Name: identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan
Uploaded: 2019-09-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Figur 1b, 1c, 1e och 1f återges från Bai et al . 10 med tillstånd från Kungliga kemi förbundet. Vi tackar Yi Hao i X. C. ' s Lab för figur redigering. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation i Kina (nr 91753206 till Q. S. och X. C., nr 31371093 till Q. S., och nr 21425204 och 21672013 till X. C.).

Alla djur protokoll som används i denna studie godkändes av IACUC (institutionella djuromsorg och användning kommittén) av Tsinghua University och utförs i enlighet med riktlinjer för IACUC. Laboratorie djuret anläggningen vid Tsinghua University har ackrediterats av AAALAC (Association för bedömning och ackreditering av laboratoriedjur omsorg International). För iscensättning av embryon, mitt på dagen av vaginalpluggen identifierats beräknades som embryonala dag 0,5 (E 0.5).
<str...

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells:+Units+of+Development,+Units+of+Regeneration,+and+Units+in+Evolution.">Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cells:+Generating+and+Regenerating+the+Brain.">Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li><li>Gal, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Morphological+Heterogeneity+of+Neural+Precursors+in+the+Mouse+Neocortical+Proliferative+Zones.">Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones.</a> Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).</li><li>Kawaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+profiling+defines+differential+progenitor+subclasses+in+mammalian+neurogenesis.">Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis.</a> Development. 135, 3113-3124 (2008).</li><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+neural+stem+cells.">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li><li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex.">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139, 1535-1546 (2012).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Glial+Nature+of+Embryonic+and+Adult+Neural+Stem+Cells.">The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li><li>Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+subtype+of+progenitor+cell+in+the+mouse+embryonic+neocortex.">A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex.</a> Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).</li><li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cell+Biology+of+Neurogenesis:+Toward+an+Understanding+of+the+Development+and+Evolution+of+the+Neocortex.">The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).</li><li>Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycan+labeling-assisted+discovery+of+cell-surface+markers+for+primary+neural+stem+and+progenitor+cells.">Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells.</a> Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+CNS+cell+generation:+a+programmed+sequence+of+neuron+and+glial+cell+production+from+isolated+murine+cortical+stem+cells.">Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells.</a> Neuron. 28, 69-80 (2000).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan-based+interactions+involving+vertebrate+sialic-acid-recognizing+proteins.">Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins.</a> Nature. 446, 1023-1029 (2007).</li><li>Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Remodeling+of+Cell-Surface+Sialic+Acids:+Principles,+Applications,+and+Recent+Advances.">Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances.</a> ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).</li><li>Lin, S. H., Guidotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Membrane+Proteins.">Purification of Membrane Proteins.</a> Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).</li><li>Schmidt, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+Study+on+Mass+Spectrometry-Based+Analysis+of+the+Proteome+of+CD34+CD123++Progenitor+Cells+for+the+Identification+of+Potential+Targets+for+Immunotherapy+in+Acute+Myeloid+Leukemia.">Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia.</a> Proteomes. 6, (2018).</li><li>Crisan, M., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity+Development.">The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development.</a> Development. 144, 4195-4195 (2017).</li><li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+human+central+nervous+system+stem+cells.">Direct isolation of human central nervous system stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).</li><li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+Cysteine+S-Glycosylation+Induced+by+Per-O-Acetylated+Unnatural+Monosaccharides+during+Metabolic+Glycan+Labeling.">Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2018).</li><li>Gry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+RNA+and+protein+expression+profiles+in+23+human+cell+lines.">Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines.</a> BMC Genomics. 10, 365 (2009).</li><li>Hennen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LewisX+Glycoprotein+Screen+Identifies+the+Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+1+(LRP1)+as+a+Modulator+of+Oligodendrogenesis+in+Mice.">A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).</li><li>O&#8217;Brian, C. A., Chu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ReviewPost-translational+disulfide+modifications+in+cell+signaling&#8212;role+of+inter-protein,+intra-protein,+S-glutathionyl,+and+S-cysteaminyl+disulfide+modifications+in+signal+transmission.">ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling&#8212;role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission.</a> Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).</li><li>Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+proteomics+to+unravel+stem+cell+regulatory+mechanisms.">The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms.</a> Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).</li><li>Christensen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Type-specific+Post-translational+Modifications+of+Mouse+Osteopontin+Are+Associated+with+Different+Adhesive+Properties.">Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).</li><li>Yanagisawa, M., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+and+functions+of+glycoconjugates+in+neural+stem+cells.">The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells.</a> Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li></ol>

Ytmarkörer används ofta för att märka och rena specifika celltyper in vitro och in vivo17,18. Upptäckten av ytmarkörer bidrar i hög grad till regenerativ medicin och stamcells forskning genom att tillhandahålla molekylära verktyg för att selektivt berika en stamcells population från normala eller patologiska vävnader och kultur rätter, som erbjuder en renad cell resurs för klinisk användning eller studiet av biologiska egenskaper. Framstegen med at...

Neurala stamceller definieras som en multipotenta cellpopulation som kan förnyas för att bibehålla en stamcellspool och differentieras till nervceller och glia. De är de stora celltyperna i nervsystemet och kan erbjuda stor terapeutisk potential i regenerativ medicin genom celltransplantation till sjuka och skadade hjärnor1,2. Som utveckling fortsätter, den neurala stamceller befolkningen blir heterogena3,4, och andelen av neurala stamceller i hjärnan minskar gradvis5. Generellt sett, embryonala neurala stamceller och andra neurala stamceller, kallas kollektivt neurala stamceller och stamceller (NSPCs), finns i de embryon zoner, ventrikulär zon, och subventrikulär zon i möss6. I den embryonala hjärnan, neurala stamceller generera nervceller direkt eller indirekt genom mellanliggande stamceller (IPCS), och i vissa arter genom den yttre subventrikulär zon progenitorer (oRGs)7,8. Den specifika molekylära signatur, morfologi, lokalisering i stamceller nisch, och differentiering potential alla bestämma vilken roll varje subtyp i hjärnans organogenes och kliniska tillämpningar9. De tillgängliga cell ytmarkörerna kan dock inte entydigt diskriminera och rena olika undertyper av NSPCs, vilket begränsar förståelsen och utnyttjandet av dessa undertyper.
Identifieringen av primära NSPCs-ytmarkörer begränsas av tre stora hinder. Den första är den begränsade cellantal NSPCs i vävnaden, vilket gör det svårt att förbereda cell ytan protein prover för vanliga masspektrometri analys. Den andra begränsningen är svårigheten att producera rena cell undertyper för att generera subtypspecifika membranprotein data. Slutligen är den tredje utmaningen den låga kvoten av cellytproteiner i hela cellproteiner, vilket hämmar deras detektionskänslighet genom masspektrometrianalys.
För att övervinna dessa problem, utvecklade vi en chemoproteomic metod för att selektivt berika och identifiera cellyta proteiner i primära NSPCs genom metaboliskt märkning av sialoglykoproteiner10. För att generera ett tillräckligt antal nspcs, drog vi fördel av ett etablerat protokoll för att expandera och underhålla primära embryonala nspcs i odifferentierade tillstånd in vitro, genom Co-culturing nspcs med mus hjärnan endotelcelllinjer med hjälp av en genomsläpplig stöd Matrix INSERT (t. ex. transwell) system11. I motsats, npscs odlade ensam utan endotelceller generera differentierade avkomma11,12. Sålunda, protein prover från dessa två kultur system kan vara jämförelsevis analyseras för att identifiera proteiner som är differentially uttrycks i NSPCs och differentierade nervceller. Eftersom de flesta cell ytan proteiner modifieras av sialic Acid13, onaturliga sialic Acid föregångare analog N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC4mannaz) användes för att kapa den inneboende metaboliska vägen så att endogena, nyligen syntetiserade sialoglycans är märkta med azid grupper, generera ett kemiskt handtag14. Genom azido-alkyne-medierade biologiska ortogonala reaktioner, som konjugera biotin till sialoglycans, kan cellytproteiner visualiseras och berikas för proteomisk identifiering genom en streptavidin-kopplad fluorophore eller Matrix14.
Här utför vi färgning av SDS-PAGE gel analys av ytan sialoglykoproteome från NSPCs expanderat i en endotelial samodling och differentiera celler i en icke-Co-kultur system. Vi rengör också selektivt ytan sialoglykoproteome i de två kultur system för proteomisk jämförelse. Vårt protokoll, jämfört med den traditionella centrifugering-baserade cell ytan renings protokoll15, ökar utvinning effektivitet genom att minska ytan protein utvinning förfaranden genom specifika tagg konjugering och samhörighet Rening. Samtidigt ökar det utvinning renhet cell ytan proteiner bygger på förutsättningen att sialylation sker mestadels på cellytan proteiner. Även om endoteliala faktorer inte helt kan blockera differentiering av expanderade NSPCs, är den jämförande studien mellan en samkultur och differentierad kultur en praktisk metod för att lokalisera stamceller-berikade ytproteiner utan att behöva analysera proteiner från NPCs renade av FACS16. Vi anser att detta tillvägagångssätt kan tillämpas på studier av ytproteiner i andra system med lämpliga modifieringar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:880px;" width="879">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BEND3</td>
			<td style="width:283px;">ATCC</td>
			<td style="width:123px;">CRL-229</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25030081</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5280</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17502048</td>
			<td>1 to 100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A7250</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Papain</td>
			<td style="width:283px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS003726</td>
			<td>10 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">17504044</td>
			<td>1 to 50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">basic Fibroblast growth factor</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">PHG0261</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">15140122</td>
			<td align="right">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">10099141</td>
			<td align="right">10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">HBSS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tripsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DPBS</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Transwell</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">158127</td>
			<td align="right">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Sucrose</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:283px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:123px;">62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS-PAGE loading buffer 2X</td>
			<td style="width:283px;">Solarbio</td>
			<td style="width:123px;">P1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">6-well plate</td>
			<td style="width:283px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:123px;">3335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tris-Glycine protein gel</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">xp00100box</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:283px;">Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">Rat-401</td>
			<td style="width:172px;">1 to 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">mouse monoclonal anti-beta-tubulin III</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T8860</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21121</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A-21143</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Albumin Bovine V</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:283px;">Amresco</td>
			<td style="width:123px;">0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Brij97</td>
			<td style="width:283px;">Aladdin</td>
			<td style="width:123px;">B129088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">CuSO4</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">209198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">alkyne-biotin</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td style="width:123px;">TA105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">BTTAA</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Ac4ManNAz</td>
			<td style="width:283px;">Click Chemistry Tools</td>
			<td align="right" style="width:123px;">1084</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">9AzSia</td>
			<td style="width:283px;">synthesized in lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">sodium ascorbate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Methanol</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:123px;">34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">EDTA</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">NaCl</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SDS</td>
			<td style="width:283px;">Sangon</td>
			<td style="width:123px;">A100227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Alexa Flour 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">S21374</td>
			<td>1 to 1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triethanolamine</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">V900257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:283px;">invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:123px;">60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td style="width:283px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:123px;">20278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:283px;">RWD Life Science Co.</td>
			<td style="width:123px;">970-00026-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:303px;">DNase I</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">DN25</td>
			<td>12 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">urea</td>
			<td style="width:283px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying cell surface markers of primary neural stem and progenitor cells by metabolic labeling of sialoglycan

Neurala stamceller och progenitorceller (NSPCs) är den cellulära grunden för komplexa strukturer och funktioner i hjärnan. De är belägna i specialiserade nischer in vivo och kan isoleras och utvidgas in vitro, som fungerar som en viktig resurs för celltransplantation för att reparera hjärnskador. Emellertid, NSPCs är heterogena och inte klart definierade på molekylär nivå eller renas på grund av brist på specifika cell ytan markörer. Det protokoll som presenteras, som tidigare har rapporterats, kombinerar en neural-endotelial Co-Culture system med en metabolisk glykananalys märkningsmetod för att identifiera ytan sialoglykoproteome av primära nspcs. NSPC-endotelial Co-Culture-systemet möjliggör självförnyelse och expansion av primära NSPCs in vitro, vilket genererar ett tillräckligt antal nspcs. Sialoglycans i odlade nspcs är märkta med en onaturlig sialic Acid metabolisk reporter med bioortogonala funktionella grupper. Genom att jämföra sialoglykoproteome från självförnyande NSPCs expanderat i en endotelial Co-kultur med differentierande neural kultur, identifierar vi en lista över membranproteiner som är berikade i NSPCs. Protokollet omfattar i detalj: 1) uppsättning av en NSPC-endotelial samkultur och NSPC-differentierande kultur. 2) märkning med azidosugar per-O-acetylerade N-azidoacetylmannosamin (AC4mannaz); och 3) biotin konjugation till modifierad sialoglycan för avbildning efter fixering av neurala kulturen eller protein utvinning från neurala kulturen för masspektrometri analys. Sedan, den NSPC-berikad yta markör kandidater väljs genom jämförande analys av masspektrometri data från både den expanderade NSPC och differentierade neurala kulturer. Detta protokoll är mycket känsligt för att identifiera membranproteiner med låg förekomst i utgångsmaterialen, och det kan appliceras på markör identifiering i andra system med lämpliga modifieringar

Hela förfarandet för in vitro-expansion och metabolisk märkning av primära embryonala NSPCs tar 6 dagar (figur 1a). Kvaliteten på BEND3-celllinjen och nyligen isolerade primära NSPCs är nyckeln till ett lyckat experiment. BEND3 celler är källan till lösliga faktorer som stimulerar självförnyelse och spridning av NSPCs. Det bör säkerställas att de BEND3 cellerna är fria från kontaminering och dela aktivt med minimal celldöd innan Co-odling me...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan at JoVE.com

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Presenteras här är ett protokoll som kombinerar en in vitro -neural-endotelial Co-Culture system och metabolisk inkorporering av sialoglycan med bioorthogonal funktionella grupper för att expandera primära neurala stamceller och stamceller och märka deras yta sialoglykoproteiner för avbildning eller masspektrometri analys av cell ytan markörer.

Identifiera cell ytan markörer av primära neurala stamceller och stamceller genom metabolisk märkning av Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Neurala stamceller och stamceller kan själv förnya och differentiera till olika neurala celltyper, stödja nervsystemets utveckling och erbjuda en resurs för regenerativ medicin. Dessa celler är heterogena, och vi behöver veta deras specifika cellytan markörer för att få en renad cell populationer och förstå deras funktioner. Vårt protokoll ger en enkel, känslig och effektiv teknik för att analysera membranproteiner av primära neurala stamceller och stamceller, hjälper till att identifiera nya ytmarkörer för dessa celler.Den största fördelen med vårt protokoll är dess förmåga att direkt analysera ytan proteom av primära neurala stamceller och stamceller med den förbättrade känsligheten och specificiteten. Detta uppnås genom att expandera dem genom samkultur inom endotelceller in vitro och hög tractin inneboende cellulation MAPK-ERK väg att märka yta poriner. Med porpro-modifieringar på expanderande stamceller in vitro kan vårt protokoll enkelt appliceras för att identifiera ytmarkörer av andra stamcellstyper.För att förbereda endotelcellerna, åter upphäva en BEN3 cell pellet från en 10 centimeter Petriskål vid 90%sammanflödet med nio milliliter ben3 cell medium. Lägg till en milliliter av cellupphängningen i ett genomsläppligt stödskär. Tillsätt ytterligare två milliliter BEN3 medium per brunn i matrisens nedersta kammare.Fortsätt att odla cellerna för en dag vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. En dag efter plätering cellerna i skären, försiktigt aspirera mediet, först från botten kammaren och sedan från skären. Tvätta ansiktet på skären tre gånger med förvrevd DMEM.Tvätta skärens yttre yta genom att skölja med förvrevd DMEM. Därefter lägger du till en milliliter färdigvarad AM i ett skär. Överför skären i brunnarna med primära kortikala celler.Inkubera samkulturen vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i 12 timmar. Lös upp Ac4ManAz i DMSO för att uppnå en lagerkoncentration på 200 millimolar. Hämta den neurala endotheliala samkulturplattan från inkubatorn.Lägg till en mikroliter av Ac4ManAz-lagret till varje bottenkammare och 0,5 mikroliter per insats i samkulturen. Odla cellerna vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i fem dagar. Medan cellerna är culturing lägga 100 mikroliter RM per insats och 200 mikroliter RM per botten kammare för att åter mata endotel och neurala celler varannan dag.Ta först bort skären från samkulturplattorna och aspirera odlingsmediet från brunnarnas botten. Nästa tvätta neurala celler en gång med förvvämda PBS. Aspirera PBS från brunnarna och tillsätt en milliliter av en förkyld 4%paraformaldehyd i PBS till varje brunn.Fixera cellerna i rumstemperatur i 10 minuter. Tvätta sedan cellerna tre gånger med förkyld PBS. Aspirera PBS och tillsätt en milliliter nyberedda biotin konjugerad buffert 1 i varje brunn.Inkubera i rumstemperatur i 10 minuter. Efter detta aspirera reaktionsbufferten från brunnarna och tvätta cellerna tre gånger med PBS. Tillsätt en milliliter färgningsbuffert till varje brunn av celler och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.Därefter aspirera infärgningsbufferten från brunnarna och tvätta cellerna tre gånger med förkyld PBS. Tillsätt en milliliter blockerande buffert till varje brunn av celler och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter. Ta bort den blockerande bufferten från brunnarna och tillsätt en milliliter primär antikroppslösning till varje brunn.Inkubera cellerna över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, ta bort den primära antikroppslösningen från brunnarna. Tvätta cellerna tre gånger med förkyld PBS.Aspirera PBS från brunnarna och tillsätt en milliliter sekundär antikropp till varje brunn. Inkubera cellerna i rumstemperatur i två timmar. Efter detta aspirera lösningen från brunnarna och tvätta cellerna tre gånger med förkyld PBS.Först, förbereda BTTAA kuvrisk sulfat komplex 2, full protein åter fjädring buffert, protein tvätt buffert 1, protein tvätt buffert 2 och protein tvätt buffert 3 som beskrivs i textprotokollet. Därefter tar du bort skären från samkulturplattorna. Aspirera odlingsmediet från bottenvälnerna och tvätta neuralcellerna en gång med förkyld PBS.Aspirera PBS och tillsätt 200 mikroliter av pre-kyld RIPA buffert till varje brunn. Inkubera plattorna på is i fem minuter och samla sedan in proteinlysen i 1,5 milliliterrör. Centrifug vid 12000 gånger G och vid fyra grader Celsius i 10 minuter för att pelleta cellen skräp.Överför supernatanten till nya 1,5 milliliterrör och bestäm proteinkoncentrationen med en BCA-sats enligt tillverkarnas anvisningar. Justera sedan proteinkoncentrationen till ett milligram per milliliter. Tillsätt 100 mikromolar alkyd biotin, 2,5 millimolar natriumaskorbat och 1XBTTAA kulat sulfatkomplex 2 till en milliliter proteinlys.Blanda lösningen väl och inkubera den i rumstemperatur i en timme. Efter detta överför reaktionslösningen till 20 milliliter förkyld metanol i ett koniskt rör på 50 milliliter. Blanda väl och inkubera över natten vid minus 30 grader Celsius för att fälla ut proteinerna.Centrifug vid 4500 gånger G och vid fyra grader Celsius i 15 minuter för att pelletera proteinet fällningar. Tvätta pelleten två gånger med 20 milliliter förkyld metanol per tvätt. Därefter aspirera supernatanten och återuppstäng proteinpelleten i fyra milliliter av re-suspension buffert.Överför proteinet åter fjädring till en ny 15 milliliter koniska röret. Tvätta 50 mikroliter streptavidin pärlor tre gånger med PBS. Tillsätt de tvättade pärlorna till proteinet åter fjädring och inkubera lösningen vid fyra grader Celsius i tre timmar på en vertikal rotator med en rotationshastighet på 20 rpm.Efter detta tvätta pärlorna sekventiellt med varje tvättbuffert som visas här. Åter upphäva de tvättade pärlorna med 20 mikroliter PBS och överför dem till ett nytt 1,5 milliliterrör. Tillsätt 20 mikroliter 2X protein lastning buffert och behandla vid 95 grader Celsius i 10 minuter.Sedan bearbeta proteinproverna med SDS-PAGE och fläcka dem med Coomassie Brilliant Blue som beskrivs i textprotokollet. I denna studie primära embryonala NSPCs expanderas och metaboliskt märkt in vitro. Framgångsrika endotelsamkultur leder NSPCs att bilda stora ark-liknande kloner.Immunostaining med antikroppar avslöjar att i klon, de flesta av cellerna är Nestin positiva NSPCs, medan mycket få är beta tubulin 3 positiva neuronala celler. Däremot är andelen Nestin positiva celler och beta tubulin 3 positiva neuronala celler i kloner som bildas i icke-odlingssystem nästan samma. Den kemiska reportern Ac4ManAz är en metabolisk analog och kan införlivas i den inneboende protein sialylation vägen.En optimerad märkning koncentration av 100 mikromolar för primära NSPCs används och combinatory utvärdering av celldöd indikeras av cellulära och kärnor morfologi tyder på denna märkning koncentration inte orsakar uppenbara cytotoxiska effekter och kan effektivt märka NSPCs. Den klonal morfologi, självförnyelse och differentiering potential NSPCs i både endotelsamkultur och icke-co-kultur systemet påverkas inte. Proteinprover som utarbetats från Ac4ManAz märkt kultur genom biotin konjugering och streptavidin pärlor rening visar stark Coomassie Brilliant Blue färgning signal i SDS-PAGE geler.Under tiden fanns det endast färgning bakgrund och icke-specifika bindande signaler i körfält lastade med protein prover från DMSO kontrollgruppen. Detta indikerar också effektiv märkning av NSPCs av Ac4ManAz. Vid försök till detta protokoll bör alla lösningar som behövs för biocellulär reaktion beredas nyligen och reaktionstiden bör kontrolleras hårt för att förhindra över av otillräcklig reaktion.Efter vårt protokoll strukturen av neurostamcell berikad yta glycan kan analyseras. Vårt protokoll av neural stam och stamcell berikade ytan proteiner inte bara stiga markörer men också spela viktiga funktioner på den upphöjda mönster rening strategi och illustration av rigiditory signal kretsar för denna cellpopulation.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-kolonibildande Cell-analys: en analys att diskriminera Bona Fide neuronala stamceller från neurala stamceller

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Uppskatta cellcykelprogression av neurala stam och progenitorceller i musen framkallande hjärnan efter genotoxisk stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder fria Härledning av neurallisten progenitorceller från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flödescytometri protokoll för Surface och intracellulära Antigen Analyser av neurala celltyper

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Cell Sortering av neurala stamceller och progenitorceller från vuxen mus subventrikulära zonen och Live-avbildning av sina cellcykeln Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Utveckling av ett raffinerat protokoll för Trans-skleral Subretinal Transplantation av mänskliga Retinal Pigment epitelceller i råtta ögon

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Att identifiera transkription faktorn Olig2 genomisk bindningsställen i akut renat PDGFRα + celler av låg-cell kromatin Immunoprecipitation sekvensering analys

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...