Name: identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan
Uploaded: 2019-09-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Abbildung 1B, 1C, 1E und 1F werden aus Bai reproduziert et al . 10 mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry. Wir danken Yi Hao im Labor von X. C. für die Schnitte. Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Nr. 91753206 bis Q. S. und X. C., Nr. 31371093 bis Q. S., und Nr. 21425204 und 21672013 bis X. C.).

Alle in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle wurden vom IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) der Tsinghua University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IACUC durchgeführt. Die Labortieranlage der Tsinghua University wurde von der AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) akkreditiert. Für die Inszenierung von Embryonen wurde der am Mittag des identifizierten Vaginalsteckers als Embryonaltag 0,5 (E0.5) berechnet.
<p class="...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells:+Units+of+Development,+Units+of+Regeneration,+and+Units+in+Evolution.">Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cells:+Generating+and+Regenerating+the+Brain.">Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li><li>Gal, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Morphological+Heterogeneity+of+Neural+Precursors+in+the+Mouse+Neocortical+Proliferative+Zones.">Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones.</a> Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).</li><li>Kawaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+defines+differential+progenitor+subclasses+in+mammalian+neurogenesis.">Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis.</a> Development. 135, 3113-3124 (2008).</li><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+neural+stem+cells.">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li><li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex.">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139, 1535-1546 (2012).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glial+Nature+of+Embryonic+and+Adult+Neural+Stem+Cells.">The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex.">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Biology+of+Neurogenesis:+Toward+an+Understanding+of+the+Development+and+Evolution+of+the+Neocortex.">The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycan+labeling-assisted+discovery+of+cell-surface+markers+for+primary+neural+stem+and+progenitor+cells.">Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells.</a> Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+CNS+cell+generation:+a+programmed+sequence+of+neuron+and+glial+cell+production+from+isolated+murine+cortical+stem+cells.">Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells.</a> Neuron. 28, 69-80 (2000).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan-based+interactions+involving+vertebrate+sialic-acid-recognizing+proteins.">Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins.</a> Nature. 446, 1023-1029 (2007).</li><li>Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Remodeling+of+Cell-Surface+Sialic+Acids:+Principles,+Applications,+and+Recent+Advances.">Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances.</a> ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).</li><li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Membrane+Proteins.">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li><li>Schmidt, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+Study+on+Mass+Spectrometry-Based+Analysis+of+the+Proteome+of+CD34+CD123++Progenitor+Cells+for+the+Identification+of+Potential+Targets+for+Immunotherapy+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia.</a> Proteomes. 6, (2018).</li><li>Crisan, M., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+Development.">The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development.</a> Development. 144, 4195-4195 (2017).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells.">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Cysteine+S-Glycosylation+Induced+by+Per-O-Acetylated+Unnatural+Monosaccharides+during+Metabolic+Glycan+Labeling.">Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2018).</li><li>Gry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+RNA+and+protein+expression+profiles+in+23+human+cell+lines.">Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines.</a> BMC Genomics. 10, 365 (2009).</li><li>Hennen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LewisX+Glycoprotein+Screen+Identifies+the+Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+1+(LRP1)+as+a+Modulator+of+Oligodendrogenesis+in+Mice.">A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).</li><li>O&#8217;Brian, C. A., Chu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReviewPost-translational+disulfide+modifications+in+cell+signaling&#8212;role+of+inter-protein,+intra-protein,+S-glutathionyl,+and+S-cysteaminyl+disulfide+modifications+in+signal+transmission.">ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling&#8212;role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission.</a> Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).</li><li>Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+proteomics+to+unravel+stem+cell+regulatory+mechanisms.">The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms.</a> Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).</li><li>Christensen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-specific+Post-translational+Modifications+of+Mouse+Osteopontin+Are+Associated+with+Different+Adhesive+Properties.">Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).</li><li>Yanagisawa, M., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+and+functions+of+glycoconjugates+in+neural+stem+cells.">The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells.</a> Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li></ol>

Oberflächenmarker werden häufig verwendet, um bestimmte Zelltypen in vitro und in vivo17,18zu beschriften und zu reinigen. Die Entdeckung von Oberflächenmarkern trägt wesentlich zur regenerativen Medizin und Stammzellforschung bei, indem molekulare Werkzeuge zur selektiven Anreicherung einer Stammzellpopulation aus normalen oder pathologischen Geweben und Kulturgerichten zur Verfügung gestellt werden, die eine gereinigte Zelle anbieten. Ressourcen für die k...

Neuronale Stammzellen sind definiert als eine multipotente Zellpopulation, die sich selbst erneuern kann, um einen Stammzellpool zu erhalten und sich in Neuronen und Glia zu differenzieren. Sie sind die wichtigsten Zelltypen im Nervensystem und können großes therapeutisches Potenzial in der regenerativen Medizin durch Zelltransplantation in kranke und verletzte Gehirnebieten 1,2. Mit der Entwicklung wird die neuronale Stammzellpopulation heterogen3,4, und der Anteil der neuronalen Stammzellen im Gehirn nimmt allmählich ab5. Im Allgemeinen befinden sich embryonale neuronale Stammzellen und andere neuronale Vorläuferzellen, kollektiv als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) bezeichnet, in den Keimzonen, der ventrikulären Zone und der subventrikulären Zone in Mäusen6. Im embryonalen Gehirn erzeugen neuronale Stammzellen Neuronen direkt oder indirekt über zwischengeschaltete Vorläuferzellen (IPCs) und bei einigen Arten durch die äußeren subventrikulären Zonenvorläufer (oRGs)7,8. Die spezifische molekulare Signatur, Morphologie, Lage in der Stammzellnische und Differenzierungspotenzial bestimmen die Rolle jedes Subtyps bei der Hirnorganogenese und klinischen Anwendungen9. Die derzeit verfügbaren Zelloberflächenmarker können jedoch verschiedene Subtypen von NSPCs nicht eindeutig unterscheiden und reinigen, was das Verständnis und die Nutzung dieser Subtypen einschränkt.
Die Identifizierung der primären NSPCs-Oberflächenmarker wird durch drei Haupthürden begrenzt. Die erste ist die begrenzte Zellanzahl von NSPCs im Gewebe, was es schwierig macht, Zelloberflächenproteinproben für eine gemeinsame Massenspektrometrieanalyse vorzubereiten. Die zweite Einschränkung ist die Schwierigkeit bei der Herstellung reiner Zellsubtypen zur Erzeugung subtypspezifischer Membranproteindaten. Die dritte Herausforderung schließlich ist das niedrige Verhältnis von Zelloberflächenproteinen in ganzen Zellproteinen, das ihre Nachweisempfindlichkeiten durch Massenspektrometrieanalyse behindert.
Um diese Probleme zu überwinden, entwickelten wir einen chemoprotemischen Ansatz zur selektiven Anreicherung und Identifizierung von Zelloberflächenproteinen in primären NSPCs durch metabolische Kennzeichnung der Sialoglycoproteine10. Um eine ausreichende Anzahl von NSPCs zu generieren, nutzten wir ein etabliertes Protokoll, um primäre embryonale NSPS in undifferenzierten Zuständen in vitro zu erweitern und zu erhalten, indem wir NSPCs mit Maushirn-Endothelzelllinien mit einer durchlässigen Unterstützung kokultieren. Matrixeinsatz(z.B. Transwell) System11. Im Gegensatz dazu erzeugen NPSCs, die allein ohne Endothelzellen kultiviert werden, eine differenzierte Nachkommenschaft11,12. So können Proteinproben aus diesen beiden Kultursystemen vergleichsweise analysiert werden, um Proteine zu identifizieren, die differenziell in NSPCs und differenzierten Neuronen exprimiert werden. Da die meisten Zelloberflächenproteine durch Sialinsäure13modifiziert werden, wurde der unnatürliche Sialinsäurevorläufer analog N-Azidoacetylmannosamin-Tetraacylatd (Ac4ManNAz) verwendet, um den intrinsischen Stoffwechselweg zu kapern, so dass endogene, neu synthetisierte Sialoglykane werden mit Azido-Gruppen beschriftet, wodurch ein chemischer Griff14erzeugt wird. Durch azido-alkyne-vermittelte bioorthogonale Reaktionen, die Biotin zu Sialoglycans konjugieren, können Zelloberflächenproteine visualisiert und zur proteomischen Identifizierung durch ein Streptavidin-gekoppeltes Fluorophor oder Matrix14angereichert werden.
Hier führen wir die Färbung der SDS-PAGE-Gelanalyse der Oberfläche sialoglycoproteome von NSPCs durch, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert sind und Zellen in einem Nicht-Kokultursystem differenzieren. Wir reinigen auch selektiv Oberflächensialoglycoproteome in den beiden Kultursystemen für den proteomischen Vergleich. Unser Protokoll, verglichen mit den traditionellen zentrifugationsbasierten Zelloberflächenreinigungsprotokollen15, erhöht die Extraktionswirksamkeit durch Reduzierung der Oberflächenproteinextraktionsverfahren durch spezifische Tag-Konjugation und Affinität reinigung. In der Zwischenzeit erhöht es die Extraktionsreinheit von Zelloberflächenproteinen auf der Grundlage der Prämisse, dass Sialylierung vor allem an den Zelloberflächenproteinen stattfindet. Obwohl endotheliale Faktoren die Differenzierung erweiterter NSPC nicht vollständig blockieren können, bietet die vergleichende Studie zwischen einer Kokultur und einer differenzierten Kultur eine bequeme Methode, um mit Stammzellen angereicherte Oberflächenproteine zu lokalisieren, ohne dass Proteine aus NPCs zu analysieren, die durch FACS16gereinigt werden. Wir glauben, dass dieser Ansatz auf Studien von Oberflächenproteinen in anderen Systemen mit den entsprechenden Modifikationen angewendet werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="879">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BEND3</td>
			<td style="width:283px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-229</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25030081</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17502048</td>
			<td>1 to 100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A7250</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Papain</td>
			<td style="width:283px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS003726</td>
			<td>10 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17504044</td>
			<td>1 to 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">basic Fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">PHG0261</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">15140122</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10099141</td>
			<td align="right">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">HBSS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tripsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DPBS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Transwell</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">158127</td>
			<td align="right">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sucrose</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS-PAGE loading buffer 2X</td>
			<td style="width:283px;">Solarbio</td>
			<td style="width:123px;">P1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">6-well plate</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tris-Glycine protein gel</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">xp00100box</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:283px;">Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">Rat-401</td>
			<td style="width:172px;">1 to 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-beta-tubulin III</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8860</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21121</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21143</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Albumin Bovine V</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Brij97</td>
			<td style="width:283px;">Aladdin</td>
			<td style="width:123px;">B129088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CuSO4</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">209198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">alkyne-biotin</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:123px;">TA105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BTTAA</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ac4ManNAz</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1084</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">9AzSia</td>
			<td style="width:283px;">synthesized in lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">sodium ascorbate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Methanol</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaCl</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Alexa Flour 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">S21374</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:123px;">60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:283px;">RWD Life Science Co.</td>
			<td style="width:123px;">970-00026-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">DNase I</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td>12 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">urea</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan

Neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) sind die zelluläre Basis für die komplexen Strukturen und Funktionen des Gehirns. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen in vivo und können isoliert und in vitroerweitert werden und dienen als wichtige Ressource für die Zelltransplantation, um Hirnschäden zu reparieren. NSPC sind jedoch heterogen und auf molekularer Ebene nicht klar definiert oder werden aufgrund des Fehlens spezifischer Zelloberflächenmarker gereinigt. Das vorgestellte Protokoll, das bereits berichtet wurde, kombiniert ein neuronal-endotheliales Kokultursystem mit einer metabolischen Glykan-Etikettierungsmethode, um das Oberflächen-Sialoglycoproteom der primären NSSPCs zu identifizieren. Das NSPC-endotheliale Kokultursystem ermöglicht die Selbsterneuerung und -erweiterung von primären NSPCs in vitround erzeugt eine ausreichende Anzahl von NSPCs. Sialoglycans in kultivierten NSPCs werden mit einem unnatürlichen Sialsäure-Metabolur-Reporter mit bioorthogonale funktionelle Gruppen. Durch den Vergleich der sialoglycoproteome aus sich selbst erneuernden NSPCs, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert wurden, mit der Differenzierung der neuronalen Kultur identifizieren wir eine Liste von Membranproteinen, die in NSPCs angereichert sind. Im Einzelnen umfasst das Protokoll: 1) Einrichtung einer NSPC-endotheliale Kokultur und NSPC-Differenzierungskultur; 2) Etikettierung mit Azidozucker pro-O-acetyliertem N-Azidoacetylmannosamin (Ac4ManNAz); und 3) Biotinkonjugation zu modifiziertem Sialoglycan zur Bildgebung nach Fixierung der neuronalen Kultur oder Proteinextraktion aus der neuronalen Kultur zur Massenspektrometrieanalyse. Anschließend werden die NSPC-angereicherten Oberflächenmarker-Kandidaten durch vergleichende Analyse von Massenspektrometriedaten sowohl aus dem erweiterten NSPC als auch aus differenzierten neuronalen Kulturen ausgewählt. Dieses Protokoll ist hochsensibel für die Identifizierung von Membranproteinen mit geringem Überfluss in den Ausgangsmaterialien und kann auf die Marker-Erkennung in anderen Systemen mit entsprechenden Modifikationen angewendet werden.

Das gesamte Verfahren zur In-vitro-Expansion und metabolischen Kennzeichnung primärer embryonaler NSPCs dauert 6 Tage (Abbildung 1A). Die Qualität der BEND3-Zelllinie und frisch isolierte primäre NSSSPCs sind der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment. BEND3-Zellen sind die Quelle von löslichen Faktoren, die die Selbsterneuerung und Proliferation von NSPCs stimulieren. Es sollte sichergestellt werden, dass die BEND3-Zellen frei von Kontamination sin...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Präsentiert wird hier ein Protokoll, das ein in vitro neural-endotheliales Kokultursystem und die metabolische Einbeziehung von Sialoglycan mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen kombiniert, um primäre neuronale Stamm- und Vorläuferzellen zu erweitern und ihre Oberfläche zu beschriften. sialoglycoproteinzur Bildgebung oder Massenspektrometrieanalyse von Zelloberflächenmarkern.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Neuronale Stamm- und Vorläuferzellen können sich selbst erneuern und sich in verschiedene neuronale Zelltypen differenzieren, unterstützen die Entwicklung des Nervensystems und bieten eine Ressource für die regenerative Medizin. Diese Zellen sind heterogen, und wir müssen ihre spezifischen Zelloberflächenmarker kennen, um eine gereinigte Zellpopulationen zu erhalten und ihre Funktionen zu verstehen. Unser Protokoll bietet eine einfache, empfindliche und effiziente Technik zur Analyse von Membranproteinen von primären neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen und hilft dabei, neuartige Oberflächenmarker für diese Zellen zu identifizieren.Der Hauptvorteil unseres Protokolls ist seine Fähigkeit, das Oberflächenproteom von primären neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen mit der verbesserten Empfindlichkeit und Spezifität direkt zu analysieren. Dies wird erreicht, indem sie durch Kokultur innerhalb von Endothelzellen in vitro und hochtractin intrintrinsischen Zellulation MAPK-ERK-Signalweg zur Kennzeichnung von Oberflächenporinen erweitert werden. Mit Poren-Pro-Modifikationen auf expandierende Stammzellen in vitro kann unser Protokoll leicht angewendet werden, um Oberflächenmarker anderer Stammzelltypen zu identifizieren.Um die Endothelzellen vorzubereiten, setzen Sie ein BEN3-Zellpellet aus einer 10 Zentimeter langen Petrischale bei 90%Konfluzmitzen mit neun Milliliter nBEN3-Zellmedium wieder auf. Fügen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in einen durchlässigen Stützeinsatz ein. Fügen Sie weitere zwei Milliliter BEN3 Medium pro Bohrgut in der unteren Kammer der Matrix hinzu.Weiter die Zellen für einen Tag bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid zu kulturieren. Einen Tag nach dem Beschichten der Zellen in den Einsätzen, saugen Sie das Medium vorsichtig an, zuerst aus der unteren Kammer und dann aus den Einsätzen. Waschen Sie das Gesicht der Einsätze dreimal mit vorgewärmtem DMEM.Waschen Sie die Außenfläche der Einsätze durch Spülen mit vorgewärmten DMEM. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter vorgewärmter AM in einen Einsatz ein. Übertragen Sie die Einsätze mit primären kortikalen Zellen in die Brunnen.Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 12 Stunden. Lösen Sie Ac4ManAz in DMSO auf, um eine Lagerkonzentration von 200 Millimolar zu erreichen. Rufen Sie die neuronal-endotheliale Cokulturplatte aus dem Inkubator ab.Fügen Sie jeder Unteren Kammer einen Mikroliter des Ac4ManAz-Lagers und 0,5 Mikroliter pro Einsatz in die Co-Kultur hinzu. Kultur die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Während die Zellen kultivieren, fügen Sie 100 Mikroliter RM pro Einsatz und 200 Mikroliter RM pro Bodenkammer hinzu, um die Endothel- und Nervenzellen jeden zweiten Tag wieder zu füttern.Entfernen Sie zunächst die Einsätze von den Co-Kulturplatten und aspirieren Sie das Kulturmedium von der Unterseite der Brunnen. Als nächstes waschen Sie die Nervenzellen einmal mit vorgewärmten PBS. Die PBS aus den Brunnen ansaugen und jeweils einen Milliliter eines vorgekühlten 4%Paraformaldehyds in PBS hinzufügen.Fixieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgekühlten PBS. Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie jeweils einen Milliliter frisch zubereiteten Biotin konjugierten Puffer 1 in jeden Brunnen ein.10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach den Reaktionspuffer aus den Brunnen ansaugen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Fügen Sie jedem Bohrkörper der Zellen einen Milliliter Färbepuffer hinzu und brüten Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.Als nächstes den Färbepuffer aus den Brunnen ansaugen und die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS waschen. Fügen Sie jedem Bohrkörper der Zellen einen Milliliter Sperrpuffer hinzu und brüten Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Sperrpuffer aus den Brunnen und fügen Sie jedem Bohrkörper einen Milliliter Primärantikörperlösung hinzu.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung aus den Brunnen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS.Aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen und fügen Sie jeweils einen Milliliter Sekundärantikörper hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Danach die Lösung aus den Brunnen aspirieren und die Zellen dreimal mit vorgekühltem PBS waschen.Bereiten Sie zunächst BTTAA-Cupricsulfat-Komplex 2, Vollprotein-Resuspensionspuffer, Proteinwaschpuffer 1, Proteinwaschpuffer 2 und Proteinwaschpuffer 3, wie im Textprotokoll beschrieben, vor. Entfernen Sie als Nächstes die Einsätze von den Co-Kultur-Platten. Das Kulturmedium aus den unteren Brunnen ansaugen und die Nervenzellen einmal mit vorgekühltem PBS waschen.Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 200 Mikroliter vorgekühlten RIPA-Puffer zu jedem Brunnen. Die Teller fünf Minuten auf Eis bebrüten und dann die Proteinlyse in 1,5 Milliliter-Röhren sammeln. Zentrifuge bei 12000 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellablagerungen zu pellet.Übertragen Sie den Überstand in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Kit gemäß den Herstelleranweisungen. Passen Sie dann die Proteinkonzentration auf ein Milligramm pro Milliliter an. Fügen Sie 100 Mikromolar-Alkyd-Biotin, 2,5 Millimolar-Natriumascorbat und 1XBTTAA-Cupricsulfat-Komplex 2 bis 1 Milliliter Proteinlyse hinzu.Mischen Sie die Lösung gut und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für eine Stunde. Danach die Reaktionslösung in 20 Milliliter vorgekühltes Methanol in einem 50 Milliliter konischen Rohr übertragen. Gut mischen und über Nacht bei minus 30 Grad Celsius brüten, um die Proteine auszufällen.Zentrifugieren Sie bei 4500 mal G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten, um das Protein auszufällen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 20 Milliliter n.A. vorgekühltem Methanol pro Wäsche. Als nächstes aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Proteinpellet in vier Millilitern Resuspensionspuffer wieder auf.Übertragen Sie die Protein-Resuspension in eine neue 15 Milliliter Konustube. Waschen Sie 50 Mikroliter Streptavidin Perlen dreimal mit PBS. Fügen Sie die gewaschenen Perlen in die Protein-Re-Suspension und inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius für drei Stunden auf einem vertikalen Rotator bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 20 Rpm.Danach die Perlen sequenziell mit jedem hier gezeigten Waschpuffer waschen. Die gewaschenen Perlen mit 20 MikroliterPBS wieder aufhängen und in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. 20 Mikroliter 2X Protein-Ladepuffer hinzufügen und bei 95 Grad Celsius 10 Minuten behandeln.Dann verarbeiten Sie die Proteinproben mit SDS-PAGE und färben Sie sie mit Coomassie Brilliant Blue, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie werden primäre embryonale NSPCs erweitert und metabolisch in vitro gekennzeichnet. Erfolgreiche endotheliale Co-Kultur führt NSPCs zu großen blattartigen Klonen.Immunostaining mit Antikörpern zeigt, dass im Klon die meisten Zellen Nestin-positive NSPCs sind, während nur sehr wenige Beta-Tubulin 3 positive neuronale Zellen sind. Im Gegensatz dazu ist der Prozentsatz der Nestin-positiven Zellen und Beta-Tubulin-3-positiven neuronalen Zellen in Klonen, die im Nicht-Kokultursystem gebildet werden, nahezu gleich. Der chemische Reporter Ac4ManAz ist ein metabolisches Analogund und kann in den intrinsischen Protein-Sialylierungsweg integriert werden.Eine optimierte Etikettierungskonzentration von 100 Mikromolaren für primäre NSPC wird verwendet und eine kombinatorische Auswertung des Zelltodes, die durch Zell- und Kernmorphologie angezeigt wird, legt nahe, dass diese Etikettierungskonzentration keine offensichtlichen zytotoxischen Wirkungen verursacht und nSPCs effizient kennzeichnen kann. Die klonale Morphologie, Selbsterneuerung und Differenzierungspotenzial von NSPCs sowohl im endotheliaalen Kokultur- als auch im Nicht-Kokultursystem sind nicht betroffen. Proteinproben, die aus der Ac4ManAz-gekennzeichneten Kultur durch Biotinkonjugation und Streptavidin-Perlenreinigung hergestellt werden, zeigen ein starkes Coomassie Brilliant Blue Färbesignal in SDS-PAGE Gelen.In den mit Proteinproben der DMSO-Kontrollgruppe beladenen Bahnen gab es zwischenzeitlich nur Färbehintergrund und unspezifische Bindungssignale. Dies weist auch auf die effiziente Kennzeichnung von NSPCs durch Ac4ManAz hin. Beim Versuch dieses Protokolls sollten alle Lösungen, die für die biozelluläre Reaktion benötigt werden, frisch vorbereitet und die Reaktionszeit streng kontrolliert werden, um eine unzureichende Reaktion zu verhindern.Nach unserem Protokoll kann die Struktur der Neurostammzell angereicherten Oberfläche Glycan analysiert werden. Unser Protokoll von neuronalen Stamm- und Vorläuferzell angereicherten Oberflächenproteinen erhöht nicht nur Marker, sondern spielt auch wichtige Funktionen auf der erhöhten Musterreinigungsstrategie und der Darstellung von starren Signalschaltungen für diese Zellpopulation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...