Name: identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan
Uploaded: 2019-09-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Figura 1b, 1C, 1e e 1F são reproduzidos a partir de Bai et al . 10 de com permissão da sociedade real de química. Agradecemos Yi Hao no laboratório de X. C. para edição de figura. Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (no. 91753206 para Q. S. e X. C., no. 31371093 para Q. S., e nos. 21425204 e 21672013 para X. C.).

Todos os protocolos animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo IACUC (Comitê institucional de cuidados e uso de animais) da Universidade de Tsinghua e realizados de acordo com as diretrizes do IACUC. A instalação de laboratório de animais na Universidade de Tsinghua foi credenciada pela AAALAC (Associação para avaliação e acreditação de laboratório de cuidados com animais internacionais). Para o estadiamento dos embriões, o meio-dia do tampão vaginal identificado foi calculado como dia embrionário...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells:+Units+of+Development,+Units+of+Regeneration,+and+Units+in+Evolution.">Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cells:+Generating+and+Regenerating+the+Brain.">Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li><li>Gal, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Morphological+Heterogeneity+of+Neural+Precursors+in+the+Mouse+Neocortical+Proliferative+Zones.">Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones.</a> Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).</li><li>Kawaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+defines+differential+progenitor+subclasses+in+mammalian+neurogenesis.">Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis.</a> Development. 135, 3113-3124 (2008).</li><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+neural+stem+cells.">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li><li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex.">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139, 1535-1546 (2012).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glial+Nature+of+Embryonic+and+Adult+Neural+Stem+Cells.">The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex.">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Biology+of+Neurogenesis:+Toward+an+Understanding+of+the+Development+and+Evolution+of+the+Neocortex.">The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycan+labeling-assisted+discovery+of+cell-surface+markers+for+primary+neural+stem+and+progenitor+cells.">Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells.</a> Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+CNS+cell+generation:+a+programmed+sequence+of+neuron+and+glial+cell+production+from+isolated+murine+cortical+stem+cells.">Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells.</a> Neuron. 28, 69-80 (2000).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan-based+interactions+involving+vertebrate+sialic-acid-recognizing+proteins.">Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins.</a> Nature. 446, 1023-1029 (2007).</li><li>Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Remodeling+of+Cell-Surface+Sialic+Acids:+Principles,+Applications,+and+Recent+Advances.">Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances.</a> ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).</li><li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Membrane+Proteins.">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li><li>Schmidt, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+Study+on+Mass+Spectrometry-Based+Analysis+of+the+Proteome+of+CD34+CD123++Progenitor+Cells+for+the+Identification+of+Potential+Targets+for+Immunotherapy+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia.</a> Proteomes. 6, (2018).</li><li>Crisan, M., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+Development.">The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development.</a> Development. 144, 4195-4195 (2017).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells.">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Cysteine+S-Glycosylation+Induced+by+Per-O-Acetylated+Unnatural+Monosaccharides+during+Metabolic+Glycan+Labeling.">Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2018).</li><li>Gry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+RNA+and+protein+expression+profiles+in+23+human+cell+lines.">Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines.</a> BMC Genomics. 10, 365 (2009).</li><li>Hennen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LewisX+Glycoprotein+Screen+Identifies+the+Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+1+(LRP1)+as+a+Modulator+of+Oligodendrogenesis+in+Mice.">A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).</li><li>O&#8217;Brian, C. A., Chu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReviewPost-translational+disulfide+modifications+in+cell+signaling&#8212;role+of+inter-protein,+intra-protein,+S-glutathionyl,+and+S-cysteaminyl+disulfide+modifications+in+signal+transmission.">ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling&#8212;role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission.</a> Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).</li><li>Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+proteomics+to+unravel+stem+cell+regulatory+mechanisms.">The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms.</a> Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).</li><li>Christensen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-specific+Post-translational+Modifications+of+Mouse+Osteopontin+Are+Associated+with+Different+Adhesive+Properties.">Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).</li><li>Yanagisawa, M., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+and+functions+of+glycoconjugates+in+neural+stem+cells.">The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells.</a> Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li></ol>

Os marcadores de superfície são comumente usados para rotular e purificar ostipos de célulasespecíficas in vitro e in vivo17,18. Descoberta de marcadores de superfície contribui grandemente para a medicina regenerativa e pesquisas de células-tronco, fornecendo ferramentas moleculares para enriquecer seletivamente uma população de células-tronco de tecidos normais ou patológicos e pratos de cultura, oferecendo uma célula purificada recurso para uso clí...

Células-tronco neurais são definidas como uma população de células multipotentes que podem se autorenovar para manter uma piscina de células-tronco e diferenciar-se em neurônios e glia. Eles são os principais tipos de células no sistema nervoso e podem oferecer grande potencial terapêutico na medicina regenerativa através da transplantação celular em cérebros doentes e feridos1,2. Como o desenvolvimentoprossegue, apopulação de células-tronco neural torna-se heterogênea3,4, ea proporção de células-tronco neurais no cérebro diminui gradualmente5. De modo geral, células-tronco neurais embrionárias e outras células progenitoras neurais, denominadas coletivamente de tronco neural e células progenitoras (nspcs), estão localizadas nas zonas germinais, na zona ventricular e na zona zona em camundongos6. No cérebro embrionário, as células-tronco neurais geram neurônios direta ou indiretamente através de células progenitoras intermediárias (ipcs), e em algumas espécies através dos progenitores da zona zona externa (orgs)7,8. A assinatura molecular específica, a morfologia, a localização no nicho de células-tronco e o potencial de diferenciação determinam o papel de cada subtipo na organogênese cerebral e nas aplicações clínicas9. No entanto, os marcadores de superfície de célula atualmente disponíveis não podem discriminar inequivocamente e purificar diferentes subtipos de NSPCs, limitando a compreensão e a utilização desses subtipos.
A identificação de marcadores de superfície primários de NSPCs é limitada por três grandes obstáculos. O primeiro é o número limitado de células NSPCs no tecido, dificultando a preparação de amostras de proteínas de superfície celular para análise de espectrometria de massas comum. A segunda limitação é a dificuldade na produção de subtipos de células puras para a geração de dados de proteínas de membrana subtipo-específicos. Finalmente, o terceiro desafio é a baixa proporção de proteínas de superfície celular em proteínas de células inteiras, o que dificulta suas sensibilidades de detecção por espectrometria de massas.
Para superar estes problemas, nós desenvolvemos uma aproximação chemoproteomic para enriquecer seletivamente e identificar proteínas de superfície da pilha em nspcs preliminares pela rotulagem metabolicamente as sialoglycoproteínas10. Para gerar um número suficiente de NSPCs, aproveitamos um protocolo estabelecido para expandir e manter NSPCs embrionários primários em Estados indiferenciados in vitro, por coculturando NSPCs com linhas celulares endoteliais cerebrais do camundongo usando um suporte permeável sistema de inserção da matriz (por exemplo, transwell)11. Em contrapartida, as npscs cultivadas isoladamente sem células endoteliais geram Progênese diferenciada11,12. Assim, amostras de proteínas desses dois sistemas de cultura podem ser analisadas comparativamente para identificar proteínas diferencialmente expressas em NSPCs e neurônios diferenciados. Como a maioria das proteínas de superfície celular são modificadas por ácido siálico13, não natural ácido siálico precursor analógico N-azidoacetilmannosamina-tetraacylated (AC4Mannaz) foi usado para seqüestrar a via metabólica intrínseca de modo que endógena, recém- sialoglicanos sintetizados são marcados com grupos azido, gerando um punho químico14. Com as reações do azido-alkyne-negociadas, que conjugar a biotina aos sialoglycans, as proteínas de superfície da pilha podem ser visualizadas e enriquecidas para a identificação proteômica com um fluoróforo streptavidin-acoplado ou uma matriz14.
Aqui, nós realizamos a mancha da análise do gel de SDS-PAGE do sialoglycoproteome de superfície dos NSPCs expandidos em uma cocultura endotelial e em pilhas diferenciando-se em um sistema da não-cocultura. Nós igualmente seletivamente purificar o sialoglycoproteome de superfície nos dois sistemas da cultura para a comparação proteômica. Nosso protocolo, comparado com os protocolos tradicionais da purificação de superfície da pilha da centrifugação-baseada15, aumenta a eficácia da extração reduzindo os procedimentos de extração da proteína de superfície com a conjugação e a afinidade específicas do Tag Purificação. Entretanto, aumenta a pureza da extração de proteínas de superfície da pilha baseadas na premissa que o sialylation acontece na maior parte nas proteínas de superfície da pilha. Embora os fatores endothelial não possam completamente obstruir a diferenciação de NSPCs expandidos, o estudo comparativo entre uma cocultura e uma cultura diferenciada fornece um método conveniente para identificar proteínas de superfície pilha-enriquecidas da haste sem a necessidade de analisar proteínas de NPCs purificadas por FACS16. Acreditamos que essa abordagem pode ser aplicada a estudos de proteínas superficiais em outros sistemas com as modificações apropriadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="879">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BEND3</td>
			<td style="width:283px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-229</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25030081</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17502048</td>
			<td>1 to 100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A7250</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Papain</td>
			<td style="width:283px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS003726</td>
			<td>10 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17504044</td>
			<td>1 to 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">basic Fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">PHG0261</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">15140122</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10099141</td>
			<td align="right">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">HBSS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tripsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DPBS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Transwell</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">158127</td>
			<td align="right">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sucrose</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS-PAGE loading buffer 2X</td>
			<td style="width:283px;">Solarbio</td>
			<td style="width:123px;">P1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">6-well plate</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tris-Glycine protein gel</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">xp00100box</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:283px;">Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">Rat-401</td>
			<td style="width:172px;">1 to 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-beta-tubulin III</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8860</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21121</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21143</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Albumin Bovine V</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Brij97</td>
			<td style="width:283px;">Aladdin</td>
			<td style="width:123px;">B129088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CuSO4</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">209198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">alkyne-biotin</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:123px;">TA105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BTTAA</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ac4ManNAz</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1084</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">9AzSia</td>
			<td style="width:283px;">synthesized in lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">sodium ascorbate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Methanol</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaCl</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Alexa Flour 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">S21374</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:123px;">60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:283px;">RWD Life Science Co.</td>
			<td style="width:123px;">970-00026-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">DNase I</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td>12 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">urea</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan

A haste neural e as células progenitoras (NSPCs) são a base celular para as complexas estruturas e funções do cérebro. Eles estão localizados em nichos especializados in vivo e podem ser isolados e expandidos in vitro, servindo como um importante recurso para o transplante de células para reparar danos cerebrais. No entanto, os NSPCs são heterogêneos e não claramente definidos no nível molecular ou purificados devido à falta de marcadores específicos de superfície celular. O protocolo apresentado, que foi relatado previamente, combina um sistema neural-endothelial da cocultura com um método metabólico da rotulagem do glicana para identificar o sialoglycoproteome de superfície de nspcs preliminares. O sistema de cocultura NSPC-endotelial permite a autorenovação e expansão de NSPCs primários in vitro, gerando um número suficiente de nspcs. os Sialoglicanos em nspcs cultivados são rotulados usando um repórter metabólico de ácido siálico não natural com grupos funcionais bioortogonais. Comparando o sialoglycoproteome dos NSPCs Self-renovando expandidos em uma cocultura endothelial com diferenciação da cultura neural, nós identificamos uma lista de proteínas da membrana que são enriquecidas em NSPCs. Em detalhe, o protocolo envolve: 1) set-up de uma cocultura NSPC-endotelial e de uma cultura de diferenciação de NSPC; 2) rotulagem com azidoaçúcar por-O-acetilado N-azidoacetilmannosamina (AC4Mannaz); e 3) conjugação de biotina ao sialoglicíno modificado para imagem após fixação da cultura neural ou extração protéica da cultura neural para análise de espectrometria de massas. Em seguida, os candidatos a marcadores de superfície enriquecidos com NSPC são selecionados por análise comparativa de dados de espectrometria de massas tanto do NSPC expandido quanto de culturas neurais diferenciadas. Este protocolo é altamente sensível para identificar proteínas da membrana da baixa abundância nos materiais de partida, e pode ser aplicado à descoberta do marcador em outros sistemas com modificações apropriadas

Todo o procedimento para expansão in vitro e rotulagem metabólica de NSPCs embrionários primários demora 6 dias (Figura 1a). A qualidade da linha celular BEND3 e os NSPCs primários recém-isolados são fundamentais para uma experiência bem-sucedida. As células BEND3 são a fonte de fatores solúveis que estimulam a autorenovação e a proliferação de NSPCs. Deve-se garantir que as células BEND3 estejam livres de qualquer contaminação e se dividam ...

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Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Aqui apresentamos um protocolo que combina um sistema de cocultura neural-endotelial in vitro e incorporação metabólica de sialoglicano com grupos funcionais bioortogonais para expandir as células primárias de tronco neural e progenitoras e rotular sua superfície sialoglycoproteínas para a análise da imagem latente ou da massa-espectrometria de marcadores da superfície da pilha.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

As células neurais e progenitoras podem se auto-renovar e se diferenciar em diferentes tipos de células neurais, apoiando o desenvolvimento do sistema nervoso e oferecendo um recurso para medicina regenerativa. Essas células são heterogêneas, e precisamos conhecer seus marcadores de superfície celular específicos para obter populações celulares purificadas e entender suas funções. Nosso protocolo fornece uma técnica simples, sensível e eficiente para analisar proteínas de membrana de células-tronco neurais primárias e progenitoras, ajudando a identificar novos marcadores de superfície para essas células.A principal vantagem do nosso protocolo é sua capacidade de analisar diretamente o proteome superficial das células neurais primárias e progenitoras com a sensibilidade e especificidade melhoradas. Isso é conseguido expandindo-os através da co-cultura dentro de células endoteliais in vitro e alta trato de células intrínsecas MAPK-ERK caminho para rotular porinas superficiais. Com as pró-modificações poros na expansão de células-tronco in vitro, nosso protocolo pode ser facilmente aplicado para identificar marcadores superficiais de outros tipos de células-tronco.Para preparar as células endoteliais, suspenda-se uma pelota de célula BEN3 de uma placa de Petri de 10 centímetros a 90% de confluência com nove mililitros de meio celular BEN3. Adicione um mililitro da suspensão celular em uma inserção de suporte permeável. Adicione mais dois mililitros de médio BEN3 por poço na câmara inferior da matriz.Continue a cultivar as células por um dia a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Um dia depois de emplacar as células nas pastilhas, aspire suavemente o meio, primeiro a partir da câmara inferior e depois das pastilhas. Lave a face das pastilhas três vezes com DMEM pré-aquecido.Lave a superfície externa das pastilhas enxaguando com DMEM pré-aquecido. Em seguida, adicione um mililitro de AM pré-aquecido em uma única inserção. Transfira as pastilhas para os poços com células corticais primárias.Incubar a cocultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas. Dissolver Ac4ManAz em DMSO para alcançar uma concentração de estoque de 200 mililitros. Recupere a placa de cocultura neural-endotelial da incubadora.Adicione um microliter do estoque Ac4ManAz a cada câmara inferior e 0,5 microliters por inserção na cocultura. Cultura as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco dias. Enquanto as células estão criando adicionar 100 microliters de RM por inserção e 200 microliters de RM por câmara inferior para re-alimentar as células endoteliais e neurais a cada dois dias.Primeiro remova as pastilhas das placas de cocultura e aspire o meio de cultura do fundo dos poços. Em seguida, lave as células neurais uma vez com PBS pré-aquecido. Aspire o PBS dos poços e adicione um mililitro de um pré-refrigerado 4% de deído em PBS para cada poço.Conserte as células em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado. Aspire o PBS e adicione um mililitro de tampão conjugado de biotina recém-preparado 1 em cada poço.Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, aspire o tampão de reação dos poços e lave as células três vezes com PBS. Adicione um mililitro de tampão de coloração a cada poço de células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, aspire o tampão de coloração dos poços e lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado. Adicione um mililitro de tampão de bloqueio a cada poço de células e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o tampão de bloqueio dos poços e adicione um mililitro da solução de anticorpos primários a cada poço.Incubar as células durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a solução primária de anticorpos dos poços. Lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado.Aspire o PBS dos poços e adicione um mililitro de anticorpo secundário a cada poço. Incubar as células em temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, aspire a solução dos poços e lave as células três vezes com PBS pré-refrigerado.Primeiro, prepare o complexo de sulfato cupérico BTTAA 2, tampão de re-suspensão de proteínas completa, tampão de lavagem de proteínas 1, tampão de lavagem de proteínas 2 e tampão de lavagem de proteínas 3, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, remova as pastilhas das placas de co-cultura. Aspire o meio de cultura dos poços inferiores e lave as células neurais uma vez com PBS pré-refrigerado.Aspire o PBS e adicione 200 microliters de tampão RIPA pré-refrigerado a cada poço. Incubar as placas no gelo por cinco minutos e coletar a lise proteica em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar a 12.000 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar os detritos celulares.Transfira o supernante para novos tubos de 1,5 mililitro e determine a concentração de proteínas com um kit BCA de acordo com as instruções dos fabricantes. Em seguida, ajuste a concentração de proteína para um miligrama por mililitro. Adicione 100 biotina de alquila micromolar, 2,5 milimonas de sódio ascorbate e 1XBTTAA complexo de sulfato cupric 2 a um mililitro de lise proteica.Misture bem a solução e incuba-a à temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, transfira a solução de reação em 20 mililitros de metanol pré-resfriado em um tubo cônico de 50 mililitros. Misture bem e incubar durante a noite a menos 30 graus Celsius para precipitar as proteínas.Centrifugar a 4500 vezes G e a 4 graus Celsius por 15 minutos para pelotar os precipitados da proteína. Lave a pelota duas vezes usando 20 mililitros de metanol pré-resfriado por lavagem. Em seguida, aspire o supernasciente e suspenda a pelota de proteína em quatro mililitros de tampão de re-suspensão.Transfira a re-suspensão da proteína para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Lave 50 microliters de contas streptavidin três vezes com PBS. Adicione as contas lavadas à re-suspensão da proteína e incubar a solução a quatro graus Celsius por três horas em um rotador vertical a uma velocidade de rotação de 20 rpm.Depois disso, lave as contas sequencialmente com cada tampão de lavagem mostrado aqui. Suspenda as contas lavadas com 20 microlitrais de PBS e transfira-as para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 20 microliters de tampão de carga de proteína 2X e trate a 95 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, processe as amostras de proteína com SDS-PAGE e manche-as com Coomassie Brilliant Blue, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, os NSPCs embrionários primários são expandidos e metabolicamente rotulados in vitro. Co-cultura endotelial bem sucedida leva os NSPCs a formar grandes clones semelhantes a folhas.Imunostaining com anticorpos revela que no clone, a maioria das células são NSPCs positivos de Nestin, enquanto muito poucas são células neuronais beta tubulina 3 positivas. Em contraste, a porcentagem de células positivas nestin e beta tubulin 3 células neuronais positivas em clones formados em sistema não-co-cultura são quase as mesmas. O repórter químico Ac4ManAz é um analógico metabólico e pode ser incorporado na via de sialylation de proteínas intrínsecas.Uma concentração otimizada de rotulagem de 100 micromolalares para NSPCs primários é usada e a avaliação combinatória da morte celular indicada pela morfologia celular e nuclei sugere que essa concentração de rotulagem não causa efeitos citotóxicos óbvios e é capaz de rotular insplicados eficientemente. A morfologia clonal, a autoconexão e o potencial de diferenciação dos NSPCs tanto na cocultura endotelial quanto no sistema não-cocultura não são afetados. Amostras de proteínas preparadas a partir da cultura rotulada Ac4ManAz por conjugação de biotina e purificação de contas streptavidin mostram forte sinal de coloração Coomassie Brilliant Blue em géis SDS-PAGE.Enquanto isso, havia apenas o fundo de coloração e sinais de ligação não específicos nas pistas carregadas com amostras de proteínas do grupo controle DMSO. Isso também indica a rotulagem eficiente de NSPCs pelo Ac4ManAz. Ao tentar este protocolo, todas as soluções necessárias para a reação biocelular devem ser preparadas recentemente e o tempo de reação deve ser controlado firmemente para evitar uma reação insuficiente.Seguindo nosso protocolo, a estrutura da célula neuro-tronco enriquecida glicano pode ser analisada. Nosso protocolo de tronco neural e células progenitoras enriqueceu proteínas superficiais não apenas marcadores de aumento, mas também desempenha funções importantes na estratégia de purificação de padrões elevados e na ilustração de circuitos de sinal rígido para esta população celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Neurociência

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Avaliação da progressão do ciclo celular de células-tronco neurais e células progenitoras no cérebro de camundongos em desenvolvimento após estresse genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identificação de Sítios de Ligação Genômica do Fator de Transcrição Olig2 em Células PDGFRα+ Purificadas por Análise de Sequenciamento de Imunoprecipitação de Cromatina de Poucas Células

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...