha DAPI en 0,1 MOLar PB para lograr una concentración de uno a 2000. Después de retirar el tampón de lavado de la placa añadir 250 microlitros de solución DAPI e incubar a temperatura ambiente en la coctelera durante 5 minutos.Después de retirar la solución DAPI con una pipeta de plástico, utilice una pipeta de 1000 microlitros para agregar 500 microlitros de 0,1 MOLar PB por pozo. Coloque una diapositiva de microscopio debajo de un estereoscopio. Utilice un cepillo fino para agregar tres gotas separadas de 0.1 molar PB en la diapositiva.Usando el pincel coloque un corte por gota en la diapositiva y luego aplane y oriente los rodajas. Después de que todas las rodajas se colocan correctamente, utilice un pañuelo de papel para eliminar el exceso de PB y seque cuidadosamente sin secar las rodajas por completo. A continuación, agregue 80 microlitros de medio de incrustación en la diapositiva y cúbralo cuidadosamente con un resbalón de cubierta para incrustar las rebanadas cerebrales.Cubra los portaobjetos para evitar la exposición a la luz y déjelos secar en la campana de humos durante una o dos horas y luego guárdelos en una caja deslizante de microscopio a cuatro grados centígrados hasta que estén listos para la microscopía confocal. Después de adquirir tejidos virtuales de toda la rebanada del cerebro para diferentes canales como se describe en el manuscrito, cargue todos los canales individuales o una imagen en FIJI haciendo clic en el archivo y luego abra. A continuación, utilice la herramienta de selección de manos libres para delinear un hemisferio en el canal DAPI.Haga clic en editar, luego seleccione y, a continuación, cree una máscara para crear una máscara de la región seleccionada. A continuación, haga clic en analizar y luego medir partículas para determinar la intensidad media de fluorescencia para canales individuales. Asegúrese de seleccionar canales individuales para determinar los valores medios de intensidad de fluorescencia para cada canal.Después de eso, copie la intensidad media de fluorescencia para los canales individuales en una hoja de cálculo. Para determinar la intensidad media de fluorescencia para los canales individuales en un área de interés, defina el área con la herramienta de selección de manos libres. Después de la tinción con DAPI que mancha los núcleos secciones cerebrales tienen un patrón de punctada y las regiones con alta densidad celular son más brillantes que las regiones con baja densidad celular.La tinción con anticuerpos Mover reveló una distribución heterogénea con áreas de puntos calientes brillantes y áreas de atenuación en todo el cerebro donde como Synaptophysin reveló una distribución más homogénea. Una superposición de imágenes mostró la distribución diferencial de la fluorescencia roja que indicaba la proteína Mover comparada con la fluorescencia verde que indica sinaptofísica. Después del análisis de cuantificación, se han determinado valores de intensidad de fluorescencia medios para diferentes canales a través de los hemisferios y en todas las áreas de interés para Mover y Sinaptophysin.Las proporciones de los valores de fluorescencia del motor con respecto a los valores de fluorescencia de sinaptofisina muestran la distribución heterogénea de Mover con áreas de niveles de Mover altos y bajos en relación con las vesículas sinápticas. Abundancia relativa de Mover la relación en un área de interés en comparación con la de todo el hemisferio y traducido en un porcentaje mostró la cantidad de Mover está presente en un área de interés en relación con el promedio. La abundancia relativa de Mover se determinó para diferentes capas en los subcampos del hipocampo.Las tres regiones de interés se cuantifican comparando la relación en las capas respectivas con la relación del hemisferio correspondiente. Este procedimiento se puede adaptar y combinar fácilmente con diferentes técnicas de imagen, como la microscopía de super resolución para determinar adicionalmente la distribución subcelular de la proteína de interés. Esta técnica también se puede aplicar a diferentes sistemas modelo, como animales modificados genéticamente o tratados con medicamentos.Esto puede permitir un enfoque comparativo a través de diferentes condiciones experimentales o incluso especies.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Investigación

Neurociencias

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

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Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

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Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

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Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...