Name: identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan
Uploaded: 2019-09-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Figur 1b, 1C, 1E og 1f gengives fra Bai et al . 10 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Vi takker Yi Hao i X. C. 's Lab for figur redigering. Dette arbejde støttes af Kinas National Natural Science Foundation (nr. 91753206 til Q. S. og X. C., nr. 31371093 til Q. S., og NOS. 21425204 og 21672013 til X. C.).

Alle de dyre protokoller, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev godkendt af IACUC (Udvalget for institutionel dyreomsorg og-anvendelse) på Tsinghua Universitet og udført i overensstemmelse med IACUC'S retningslinjer. Laboratoriet dyre facilitet på Tsinghua Universitet er blevet akkrediteret af AAALAC (Association for vurdering og akkreditering af laboratorium Animal Care International). Til iscenesættelse af embryoner blev midt dagen for det identificerede vaginal stik beregnet som embryon dag 0,5 (E 0,5)....

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells:+Units+of+Development,+Units+of+Regeneration,+and+Units+in+Evolution.">Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cells:+Generating+and+Regenerating+the+Brain.">Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li><li>Gal, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Morphological+Heterogeneity+of+Neural+Precursors+in+the+Mouse+Neocortical+Proliferative+Zones.">Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones.</a> Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).</li><li>Kawaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+defines+differential+progenitor+subclasses+in+mammalian+neurogenesis.">Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis.</a> Development. 135, 3113-3124 (2008).</li><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+neural+stem+cells.">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li><li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex.">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139, 1535-1546 (2012).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glial+Nature+of+Embryonic+and+Adult+Neural+Stem+Cells.">The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex.">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Biology+of+Neurogenesis:+Toward+an+Understanding+of+the+Development+and+Evolution+of+the+Neocortex.">The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycan+labeling-assisted+discovery+of+cell-surface+markers+for+primary+neural+stem+and+progenitor+cells.">Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells.</a> Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+CNS+cell+generation:+a+programmed+sequence+of+neuron+and+glial+cell+production+from+isolated+murine+cortical+stem+cells.">Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells.</a> Neuron. 28, 69-80 (2000).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan-based+interactions+involving+vertebrate+sialic-acid-recognizing+proteins.">Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins.</a> Nature. 446, 1023-1029 (2007).</li><li>Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Remodeling+of+Cell-Surface+Sialic+Acids:+Principles,+Applications,+and+Recent+Advances.">Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances.</a> ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).</li><li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Membrane+Proteins.">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li><li>Schmidt, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+Study+on+Mass+Spectrometry-Based+Analysis+of+the+Proteome+of+CD34+CD123++Progenitor+Cells+for+the+Identification+of+Potential+Targets+for+Immunotherapy+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia.</a> Proteomes. 6, (2018).</li><li>Crisan, M., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+Development.">The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development.</a> Development. 144, 4195-4195 (2017).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells.">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Cysteine+S-Glycosylation+Induced+by+Per-O-Acetylated+Unnatural+Monosaccharides+during+Metabolic+Glycan+Labeling.">Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2018).</li><li>Gry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+RNA+and+protein+expression+profiles+in+23+human+cell+lines.">Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines.</a> BMC Genomics. 10, 365 (2009).</li><li>Hennen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LewisX+Glycoprotein+Screen+Identifies+the+Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+1+(LRP1)+as+a+Modulator+of+Oligodendrogenesis+in+Mice.">A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).</li><li>O&#8217;Brian, C. A., Chu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReviewPost-translational+disulfide+modifications+in+cell+signaling&#8212;role+of+inter-protein,+intra-protein,+S-glutathionyl,+and+S-cysteaminyl+disulfide+modifications+in+signal+transmission.">ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling&#8212;role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission.</a> Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).</li><li>Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+proteomics+to+unravel+stem+cell+regulatory+mechanisms.">The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms.</a> Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).</li><li>Christensen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-specific+Post-translational+Modifications+of+Mouse+Osteopontin+Are+Associated+with+Different+Adhesive+Properties.">Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).</li><li>Yanagisawa, M., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+and+functions+of+glycoconjugates+in+neural+stem+cells.">The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells.</a> Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li></ol>

Overflade markører bruges almindeligvis til at mærke og rense specifikke celletyper in vitro og in vivo17,18. Opdagelsen af overflade markører bidrager i høj grad til regenerativ medicin og stamcelleforskning ved at give molekylære værktøjer til selektivt at berige en stamcelle population fra normale eller patologiske væv og kultur retter, der tilbyder en renset celle ressource til klinisk brug eller undersøgelse af biologiske egenskaber. Men fremskridte...

Neurale stamceller er defineret som en multi potent cellepopulation, der kan selv forny for at opretholde en stamcelle pulje og differentiere sig til neuroner og glia. De er de vigtigste celletyper i nervesystemet og kan tilbyde stort terapeutisk potentiale i regenerativ medicin gennem celletransplantation til syge og sårede hjerner1,2. Efterhånden som udviklingen skrider frem, bliver den neurale stamcelle population heterogene3,4, og andelen af neurale stamceller i hjernen aftager gradvist5. Generelt er embryonale neurale stamceller og andre neurale stamceller, kollektivt kaldet neurale stamme-og progenitorceller (Nspc'er), placeret i avlsmateriale zonerne, ventrikel zonen og den subventrikulære zone i mus6. I den embryonale hjerne genererer neurale stamceller neuroner direkte eller indirekte gennem mellemliggende progenitorceller (IPCS) og i nogle arter gennem den ydre subventrikulære zone forfædre (orgs)7,8. Den specifikke molekylære signatur, morfologi, placering i stamcelle niche, og differentiering potentiale alle bestemme rollen for hver under type i hjernen organogenesen og kliniske anvendelser9. De aktuelt tilgængelige celleoverflade markører kan dog ikke utvetydigt diskriminere og rense forskellige undertyper af Nspc'er, hvilket begrænser forståelsen og udnyttelsen af disse undertyper.
Identifikationen af primære Nspc'er overflade markører er begrænset af tre store forhindringer. Den første er det begrænsede celleantal af Nspc'er i vævet, hvilket gør det vanskeligt at forberede celleoverflade protein prøver til almindelig massespektrometri analyse. Den anden begrænsning er vanskeligheden ved at producere rene celle undertyper til generering af subtype-specifikke membran protein data. Endelig er den tredje udfordring det lave forhold mellem celleoverflade proteiner i hele celle proteiner, som hæmmer deres detekteringsfølsomhed ved massespektrometri analyse.
For at overvinde disse problemer, vi udviklet en chemoproteomic tilgang til selektivt berige og identificere celleoverflade proteiner i primære Nspc'er ved metabolisk mærkning af sialoglycoproteiner10. For at generere et tilstrækkeligt antal Nspc'er benyttede vi en etableret protokol til at udvide og vedligeholde primære embryonale Nspc'er i udifferentierede stater in vitro, ved at co-culturing Nspc'er med musehjerne endotheliale cellelinjer ved hjælp af en permeabel støtte matrix indsats (f. eks. transwell) system11. I modsætning hertil genererer npscs, som dyrkes alene uden endotelceller, differentieret afkom11,12. Således kan protein prøver fra disse to kultur systemer relativt analyseres for at identificere proteiner, der differentielt udtrykkes i Nspc'er og differentierede neuroner. Da de fleste celleoverflade proteiner modificeres af sialsyre13, blev unaturlig sialsyre forløber analogt N-azidoacetylmannosamin-tetraacyleret (AC4Mannaz) anvendt til at kapre den iboende metaboliske pathway, således at endogene, nyligt syntetiseret sialoglycans er mærket med azido grupper, genererer en kemisk håndtag14. Gennem azido-alkyne-medierede bioortogonale reaktioner, som konjugat biotin til sialoglycans, kan celleoverflade proteiner visualiseres og beriges til proteomisk identifikation gennem en streptavidin-koblet fluoroforet eller matrix14.
Her udfører vi farvning af SDS-side gel analyse af overfladen sialoglycoproteome fra nspc'er ekspanderet i en endotel Co-kultur og differentiere celler i et ikke-Co-kultur system. Vi renser også selektivt overflade sialoglycoproteome i de to kultur systemer til proteomisk sammenligning. Vores protokol, sammenlignet med de traditionelle Centrifugerings baserede celleoverflade rensning protokoller15, øger ekstraktions effekten ved at reducere overfladen protein udvinding procedurer gennem specifik tag konjugation og affinitet Rensning. I mellemtiden, det øger udvinding renhed af celleoverflade proteiner baseret på den forudsætning, at sialylering sker mest på celleoverfladen proteiner. Selv om endotelfaktorer ikke helt kan blokere differentieringen af ekspanderede Nspc'er, giver den komparative undersøgelse mellem en co-kultur og differentieret kultur en bekvem metode til at lokalisere stamcelle berigede overflade proteiner, uden at det er nødvendigt at Analysér proteiner fra NPC'er renset af FACS16. Vi mener, at denne fremgangsmåde kan anvendes til undersøgelser af overflade proteiner i andre systemer med passende modifikationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="879">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BEND3</td>
			<td style="width:283px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-229</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25030081</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17502048</td>
			<td>1 to 100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A7250</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Papain</td>
			<td style="width:283px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS003726</td>
			<td>10 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17504044</td>
			<td>1 to 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">basic Fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">PHG0261</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">15140122</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10099141</td>
			<td align="right">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">HBSS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tripsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DPBS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Transwell</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">158127</td>
			<td align="right">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sucrose</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS-PAGE loading buffer 2X</td>
			<td style="width:283px;">Solarbio</td>
			<td style="width:123px;">P1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">6-well plate</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tris-Glycine protein gel</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">xp00100box</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:283px;">Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">Rat-401</td>
			<td style="width:172px;">1 to 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-beta-tubulin III</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8860</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21121</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21143</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Albumin Bovine V</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Brij97</td>
			<td style="width:283px;">Aladdin</td>
			<td style="width:123px;">B129088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CuSO4</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">209198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">alkyne-biotin</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:123px;">TA105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BTTAA</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ac4ManNAz</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1084</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">9AzSia</td>
			<td style="width:283px;">synthesized in lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">sodium ascorbate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Methanol</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaCl</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Alexa Flour 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">S21374</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:123px;">60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:283px;">RWD Life Science Co.</td>
			<td style="width:123px;">970-00026-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">DNase I</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td>12 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">urea</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan

Neurale stamme-og stamceller (Nspc'er) er det cellulære grundlag for de komplekse strukturer og funktioner i hjernen. De er placeret i specialiserede nicher in vivo og kan isoleres og udvides in vitro, tjener som en vigtig ressource for celletransplantation til at reparere hjerneskade. Nspc'erne er imidlertid heterogene og ikke klart defineret på molekyleniveau eller renset på grund af manglende specifikke celleoverflade markører. Den forelagte protokol, som tidligere er blevet rapporteret, kombinerer et Neural-Endothelial Co-Culture system med en metabolisk Les mærkningsmetode til at identificere overfladen sialoglycoproteome af primære nspc'er. Det NSPC-endotheliale Co-kultur system giver mulighed for selvfornyelse og udvidelse af primære Nspc'er in vitro, genererer et tilstrækkeligt antal nspc'er. Sialoglycans i dyrkede nspc'er er mærket ved hjælp af en unaturlig sialisyre metabolisk reporter med bioorthogonal funktionelle grupper. Ved at sammenligne sialoglycoproteomet fra selvfornyende Nspc'er ekspanderet i en endotelco-kultur med differentierende neurale kultur, identificerer vi en liste over membran proteiner, der er beriget i Nspc'er. I detaljer omfatter protokollen: 1) oprettelse af en NSPC-Endothelial Co-kultur og NSPC differentierende kultur; 2) mærkning med azidosugar per-O-acetyleret N-azidoacetylmannosamin (AC4Mannaz); og 3) biotin konjugering til modificeret sialoglycan til billeddannelse efter fiksering af neurale kultur eller protein udvinding fra neurale kultur for massespektrometri analyse. Derefter udvælges de NSPC-berigede overflade markør kandidater ved komparativ analyse af massespektrometri data fra både det udvidede NSPC og differentierede neurale kulturer. Denne protokol er meget følsom for at identificere membran proteiner af lav overflod i udgangsmaterialerne, og det kan anvendes til markør opdagelse i andre systemer med passende ændringer

Hele proceduren for in vitro-ekspansion og metabolisk mærkning af primære embryonale Nspc'er tager 6 dage (figur 1a). Kvaliteten af BEND3 cellelinje og nyisolerede primære Nspc'er er nøglen til et vellykket eksperiment. BEND3 celler er kilden til opløselige faktorer, der stimulerer selvfornyelse og spredning af Nspc'er. Det bør sikres, at de BEND3 celler er fri for enhver kontaminering og opdele aktivt med minimal celledød før Co-culturing med neurale...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Præsenteret her er en protokol, der kombinerer en in vitro neurale-Endothelial Co-kultur system og metabolisk inkorporering af sialoglycan med bioorthogonal funktionelle grupper til at udvide primære neurale stamme og stamcelle celler og mærke deres overflade sialoglycoproteiner til billeddannelse eller massespektrometri analyse af celleoverflade markører.

Identifikation af celleoverflade markører for primær neurale stamme og stamceller ved metabolisk mærkning af Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Neurale stamceller og progenitor celler kan selv forny og differentiere i forskellige neurale celletyper, støtte nervesystemet udvikling og tilbyde en ressource for regenerativ medicin. Disse celler er heterogene, og vi har brug for at kende deres specifikke celleoverflade markører for at få en renset celle populationer og forstå deres funktioner. Vores protokol giver en enkel, følsom og effektiv teknik til at analysere membran proteiner af primære neurale stamceller og progenitor celler, hjælpe med at identificere nye overflade markører for disse celler.Den største fordel ved vores protokol er dens evne til direkte at analysere overfladen proteom af primære neurale stamceller og progenitor celler med den forbedrede følsomhed og specificitet. Dette opnås ved at udvide dem gennem co-kultur inden for endotelceller in vitro og høj tractin iboende cellulation MAPK-ERK vej til at mærke overflade poriner. Med pore pro-modifikationer på ekspanderende stamceller in vitro, kan vores protokol nemt anvendes til at identificere overflademarkører for andre stamcelletyper.For at forberede endotelceller, re-suspendere en BEN3 celle pellet fra en 10 centimeter Petri skål ved 90% sammenløb med ni milliliter BEN3 celle medium. Tilføj en milliliter af cellesuspensionen i et gennemtrængeligt støtteindsats. Tilføj yderligere to milliliter BEN3 medium pr brønd i det nederste kammer af matrixen.Fortsæt med at dyrke cellerne i en dag ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. En dag efter plating cellerne i skær, forsigtigt aspirere mediet, først fra det nederste kammer og derefter fra skær. Skærene vaskes tre gange med forvarmt DMEM.Skærenes yderflade vaskes ved skylning med forvarmt DMEM. Dernæst tilsættes en milliliter forvarmt AM i et skær. Overfør skær i brøndene med primære kortikale celler.Inkuber co-kultur ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 12 timer. Ac4ManAz opløses i DMSO for at opnå en lagerkoncentration på 200 millimolar. Hent den neurale-endotel co-kultur plade fra inkubatoren.Tilføj en mikroliter af Ac4ManAz-beholdningen til hvert bundkammer og 0,5 mikroliter pr. skær i co-kulturen. Kultur cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i fem dage. Mens cellerne er dyrkning tilføje 100 mikroliter af RM pr indsætte og 200 mikroliter af RM pr nederste kammer til at re-feed endotel og neurale celler hver anden dag.Først skal du fjerne skær fra co-kultur plader og aspirere kulturmediet fra bunden af brøndene. Næste vask neurale celler en gang med forvardte PBS. Inspirer PBS fra brøndene og tilsæt en milliliter af en forkølet 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønd.Fastgør cellerne ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter vaskes cellerne tre gange med forkølet PBS. Inspirer PBS og tilsæt en milliliter frisklavet biotinkonjugeret buffer 1 i hver brønd.Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter. Derefter aspirere reaktionsbufferen fra brøndene og cellerne vaskes tre gange med PBS. Tilføj en milliliter farvning buffer til hver brønd af celler og inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter.Dernæst aspirere farvningsbufferen fra brøndene og vask cellerne tre gange med forkølet PBS. Tilføj en milliliter blokerende buffer til hver brønd af celler og inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter. Fjern blokeringsbufferen fra brøndene, og tilsæt en milliliter primær antistofopløsning til hver brønd.Inkuber cellerne natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag, fjerne den primære antistof opløsning fra brøndene. Cellerne vaskes tre gange med forkølet PBS.Inspirer PBS fra brøndene og tilsæt en milliliter sekundært antistof til hver brønd. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i to timer. Derefter aspirere opløsningen fra brøndene og vask cellerne tre gange med forkølet PBS.Først forberede BTTAA cupric sulfat kompleks 2, fuld protein re-suspension buffer, protein vask buffer 1, protein vask buffer 2 og protein vask buffer 3 som beskrevet i tekstprotokollen. Fjern derefter skærne fra co-culture pladerne. Aspirere kulturmediet fra bunddingsdæderne og vask de neurale celler én gang med forkølet PBS.Aspirere PBS og tilsæt 200 mikroliter af forkølet RIPA buffer til hver brønd. Inkuber pladerne på is i fem minutter, og opsaml derefter proteinlysene i 1,5 milliliterrør. Centrifuge ved 12000 gange G og ved fire grader Celsius i 10 minutter for at pellet cellerester.Supernatanten overføres til nye 1,5 milliliterrør, og proteinkoncentrationen bestemmes med et BCA-sæt i henhold til producentens anvisninger. Derefter justere proteinkoncentrationen til en milligram pr. milliliter. Der tilsættes 100 mikromolaralkydbiotin, 2,5 millimolar natrium ascorbat og 1XBTTAA cupric sulfatkompleks 2 til en milliliter proteinlyis.Bland opløsningen godt og inkubere den ved stuetemperatur i en time. Derefter overføres reaktionsopløsningen til 20 milliliter forkølet methanol i et 50 milliliter konisk rør. Bland godt og inkubere natten over på minus 30 grader Celsius at udfælde proteiner.Centrifuge ved 4500 gange G og ved fire grader Celsius i 15 minutter for at pelletere proteinet udfældes. Pellets to gange med 20 milliliter forkølet methanol pr. vask. Dernæst aspirere supernatanten og re-suspendere protein pellet i fire milliliter re-suspension buffer.Overfør proteinets re-suspension i et nyt 15 milliliter konisk rør. Vask 50 mikroliter af streptavidin perler tre gange med PBS. Tilsæt de vaskede perler til proteinets re-suspension og inkuber opløsningen ved fire grader Celsius i tre timer på en lodret rotator ved en rotationshastighed på 20 omdr./min.Derefter vaskes perlerne sekventielt med hver vaskebuffer vist her. Re-suspendere de vaskede perler med 20 mikroliter af PBS og overføre dem til en ny 1,5 milliliter rør. Tilsæt 20 mikroliter af 2X protein loading buffer og behandle ved 95 grader Celsius i 10 minutter.Bearbejdet derefter proteinprøverne med SDS-PAGE, og plette dem med Coomassie Brilliant Blue som beskrevet i tekstprotokollen. I denne undersøgelse primære embryonale NSPC'er er udvidet og metabolisk mærket in vitro. Vellykket endotel co-kultur fører NSPC'er til at danne store ark-lignende kloner.Immunostaining med antistoffer afslører, at i klonen, de fleste af cellerne er Nestin positive NSPC'er, mens meget få er beta tubulin 3 positive neuronale celler. I modsætning hertil er procentdelen af Nestin positive celler og beta tubulin 3 positive neuronale celler i kloner dannet i ikke co-kultur system næsten den samme. Den kemiske reporter Ac4ManAz er en metabolisk analog og kan indarbejdes i den iboende protein sialylation vej.En optimeret mærkningskoncentration på 100 mikromolar til primære NSPC'er anvendes, og kombinatorisk vurdering af celledød angivet ved cellulær og kernemorfologi tyder på, at denne mærkningskoncentration ikke forårsager åbenlyse cytotoksiske virkninger og er i stand til effektivt at mærke NSPC'er. De ikke-nationale sikkerhedsinfektionsselskabers kloniske morfologi, selvfornyelses- og differentieringspotentiale i både endotelmedkulturen og det ikke-samkulturske system påvirkes ikke. Proteinprøver fremstillet af Ac4ManAz mærket kultur ved biotin bøjning og streptavidin perler rensning viser stærke Coomassie Brilliant Blå farvning signal i SDS-PAGE geler.I mellemtiden var der kun farvning baggrund og ikke-specifikke bindende signaler i baner lastet med protein prøver fra DMSO kontrolgruppe. Dette indikerer også ac4ManAz's effektive mærkning af NSPC'er. Ved forsøg på denne protokol skal alle de opløsninger, der er nødvendige for biocellulær reaktion, tilberedes frisk, og reaktionstiden bør kontrolleres stramt for at forhindre over af utilstrækkelig reaktion.Efter vores protokol strukturen af neuro stamceller beriget overflade glycan kan analyseres. Vores protokol af neurale stilk og progenitor celle beriget overflade proteiner ikke kun stige markører, men også spille vigtige funktioner på det hævede mønster rensning strategi og illustration af rigiditory signal kredsløb for denne cellepopulation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den neuroblast Assay: Et assay for generering og berigelse af neuronale progenitorceller fra Differentiering neural stamcelle Afkom anvendelse af flowcytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdering af cellecyklusprogression af neurale stam-og stamcelle i Mouse hjernens udvikling efter Genotoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af neurale Crest stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flowcytometri Protokoller for Surface og intracellulære Antigen Analyser af neurale Cell Typer

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Celle Sortering af neurale stam- og progenitorceller fra voksne mus subventrikulære Zone og Live-billeddannelse af deres cellecyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Udvikling af en raffineret protokol for Trans-scleral Subretinal Transplantation af menneskelige retinale Pigment epitel celler ind i rotte øjne

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

At identificere transskription faktor Olig2 genomisk bindingssteder i akut renset PDGFRα + celler ved lav-celle kromatin Immunoprecipitation sekventering analyse

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...