Name: quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Vi tackar Irmgard Weiss för utmärkt tekniskt bistånd. Författarna erkänner stöd av Hermes Pofantis och Andoniya Petkova. Författarna vill även tacka Europeiska neurovetenskap Institutet för användning av LSM800 och tekniskt bistånd, särskilt genom Dr Nils Halbsgut. Detta arbete finansierades av vid University Medical Center Göttingen. JSV erkänner stöd av Center för nanoskala mikroskopi och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB).

Detta protokoll innebär inte experiment på levande djur. Experiment med euthanizing av djur för att erhålla hjärnan prover godkändes av de lokala djurskydd myndigheterna (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under godkännandenummer T 10/30.
Obs: För detta protokoll, 3 vuxna manliga C57BL/6 möss användes.
1. provberedning
<ol><li>Förbereda fixativ och 0,1 M fosfatbuffert (PB, se tabell 1).</li>
	<li>Fixa djuret av tr...

<ol>
	<li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types.">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).</li><li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain.">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li><li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms.">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li><li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity.">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li><li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse.">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data.">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li><li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve.">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li><li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry.">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li><li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins.">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li><li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+p38:+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells.">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li><li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone.">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li><li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus.">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li><li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicular+GABA+transporter,+VGAT,+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons.">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic,+Presynaptic,+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex.">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li><li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+:+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95.">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li><li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses.">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li><li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses.">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li><li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li><li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus.">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li><li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network:+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence.">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li><li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tprg,+a+gene+predominantly+expressed+in+skin,+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63.">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li><li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation:+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis.">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li><li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses.">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li><li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles.">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>K&#246;rber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover.">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li><li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+in+brain+sections:+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons.">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy.">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li><li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy.">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li></ol>

Metoden presenteras här syftar till att kvantifiera distribution av ett protein av intresse i förhållande till överflödet av ett protein som markör med en känd fördelning. Immunofluorescens färgning kan visa en hög variabilitet av färgning stödnivåer mellan olika skivor. Metoden kvantifiering beskrivs här kringgår detta problem genom att bestämma förhållandet mellan proteinet av intresse för genomsnittet över halvklotet. Därför olika färgning intensiteter över segment ställs och möjliggöra en k...

Kommunikationen mellan nervceller händer på specialiserade kontakt webbplatser kallas synapser. Synapser innehåller en myriad av olika proteiner som orkestrera synaptisk transmission. Några av dessa proteiner visar en heterogen fördelning i hela nervsystemet och är inte närvarande i varje synaps1. Ett exempel för ett sådant protein är Munc13, som är involverat i processen priming av synaptiska vesikler. Det finns olika isoformer av Munc13, som är heterogent fördelat i hela hjärnan2, och närvaron eller frånvaron av särskilda isoformer kan påverka kortsiktiga synaptisk plasticitet och synaptiskt vesikelprotein dynamics3, 4 , 5. det är därför av avgörande betydelse för att kunna identifiera förekomsten av olika synaptic proteiner över hjärnområden.
Metoderna av val för kvantifiering av synaptic proteiner - hittills - är masspektrometri och Western blotting, i stället för immunohistokemi6,7,8,9. I vissa fall metoderna flera kompletterar varandra för att bedöma både kvantiteten och lokalisering av specifika proteiner (dvs, det Wilhelm o.a. 10). den metod som vi beskriver här tillåter för lokalisering och kvantifiering av proteiner av intresse utan att behöva använda någon biokemisk metod, helt enkelt anställa Immunofluorescerande infärgning. En annan fördel här är att kvantifiering kan göras över områden mycket mindre och därför mer specifika, än de som uppnås med andra metoder. Dock måste man beakta att en tillförlitlig referens protein behövs för att bedöma fördelningen av proteinet av intresse.
Fluorescerande färgning av immunohistokemi tillåter oss att rutinmässigt identifiera lokaliseringen av proteiner i hjärnområden samt inom olika neuronala fack. För att identifiera de olika fack, används specifika markörer. Antikroppar mot synapsin och synaptophysin11 kan vanligtvis användas att märka synaptic vesicles, medan antikroppar mot fagott etikett den aktiva zonen av en presynaptiska terminal12. Vesikulär transportörer, såsom vesikulär glutamat transportörer (vGluT) eller vesikulär GABA transportör (vGAT), används för att märka excitatoriska13 och hämmande14 presynaptiska terminaler, respektive. På postsynaptiska sida, kan antikroppar mot Homer proteinet användas för att markera postsynaptiska terminaler och antikroppar mot postsynaptiska densitet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan märka retande eller hämmande postsynaptiska terminaler, respektive. Med hjälp av antikroppar mot ett protein av intresse och markörer såsom de som beskrivs ovan, kan man bestämma localizationen av sådant protein. Många studier hittills har gjort i en kvalitativ sätt21. Dock för att tillförlitligt avgöra differentiell fördelningen av ett specifikt synaptic protein, måste man inte bara bestämma dess närvaro eller frånvaro men också dess relativa koncentration. Heterogenitet i storlekar och täthet av synapser gör det viktigt att fastställa en kvot mellan den synaptiska markören och proteinet av intresse. Annars, synaps-rika regioner såsom icke-pyramidal lager av hippocampus och det molekylära lagret av lillhjärnan visar en hög täthet av synaptic proteiner, endast på grund av den högre tätheten av synapser men inte på grund av en stark närvaro av det proteinet i varje synaps (t.ex., Wallrafen och Dresbach1). Å andra Visa proteiner i de neuronala soma (t.ex., TGN3822) vanligtvis stark närvaro i hippocampus pyramidal cellager eller Hippocampus eller cerebellär granule cellager på grund av den höga koncentrationen av neuronala cellen organ i dessa områden. Därför denna icke-homogen fördelning av strukturer, i detta fall synapser, kan leda till en falsk uppskattning av fördelningen av proteinet av intresse själv. Dessutom finns det en inneboende variabilitet i färgning stödnivåer över prover i immunhistokemiska färgningar. Protokollet beskrivs här tar hänsyn till detta och undviker sådana fördomar, liksom andra varningar som uppstår från immunohistokemiska metoder.
I vår senaste studie, vi har använt denna metod för att beskriva differentiell uttrycket av Mover (även kallad TPRGL23 eller SVAP3024) över 16 olika hjärnan områden1. Mover är ett ryggradsdjur-specifika synaptic protein som finns i föreningen till synaptic blåsor och påverkar signalsubstansen pressmeddelande25,26,27. Vi har släkt Mover uttrycket att överflödet av synaptiska vesikler, genom färgning för synaptophysin som synaptiskt vesikelprotein referens markör. Vi hittade höga halter av Mover särskilt i septal atomkärnor, den ventrala pallidum och amygdala. Inom hippocampus hittade vi en heterogen fördelning av Mover, med höga nivåer i samband med intra-Hippocampus uträkningen, och låga nivåer i in- och utdata lager lager.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:736px;" width="737">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1.5 mL reaction tubes</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:187px;">30120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL reaction tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td align="right">227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">multiwell 24 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 087721H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">plastic pipette (disposable)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="right">861,176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">1000 mL pipette</td>
			<td style="width:167px;">Rainin</td>
			<td style="width:187px;">&#160;17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2 ml pipette</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td align="right">3340001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Menzel microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10144633CF</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LSM800</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS (10X)</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; P6148-1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1394KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>neoFroxx</td>
			<td>1104KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue Tek</td>
			<td>Sakura&#160;</td>
			<td align="right">4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>5155KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,063,460,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal goat serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S26-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">normal donkey serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td align="right">1,086,031,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">rabbit anti-Mover</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_10804285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">guinea pig anti-Synaptophysin</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>RRID: AB_1210382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">donkey anti-rabbit AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2492288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>RRID: AB_2337438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mowiol4-88</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:187px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 475904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ZEN2 blue software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscopy software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FIJI</td>
			<td style="width:167px;">ImageJ</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the heterogeneous distribution of a synaptic protein in the mouse brain using immunofluorescence

Den närvaro, frånvaro eller nivåer av specifika synaptic proteiner kan allvarligt påverka synaptisk transmission. Förutom att belysa funktionen av ett protein, är det viktigt att även kartlägga dess utbredning. Här beskriver vi ett protokoll som sysselsätter immunofluorescens, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys för att bestämma fördelningen av proteinet synaptiskt Mover (även kallad TPRGL eller SVAP30). Vi jämför fördelningen av Mover som den synaptiska vesikelproteinet protein synaptophysin, därmed att bestämma fördelningen av Mover på ett kvantitativt sätt i förhållande till överflödet av synaptiska vesikler. Särskilt, skulle denna metod potentiellt kunna genomföras för att möjliggöra jämförelse av fördelningen av proteiner med olika antikroppar eller Mikroskop eller mellan olika studier. Vår metod kringgår det inneboende variabilitet av Immunofluorescerande infärgning av ger förhållandet snarare än absoluta fluorescens nivåer. Dessutom, den metod som vi beskriver gör det möjligt för forskaren att analysera fördelningen av ett protein på olika nivåer: från hela hjärnan skivor till hjärnan till olika delområden i en hjärna området, såsom de olika lagren av hippocampus eller sensoriska cortices. Mover är ett ryggradsdjur-specifika protein som associeras med synaptic blåsor. Med den här metoden visar vi att Mover fördelas ojämnt över hjärnområden, med höga nivåer i den ventrala pallidum, septal atomkärnor och amygdala, och även inom enda hjärnan, såsom hippocampus olika lager.

Representant färgning mönster av olika markörer kan ses i figur 1. Mönstret varierar beroende på fördelningen av protein. Exempel på fem rostro-kaudala nivåer visas i kolumner (A)-(E). En representativ DAPI färgning visas i den första raden: DAPI följer DNA i en cell och därmed kärnor färgas. Detta resulterar i en punktuell mönster. Regioner med en hög cell densiteten är ljusare än regioner med låg cell tä...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence at JoVE.com

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Här beskriver vi en kvantitativ metod att bestämma fördelningen av ett synaptic protein i förhållande till en markör protein med hjälp av immunofluorescens färgning, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys.

Kvantifiera heterogen fördelning av ett Synaptic Protein i mus hjärnan med hjälp av immunofluorescens

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Här beskriver vi ett protokoll som sysselsätter immunofluorescens, confocal mikroskopi och dator baserad analys för att fastställa fördelningen av synaptiska protein i förhållande till en referens protein. Vår metod kringgår den inneboende variabiliteten av immunofluorescens färgningar genom att använda ett förhållande snarare än absolut fluorescens nivåer. Dessutom med denna metod kan du analysera heterogeniteten av proteinfördelning på olika nivåer.Från hela hjärnan skivor till hjärnan regioner till även underregioner som de olika skikten av hippocampus. Denna teknik kan anpassas för att bestämma proteinfördelningen i andra olika vävnader än hjärnan och modellsystem än möss. Börja med att tvätta tidigare isolerade och fasta mus hjärnan som beskrivs i manuskriptet.Överför sedan hjärnan till ett 15 milliliter reaktionsrör med 30%sackaros 0,1 molar PB. För att cryo skydda hjärnan inkubera den vid 4 grader celsius i 48 timmar eller tills den sjunker. Efter att använda en ett vasst blad för att trimma cryo skyddade hjärnan beroende på intresseområde. Placera sedan hjärnan i en kryo mögel och tillsätt Optimal Cutting Temperature Compound för att bädda in den att se till att undvika bubblor och orientera hjärnan ordentligt för att ha en koronaplan av skärning.Placera kryomössen i minus 80 graders frysbox tills den är frusen fast. Montera den frysta vävnaden på kryomikrotomen och vänta i minst 15 minuter innan avsnitt för att jämvikta den till mikrotomtemperaturen. Börja skära hjärnan i 25 mikrometer tjocka koronaskivor.Använd en glaskrok till ULT av den första skivan noggrant utan att röra hjärnvävnaden. Oct kommer att hålla sig till glaskroken. Använd glaskroken för att överföra hjärnskivan till den första brunnen.Samla tre intilliggande skivor per brunn i en 24 brunnsplatta fylld med 0,1 molar PB. Förvara skivorna i fyra grader celsius tills färgning i upp till två veckor. För att förbereda skivor för immunfärgning använda en plast pipet att ta bort PB lösningen från en brunn utan att dra i hjärnan skivor. Använd sedan en 1000 mikro liter pipet att lägga till 250 mikroliter av färska PB att tvätta dem av överskott OCT.Upprepa denna tvätt för varje brunn vid den tidpunkten för att undvika att torka ut skivorna. Använd sedan en plastpip för att ta bort PB-lösningen från den första brunnen. Använd en 1000 microliter pipet att lägga till 250 mikroliter av blockerande buffert per brunn fungerar bra genom väl igen.Inkubera plattan i rumstemperatur på en skakmaskin i tre timmar. Under inkubationen tillsätt 250 mikroliter av antikroppsbuffert per brunn till ett reaktionsrör. Använd sedan en 2 microliter pipet att lägga till lämplig mängd av antikroppar pipeetting det direkt i lösningen och försiktigt pipet upp och ner flera gånger för att blanda.Då virvel denna utspädda antikroppar till osäker korrekt blandning. Fungerar bra genom att väl ta bort den blockerande bufferten med en plast pipet och tillsätt 250 mikroliter av primära antikroppslösning per brunn. Inkubera plattan på en shaker vid fyra grader celsius över natten.Följande dag avlägsna antikroppslösningen med en plastpip. Tvätta skivorna med 300 mikroliter tvättbuffert en per brunn tre gånger tio minuter varje tvätt på en shaker vid rumstemperatur. Under tvättningen, arbeta i mörker, späd fluoren för ett par andra antikropp i en reaktionsrör på samma sätt som tidigare gjort med den primära antikroppen.Efter avslutad tvätt ta bort tvättbufferten med en plast pipet och tillsätt 250 mikroliter av sekundära antikroppslösning per brunn. Inkubera i mörker i rumstemperatur i 90 minuter. Efter avslutad inkubation avlägsna antikroppslösningen med en plast pipet.Tvätta sektionerna tre gånger med tvättbuffert två på samma sätt som med tvättbuffert ett. Under denna tvätt späda DAPI fläck i 0,1 molar PB att uppnå en en till 2000 koncentration. Efter att tvättbufferten tagits ur plattan tillsätt 250 mikroliter av DAPI-lösning och inkubera i rumstemperatur på skakmaskinen i 5 minuter.Efter att ha tagit bort DAPI-lösningen med en plast pipet använda en 1000 microliter pipet att lägga till 500 mikroliter på 0,1 molar PB per brunn. Placera ett mikroskop glida under ett stereoscope. Använd en fin borste för att lägga till tre separata droppar av 0,1 molar PB på bilden.Använd penseln placera ett segment per droppe på bilden och sedan platta och orientera skivorna. Efter alla skivor är placerade korrekt använda en pappersvävnad för att avlägsna överskott PB och torka försiktigt utan att torka skivorna helt. Tillsätt sedan 80 mikroliter av inbäddningsmedium på bilden och täck den försiktigt med en omslagssnedsteg för att bädda in hjärnskivorna.Täck bilderna för att undvika ljusexponering och låt dem torka i rökhuven i en till två timmar och förvara dem sedan i en mikroskopsglaslåda med fyra grader celsius tills de är redo för konfokalmikroskopi. Efter att ha förvärvat virtuella vävnader av hela hjärnan skiva för olika kanaler som beskrivs i manuskriptet ladda alla enstaka kanaler eller en bild i FIJI genom att klicka på fil och sedan öppna. Använd sedan verktyget för fri handval för att avgränsa en halvsfär i DAPI-kanalen.Klicka på redigera, sedan val, sedan skapa mask för att skapa en mask av den valda regionen. Klicka sedan på analysera och sedan mäta partiklar för att bestämma medelvärdet fluorescens intensitet för enstaka kanaler. Se till att välja enstaka kanaler för att bestämma medelvärdet fluorescens intensitetsvärden för varje kanal.Efter det, kopiera medelvärdet fluorescens intensitet för de enstaka kanalerna i ett kalkylblad. För att bestämma medelvärdet fluorescens intensitet för de enstaka kanalerna i ett område av intresse avgränsa området med fri hand val verktyget. Efter färgning med DAPI som fläckar kärnor hjärnan sektioner har ett punktat mönster och regioner med hög celltäthet är ljusare än regioner med låg celltäthet.Färgning med Mover antikropp avslöjade heterogen fördelning med ljusa hot spot områden och dimmer områden i hela hjärnan där som Synaptophysin visade mer homogen fördelning. Ett överlagring av bilder visade differentiell fördelning av röda fluorescens anger Mover protein jämfört grön fluorescens anger Synaptophysin. Efter kvantifieringsanalys medelvärde fluorescens intensitetsvärden för olika kanaler över halvkloten och över områdena av intresse har fastställts för både Mover och Synaptophysin.Nyckeltal av moverfluorescensvärdena till Synaptophysin fluorescensvärden visar den heterogena fördelningen av Mover med områden med höga och låga Mover-nivåer i förhållande till Synapptic vesicles. Relativ Mover överflöd förhållandet i ett område av intresse jämfört med det över hela halvklotet och översatt till en procentsats visade hur mycket Mover är närvarande i ett område av intresse i förhållande till genomsnittet. Relativ Mover överflöd bestämdes för olika lager i sub fälten i hippocampus.De tre intresseregionerna kvantifieras genom att förhållandet i respektive skikt jämförs med kvoten motsvarande halvsfär. Detta förfarande kan enkelt anpassas och kombineras med olika bildframställning tekniker såsom super upplösning mikroskopi att dessutom bestämma sub cellulära fördelningen av proteinet av intresse. Denna teknik kan också tillämpas på olika modellsystem som genetiskt modifierade eller läkemedelsbehandlade djur.Detta kan möjliggöra en jämförande strategi över olika experimentella förhållanden eller till och med arter.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Kvantifiera aktivitet Cis-Reglerande element i musen Retina av Explantation elektroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Övervakning av förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen och synaptisk effekt i Blötdjur<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementera Dynamic Clamp med Synaptic och artificiella konduktanser i Mus Retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Live avbildning av ependymala Cilia i de laterala ventriklama i mushjärna

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Ett enkelt sätt att mäta förändringar i belöning sökande beteende genom<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Att kombinera optogenetik med konstgjorda mikroRNA att karakterisera de effekter av genen Knockdown på presynaptiska funktion inom intakt neuronala kretsar

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Kvantifiera subcellulär ubiquitin-Proteasome-aktivitet i gnagare hjärnan

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...