Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المجلس الوطني للأبحاث الطبية سنغافورة التابعة لوزارة الصحة ونمرك CBRG15may017 وسنغافورة وزارة التعليم، 2014-T2-1-136 (إلى N.R.J.G.).

<ol>
	<li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development.">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li><li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers.">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).</li><li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&amp;#34;self&amp;#34;+in+T-cell+activation.">A role for &amp;#34;self&amp;#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li><li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation.">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li><li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC.">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling.">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development.">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling.">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development.">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li><li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+human+autoimmunity:+current+practice+and+future+prospects.">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li><li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity.">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li><li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate.">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li><li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li><li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation.">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).</li><li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules.">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants.">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li><li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis.">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li><li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry.">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li><li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase,+2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+(LY294002).">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors.">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li><li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine,+K-252+and+UCN-01:+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases.">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li><li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2,3-Bisarylmaleimides.">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li><li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1.">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li><li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A.">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li><li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel compounds. , (2003).</li><li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase.">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li><li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway.">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors.">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).</li><li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts.">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li><li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+neonatal+thymus:+evidence+for+a+transient+thymic+involution.">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li><li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus.">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li><li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and/or+IFN-gamma-producing+CD4++and+CD8++T+cells.">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li><li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+ADMET.">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li></ol>

صاحب البلاغ كه يينغ كيان هو موظف كوريو النظم البيولوجية، التي تنتج خلية دا غسالة ولوحات دا-الخلية المستخدمة في هذه المقالة.

فحص الاستراتيجية المقترحة هنا يقيم قدرة مثبطات جزيء صغير لقمع آثار أبوبتوتيك في الثيموسيه بعد التحفيز، بالإضافة إلى علامات أكثر تقليدية تي خلية التنشيط-CD69 أوبريجوليشن وتكر downregulation . يمكن أيضا إدراجها علامات إضافية لتمكين تحليل ثيموسيتي مختلف المجموعات الفرعية32. جانبا مثيرة لاهتمام في التحليل الحالي تكمن في حقيقة أن مثبطات تعوق تكر مما يشير إلى أن يضعف أيضا تنظيم دورات تعريفية للمبرمج، كذلك تسليط الضوء على التمييز من تكر مستقلة الآثار التي قد تترتب مثبطات في الحث على موت الخلايا. وعلاوة على ذلك، يسمح فحص الخلوي-القائم على التدفق باستخدام قراءات متعددة كعلامات مميزة التنشيط، التي يمكن أن التقرير آثار مثبطات في فروع فردية منفصلة من إشارات تكر. وفي الحالة المعروضة هنا، كانت هناك مثبطات التي أظهرت تثبيط تفاضلية لتفعيل caspase-3 و CD69 upregulation. نظراً لأن بعض المركبات قد تؤثر على وظائف التدبير المنزلي مثل البروتين أو الاتجار حويصلية، ليس من المستغرب لمراقبة آثار على upregulation من حيثياته توليف علامات (مثلاً، CD69) ولكن ليس على بوستترانسلاشونال تعديلات (مثلاً، تفعيل caspase-3 بروتيوليتيك).
المقايسة المقدمة هنا تدابير المبرمج كقراءات، من المحتم أن آثار السمية الكامنة مثبطات لا يحجب النتائج. على سبيل المثال، في الشاشة، ونحن لا تضعف staurosporine تتجاوز 1 نانومتر، على الرغم من كونها لا تزال السامة للخلايا في هذا التركيز. النتائج التمثيلية الاتفاق مع staurosporine كونه مثبط كيناز منحل ومحفِّز للمبرمج33. دون إضعاف المركبات اختبار غير سام بتركيزات كافية، فمن الممكن نتغاضى عن الزيارات المحتملة.
فحص استراتيجية مفصلة هنا سيكون من الصعب أن تطبق على البشر بسبب المضاعفات المرتبطة بالحصول على عدد كاف من الثيموسيه للفرز الفائق. ومع ذلك، من الممكن الحصول على العينات البشرية الغدة الصعترية من خزعات طب القلب34،35 أو من الأجنة36،37. ومع ذلك، كإشارات تكر مسارات وتسلسل الأحماض الأمينية مما يشير إلى البروتينات هي المحافظة إلى حد كبير بين الفئران والبشر، الإنزيم ثيموسيتي يوفر استراتيجية فرز أولية مفيدة، والحصول على أية نتائج مع هذا التحليل باستخدام الماوس يمكن، بعد ذلك، التحقق من نمو في الخلايا الليمفاوية البشرية الأساسية.
واحد الحد من البروتوكول تعتمد على الطرد المركزي التقليدية تتعلق باحتمال فقدان الخلية، التي يمكن أن تعزى إلى طبيعة متعددة الخطوات العملية التي تنطوي على خطوات مثل بيرميبيليزيشن الخلية والطرد المركزي. كل الطرد المركزي واستثارة خطوة لا محالة يؤدي إلى فقدان الخلايا. في حين أن هذه الخسائر قد لا تكون حاسمة بالنسبة للدراسات التي تنطوي على عدد محدود من العينات، يمكن أن تشكل مشاكل عند تطبيقها في الفحص أعلى من الناتج، وبخاصة كما تقدم تنسيق المقايسة من 96-إلى 384-إلى 1536-جيدا. طريقة واحدة للتحايل على هذه المشكلة من خلال استخدام أجهزة الاستشعار caspase نيون نفاذية الخلية38 التي تمكن من الكشف عن تفعيل caspase مع تجنب المضاعفات الناجمة عن بيرميبيليزيشن الخلية ومتعددة يغسل5. بدلاً من ذلك، تستخدم أسلوب الطرد المركزي المستقل لغسل الخلايا بالتدفق الصفحي أيضا الممكنة للتقليل إلى أدنى حد من الخسائر في الخلية. مع صفيحة الآلي الغسيل محطة بالاقتران مع لوحة الجدار أقل، تغسل الخلايا بالتدفق الصفحي دون استخدام أجهزة الطرد المركزي. أسي إضعاف الكواشف يتيح الشطف شامل وفعال للخلايا في أقل من 3 دقائق، الذي يمثل إضعاف ما يعادل مجموعتين من الغسيل الطرد المركزي. دون الخارجية تؤكد سبب الطرد المركزي، الخلايا أكثر قابلية للاستمرار وخلية الخسائر إلى أدنى حد.
ونحن أيضا استكشاف إمكانية استخدام لوحة الآلي الغسيل محطة بعد استزراع الثيموسيه في 96-جيدا U-أسفل اللوحات، وأيضا، استزراع الخلايا مباشرة في لوحات الحائط أقل متوافقة مع لوحة الآلي الغسيل محطة. استزراع الخلايا في لوحات الحائط-أقل ممكناً القضاء على جميع الخطوات الطرد المركزي والتقليل من فقدان الخلية من خلال القضاء على الحاجة إلى نقل عينة عبر لوحات. وبصفة عامة، قابلة للمقارنة في الكفاءة التحفيز وتلطيخ ثلاثة بروتوكولات مختلفة. توفر محطة الغسيل الآلي الاستفادة من الأتمتة، وسرعة وكفاءة، مما يجعل من الأسهل للتحليل ارتفاع الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، مع زيادة التشغيل الآلي، يمكن القيام بالخطوات الغسيل أسرع، وهناك قدر أكبر من اتساق بين تجارب أو المجربون. بيد أن المحطة الغسيل ببعض العوائق: كميات كبيرة من الغسيل المخازن المؤقتة مطلوبة لغسالة فتيلة (150 مل كل تغيير المخزن المؤقت، الذي يستخدم 50 مل للغسيل)؛ يلزم الحذر عند التعامل مع اللوحة لتجنب أي تلوث الصليب من الآبار بسبب تقسيم محدودة بين الآبار للوحة صغيرة الحجم؛ المخزن المؤقت المتبقية من 25 ميليلتر في الآبار بعد الغسيل يتطلب استخدام الكواشف التي أعدت في أعلى من تركيز 1 x. لمعالجة قضايا الحجم المتبقي وقدرة الحجم المحدود اللوحة، يمكن إضافة ملحق لتوسيع حجم حاضنات من ميليلتر 70 إلى 150 ميليلتر، تيسير اعتماد البروتوكولات التقليدية. في حين نظم مناولة لوحة الآلي متاحة حاليا، لديهم بصمة كبيرة بالمقارنة مع نظام الغسيل طبقية، ووحدة صغيرة من ~ 1 قدم مكعب (~0.028 م3). علاوة على ذلك، إدماج الطرد المركزي في لوحة الآلي نظم معالجة صعبة، يحد من استخدامها في الخلية الغسيل. لا يوجد حاليا لا خلية أخرى مستقلة عن أجهزة الطرد المركزي غسل الأدوات المتاحة، وبقدر ما نعلم.
فحص الاستراتيجية المعروضة هنا قادرة على تحديد الجزيئات الصغيرة، وعلى مؤنزم الهدف المزعوم، التي تؤثر على إشارات تكر وتنشيط خلايا تي. المكتبة المستخدمة هنا تتألف أساسا من مؤنزم مثبطات جزيء صغير وقادرة على توليد عدد من يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام مرات. البروتوكول يمكن أيضا سهولة تطبيقها إلى مكتبات مثبط إنزيم الطبقات الأخرى أو إلى أنواع أخرى من الجزيئات الصغيرة، فضلا عن المكتبات من مركبات أخرى (مثلاً، الجزيئات المختلفة). يمكن أيضا استخدام البروتوكول شاشة أخرى أنواع الخلايا، مثل الخلايا اللمفية تي هامشية أو مخلدة الخلايا، بما في ذلك الإعراب عن تكرس المحورة وراثيا أو تنفيذ نظم مراسل. تحديد ووصف وسطاء جديدة من إشارات يمكن تحسين معرفتنا بمسار الإشارات وأيضا المساعدة في تطوير العلاج المستهدفة في مأمن من الأمراض13،،من1415، تي خلية 16-في كل شيء، تضيف هذه الدراسة على مجموعة الخيارات المتاحة للكشف عن الوسطاء من تي خلية إرسال الإشارات عن طريق الفرز الفائق فحوصات.

خلايا T هي نسب للخلايا اللمفاوية التي تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على مناعة التكيفية. وهم يعربون عن تكر، التي تسمح لهم بالتعرف على يغاندس، مجمعات تتكون من جزيء هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية المعقدة (MHC) مع ببتيد منضم، التي توجد على أسطح مستضد-عرض الخلايا (Apc). تحريك تكر مما يشير إلى المسار عن طريق التفاعل تكر/MHC أمرا حاسما لتنشيط خلايا تي والتنمية1.
تي خلية التنمية، المشتقة من نخاع العظام الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) تهاجر إلى الغدة الصعترية، حيث تخضع للتمايز وتذهب من خلال مراحل تطور نسب تي خلية2. الثيموسيه (DP) إيجابية مزدوجة، إذ تعرب عن كوريسيبتورس كل من خلايا CD4 و CD8، الدخول مع المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/MHC على المصفحتين. الثيموسيه ن بهم يغاندس المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/MHC مع المعتدلين ناضجة لتصبح الثيموسيه (SP) CD4 أو CD8 إيجابية واحدة، عملية توصف بالتحديد الإيجابي. على العكس من ذلك، تخضع الثيموسيه التي تلقي التحفيز تكر المفرط عن طريق المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/مهكس المبرمج عن طريق الانتقاء السلبي3،4. يمكن أن تكون هذه العملية من المبرمج الناجمة عن التحفيز، وتعتمد على كاسباسي تحاكي في المختبر بحفز نمو، على سبيل المثال مع الخرز المغلفة بالأجسام المضادة-CD3/285. يتم تنشيط خلايا تي الناضجة التي تمر بعملية التحديد من يغاندس غير-الذاتي-الببتيد/MHC من ناقلات الجنود المدرعة في المحيط. المتمتعة بالحكم الذاتي-الببتيد/مكس لا تزال ذات الصلة لخلايا تي الطرفية، في سياق منشط إشارة للبقاء على قيد الحياة وانتشار التماثل الساكن، والتفريق بين خلايا تي مساعد، وتعزيز الاستجابات تي خلية لغير-الذاتي-الببتيد/مكس من خلال كواجونيسم6،7،،من89. عالية تقارب تكر ملزمة ليجند الببتيد/MHC ينشط عدة مسارات إشارات المصب، التي تنطوي على العديد من الجزيئات مما يشير إلى تشكيل تكر معقدة إشارات الشبكة10. مسارات إشارات تكر قد درست لعدة عقود، وبعد اكتشاف الوسطاء الجديد المسار يظهر أي علامة على التراجع11،12. تحوير تكر مسارات الإشارات أهميتها السريرية ويمكن أن تنطوي على قد تي خلية الاستجابات للطلبات إيمونوثيرابيوتيك أو تثبيط الاستجابات تي خلية لمراقبة المناعة الذاتية13. استراتيجيات لتحوير الردود تي خلية تعتمد أساسا على تعطل كيناز أو الفوسفاتيز النشاط14،،من1516.
يصف لنا طلبا مقايسة على أساس التدفق الخلوي لفحص المركبات الكيميائية الصغيرة لقدرتها على تعدل الإشارات تكر وتي خلية التنشيط17. المقايسة يتوقف على ظاهرة نمو تنشيط المسار المبرمج عند التعرض لإشارات تكر قوية. المقايسة حساسة بما فيه الكفاية التعرف على التغيرات في قوة التحفيز؛ حضانة الثيموسيه معربا عن تكر المحورة وراثيا مع tetramers الببتيد/MHC مع زيادة تقارب أدت إلى زيادة مقابلة في كاسباسي التنشيط المستخدمة كتدبير من تدابير الاستجابة apoptotic5. على الشاشة، واستخدمنا مكتبة مثبطات كيناز وتقييم قدرتها على تعدل ثيموسيتي استجابة لإشارات تكر قوية.
وقد وصف العديد من الاستراتيجيات القائمة على التدفق الخلوي أو المستندة إلى المحرر الأسفار للفرز الفائق لمجموعة متنوعة من التنشيط الطرفية تعمل في مجموعات فرعية تي خلية مختلفة. وتشمل هذه الاستراتيجيات استخدام الصحفيين الفلورسنت الوراثية تقييم التوقيت وحجم تي خلية التنشيط18، استخدام تحبب كقراءات من نشاط خلايا T السامة للخلايا19،20، والتحليل الفسفرة بروتينات المختلفة المشاركة في الخلوية مما يشير إلى21.
الفحص فحص المعروضة هنا غير قادرة على تحديد المركبات التي تمنع الجزيئات الكنسي تكر إشارات الطريق، فضلا عن المركبات المحتملة، ورواية مع الآثار المثبطة على إشارات تكر بنجاح. على سبيل المثال، حددنا مثبطات GSK3β و Hsp90 كالمركبات الجديدة التي تؤثر على استجابات تي خلية17. المقايسة غير قادرة على التمييز بين الموانع التي تتداخل مع توصيل الإشارة، إلى انخفاض في استجابة أبوبتوتيك، من آثار مثبطات تكر مستقلة عن السمية الخلوية. بالإضافة إلى تنظيم دورات تعريفية للمبرمج، نحن أيضا قياس أوبريجوليشن CD69 وتكر downregulation كعلامات للتنشيط. كما تكر إشارات شبكات معقدة، يمكن استخدام قراءات متعددة زيادة فرص اكتشاف الجزيئات ذات آثار محددة على مسار واحد. هنا، نحن نقدم أيضا استخدام بروتوكول مستقل عن الطرد المركزي كبديل الفائق للبروتوكول الأصلي أثناء تلطيخ الخلايا في التحضير لتحليل تدفق سيتوميتريك. الفحص المبينة في هذه الورقة يستخدم مكتبة مجمع صغير من مثبطات كيناز ولكن، من حيث المبدأ، يمكن استخدامه لفحص إنتاجية أعلى. يمكن أن تتضمن المكتبة لاختيار أيضا مجموعة متنوعة من مثبطات أو جزيئات أخرى.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

إشارات مستقبلات خلايا تي (تكر) مما يشير إلى مسار يضم العديد من الوسطاء أن يحيل على تفعيل تكر. تم اقتراح استراتيجيات مختلفة وتنفيذها للتعرف على الوسطاء جديدة من إشارات تكر، الذي من شأنه تحسين فهم العمليات تي خلية، بما في ذلك تفعيل واختيار الغدة الصعترية. يصف لنا مقايسة فرز التي تمكن من تحديد الجزيئات التي تؤثر على إشارات تكر استناداً إلى تنشيط تطوير الثيموسيه. إشارات "قوية تكر" يتسبب الثيموسيه النامية لتفعيل إليه أبوبتوتيك في عملية تعرف بالتحديد السلبي. من خلال تطبيق مثبطات كيناز، تلك الأهداف التي تؤثر على إشارات تكر قادرون على تجاوز عملية الانتقاء السلبي. يمكن استخدام الأسلوب بالتفصيل في هذه الورقة لتحديد مثبطات مؤنزم المتعارف عليه مع الأدوار المحددة في مسارات إشارات تكر ومثبطات مؤنزم جديدة بعد أن تقام في مسارات إشارات تكر أيضا. يمكن تطبيق استراتيجية الفرز هنا للشاشات لإنتاجية أعلى لتحديد أهداف دروجابل الرواية في إشارات تكر.

ويلخص الشكل 1Aنهج المقايسة الفرز. تم فحص مثبطات كيناز أولاً للتأثيرات الكامنة على البقاء ثيموسيتي. واستخدمت كعنصر إيجابي للمبرمج، الديكساميتازون كعامل بروابوبتوتيك. النابضة للسكان خلية حية مصممة استناداً إلى عناصر سلبية غير المعالجة وعناصر إيجابية تعامل الديكساميتازون (الشكل 1B). جرى اختبارها مثبطات أولاً في 10 ميكرون على الثيموسيه، وتم قياس النسبة المئوية للخلايا قادرة على البقاء بعد حضانة ح 18. تم اختيار نافذة 20% لموت الخلية أن المركبات التي التي يسببها أكبر من 20% فقدان الخلايا في بوابة الخلية حية، مقارنة بالعينات المعالجة [دمس]، جرى اختبارها في تركيزات أقل (الشكل 1B). يتم إظهار الممثل مؤامرات نظام مراقبة الأصول الميدانية لعينات مختارة المعالجة بمثبطات لتوضيح مقايسة البقاء. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one؛ CAS 154447-36-6) و PI3K المانع22، لم يزدد كثيرا موت الخلية في 10 ميكرون، والمانع كان يستخدم في 10 ميكرون لفحوصات لاحقة. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide؛ CAS 1202884-94-3) ومثبط مزدوج من23من PI3Kα/mTOR، التي يتسبب فيها مستويات عالية من موت الخلايا في 10 ميكرون وعلى 1 ميكرومتر ولكن ليس على 0.1 ميكرومتر، و 0.1 ميكرومتر عاقدة العزم على أن يكون تركيز مناسب للتطبيق في فحوصات المتلقين للمعلومات. ستوروسبوريني (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one؛ CAS 62996-74-1)، مثبط عموم بروتين كيناز ج مع قدرة المنشأة على حمل24من المبرمج، الناجمة عن موت الخلية كبيرة في تركيزات كل اختبار، حتى في 0.1 ميكرومتر. استخدامه في الاختبارات اللاحقة في 0.1 ميكرومتر كعنصر إيجابي إضافي.
واختيرت تركيزات النهائي مثبطات استناداً إلى تركيزات أعلى حيث أنهم عدم تضخيم موت الخلية بأكثر من 20 في المائة من العينات المعالجة [دمس]. مع تركيزات مثبطات العزم النهائي، أعد لوحة أسهم من مثبطات مثل أن جميع الموانع كانت 500 مرة تركيز عند تطبيقها على الخلايا. ويوضح الشكل 1 تخطيط لوحة لوحة الأسهم، مع تركيزات النهائي مثبطات. في البروتوكول بديلة لحضانة الخلايا مباشرة في لوحات صغيرة الحجم لتدفق الصفحي الغسيل المقايسة، استلزم استخدام كميات صغيرة أخرى إضعاف مثبطات. لضمان أن المحتوى [دمس] ثقافات بعد إضافة مثبطات لن عالية جداً للخلايا، مثبطات كانت كذلك تضعف في ربمي كاملة، بمعامل تخفيف من 5، أن كانوا في 100 مرة تركيز المقصود عند تطبيقه على الخلايا.
مثبطات، المخفف لتركيزات غير سام، استخدمت في المقايسة لتحفيز المستحثة تكر المبرمج في الثيموسيه5،17. التحفيز أجريت باستخدام الخرز المضادة-CD3/CD28 ح 18، وكانت ملطخة الخلايا فيما بعد لتفعيل caspase-3 في خلايا CD4+ و CD8+ DP ثيموسيتي السكان (الشكل 2). زيادة تفعيل caspase-3 والتعبير CD69، وأيضا downregulation تكر، لوحظت في مكافحة-CD3/CD28-حفز و [دمس]-موك-تعامل العينات المضادة-CD3/28-حفز، مقارنة بالعينات نونستيمولاتيد. الديكساميتازون تعامل العينات أظهرت زيادة في تفعيل caspase-3 مستقلة عن أوبريجوليشن CD69، الذي يتوقع من التأثير الذي يحفز المبرمج مستقل لتحفيز تكر.
الشكل 3 ألف يلخص نتائج المكتبة فحص المقايسة لمثبطات المحدد. يمكن استخدام كل من CD69 وتفعيل caspase-3 تحديد الموانع المحتملة من الاهتمام نظراً لقمع التعبير. كما هو متوقع، وأظهرت مثبطات للوسطاء المتعارف عليه من إشارات تكر كالزيارات إيجابية في الشاشات. وشملت هذه الموانع، التي أظهرت فاعلية المثبطة بدرجات متفاوتة، مثبطات واسعة الطيف التي تستهدف مؤنزم متعددة، وأيضا، أكثر مثبطات محددة. وكانت بعض مثبطات قادرة على قمع تفعيل caspase-3 وأوبريجوليشن CD69 (الشكل 3B، الصف العلوي، لوحات الأيسر). واحد مثل هذا المانع بيسيندوليلماليميدي الثاني (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione؛ CAS 137592-45-1)، مما يحول دون جميع isoforms البروتين كيناز ج، بالإضافة إلى البروتين كيناز ألف و PDK125،،من2627. مثبط آخر في هذه الفئة هو CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide؛ CAS 494772-86-0)، مثبط المقترحة من IKK228.
وكانت هناك المركبات التي تحول دون أوبريجوليشن CD69 ولكن لا تنتقص من تفعيل caspase-3 (الشكل 3B، الصف العلوي، لوحات الحق). CAY10626، مثبطات PI3Kα و mTOR23، و U-0126 (2 و 3-مكررا [الأمينية [(2-aminophenyl) الايثير] الميثيلين]--بوتانيدينيتريلي؛ CAS 109511-58-2)، مثبط لمجاهدى خلق29، كانت بعض الموانع التي تم تحديدها. وتبين النتائج أن مثبطات مختلفة تستهدف مؤنزم مختلفة من فروع محددة مسار الإشارات تكر، لا سيما تلك التي تستهدف مؤنزم المرحلة المتأخرة، يمكن أن تسفر عن إعاقة انتقائية من الظواهر تي خلية التنشيط.
وكانت هناك أيضا مثبطات عدم قمع كل من أوبريجوليشن CD69 وتفعيل caspase-3 (الشكل 3B، الصف السفلي، ولوحات الأيسر). باكليتاكسيل (βS-(بينزويلامينو)-αR-هيدروكسي-حمض بينزينيبروبانويك، (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 ، إستر 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl؛ CAS 33069-62-4)، disruptor microtubule ديناميات30، ونيكروستاتين-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile؛ CAS 337349-54-9)، مثبطات RIP1 كيناز31، هما مثبطات المحددة في هذه الفئة. في مثل هذه الحالات لم تكن البصر حيث أوبريجوليشن CD69 وتفعيل caspase-3، هذا يمكن أن يكون سبب مثبطات لا تستهدف كيناز ذات صلة تكر مما يشير إلى المسار.
وكما ذكر آنفا، استخدمت ستاوروسبوريني في الشاشات، بتركيز لا يزال الناجمين عن المبرمج في نمو. كما هو متوقع، أظهرت العينة تعامل staurosporine مستويات عالية من تفعيل caspase-3 (الشكل 3B، الصف السفلي، والعمود الأيسر). يمكن أن يعزى انخفاض مستويات التعبير CD69 إلى تثبيط توسط staurosporine PKC، كما بيسيندوليلماليميدي الثاني، آخر PKC عموم مثبط، قمعت أيضا التعبير عن CD69. بدلاً من ذلك، ستوروسبوريني التي يسببها المبرمج في الخلايا قبل أن يتمكن أوبريجولاتي التعبير CD69.
لزيادة الإنتاجية والتشغيل الآلي للبروتوكول، تم إعداد البروتوكولات المتوازية التي تنطوي على استخدام صفيحة الآلي الغسيل النظام عن طريق تدفق الصفحي. وكانت البروتوكولين منفصلة باستخدام هذا الجهاز الغسيل الآلي لوحة تجربته ومقارنة بالأسلوب التقليدي لاستزراع الخلايا في لوحات 96-جيدا وتلطيخ الخلايا في بروتوكول تعتمد على الطرد المركزي. أسلوب واحد يشارك استزراع الخلايا في لوحات 96-كذلك، ووفقا للإجراءات المعتادة، ونقل الخلايا إلى لوحات متوافقة مع الغسالة لوحة الآلي لتلطيخ الخطوات ثم، (الشكل 4، دا غسل العينات). وتشارك طريقة أخرى استزراع الخلايا في لوحات لوحة الغسالة المتوافقة مباشرة ومستمرة مع البروتوكول المصبوغة على نفس اللوحة (الشكل 4، عينات دا-الثقافة). بروتوكولات مستقلة عن الطرد المركزي لا تعطي الكثير من الخلافات ملحوظ في نشاط caspase-3، CD69، أو TCRβ تلطيخ عبر مختلف عينات اختبار، بالمقارنة مع البروتوكول التقليدية تعتمد على الطرد المركزي (الشكل 4). يمكن أن يعزى إلى الاختلافات في كثافة المصبوغة باستخدام الأجسام المضادة بتركيزات مختلفة قليلاً خلال الخطوات المصبوغة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> الشكل 1 : ثيموسيتي البقاء بعد المعالجة بمثبطات. (أ) مخطط تجريبي الخطوات الرئيسية في التحليل الفحص. هناك ثلاثة أساليب المقترحة للحفز وتلطيخ من الثيموسيه المستخدمة في مقايسة التنشيط، هي: (1) استزراع الثيموسيه في لوحات 96-جيدا القياسية، متبوعاً بالتلوين باستخدام بروتوكول المستندة إلى استخدام الطرد المركزي التقليدي، (2) استزراع لنمو في لوحات 96-جيدا القياسية، متبوعاً بالتلوين باستخدام بروتوكول غسيل المستقلة الطرد المركزي، و (3) استزراع الثيموسيه في لوحات صغيرة الحجم، متبوعاً تلطيخ في لوحات نفس استخدام بروتوكول غسيل مستقلة عن الطرد المركزي. (ب) النابضة الاستراتيجيات المستخدمة في فحوصات السلامة. بوابة الخلية حية مستمدة من التشتت إلى الأمام (FSC) وقطع الجانب مبعثر (SSC)، كما هو موضح سابقا17. الموانع التي اعتبرت أن تكون سامة جداً في تركيز اختبار تخضع لفحوصات جدوى زيادة في تركيزات أقل إذ. يتم عرض عينات تمثيلية المعالجة بمثبطات. ملاحظة عنصر التحكم الشائعة (يعامل [دمس] [[دمس]]) المستخدمة ميكرومتر 1 و 0.1 ميكرومتر عينات. (ج) تخطيط لوحة من مثبطات المخفف. تمثيل تخطيطي من الألواح مثبطات المخفف في [دمس] لتركيز 500 × تركيز النهائي المقصود. كذلك يمثل كل واحد المانع فريدة من نوعها؛ الآبار الرمادية الفارغة. التركيزات التي تظهر هي تركيز النهائي عند إضافة إلى الثقافات الخلية، إلا وهي 10 ميكرون (أحمر داكن) 1 ميكرومتر (ضارب) و 0.1 ميكرومتر (أزرق). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> الشكل 2 : لوحة تخطيط المقايسة التنشيط ثيموسيتي. (أعلى) الأعمدة 1 و 12 محجوزة لعناصر التحكم، بينما الأعمدة 2 إلى 11 المعالجة بمثبطات عينات (بيج). مراقبة سلبية (نونستيمولاتيد [م]؛ غراي) تحتل آبار A1 إلى D1، ومراقبة إيجابية لموت الخلية (تعامل الديكساميتازون [DEX]؛ الأرجواني) تحتل آبار E1 إلى H1. تحتوي الأعمدة 2 إلى 12 على حفز مع الخرز المضادة-CD3/CD28 الثيموسيه. مراقبة إيجابية لتنشيط ثيموسيتي (حفز عينات [α-CD3/CD28]؛ الأخضر) تحتل آبار A12 إلى D12، ومراقبة المركبات (حفز ويعامل [دمس] [α-CD3/CD28 + [دمس]]؛ وأحمر) تحتل آبار E12 إلى H12. (أسفل) التدفق الخلوي المؤامرات النشطة caspase-3 (ActCasp3)، CD69، وتلطيخ TCRβ من الثيموسيه بوابات داخل البوابة إيجابية مزدوجة (DP). تظهر قطع تمثيلية من عناصر التحكم المختلفة. NS = نونستيمولاتيد؛ DEX = الديكساميتازون تعامل العينات؛ Α-CD3/CD28 + [دمس] = عينات حفزت مع الخرز CD3/CD28-المغلفة وتعامل مع [دمس]؛ Α-CD3/CD28 = عينات حفزت مع الخرز CD3/CD28-المغلفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> الشكل 3 : فحص المكتبة مثبط على التنشيط ثيموسيتي. (أ) تلخيص بيانات تحليل التنشيط. هذه هي نتائج تجربة الممثل عرض قيم الخلايا مع تفعيل caspase-3 والتعبير CD69 لمثبطات المحدد تم تسويتها. تم تطبيع بمقارنة النسبة المئوية لخلايا نشطة-caspase-3-الإيجابية أو بوابة CD69-إيجابية إلى قيمة عنصر تحكم تعامل [دمس]، التي تم تعيينها إلى قيمة نسبية 0 في الرسم البياني. (ب) "تحديد نظام مراقبة الأصول الميدانية" المؤامرات. التدفق الخلوي قطع من الموانع التي قمعت تفعيل caspase-3 و upregulation CD69 (أعلى اليسار)، قمعت فقط CD69 أوبريجوليشن (أعلى اليمين)، أو أي تأثير على تفعيل caspase-3 و upregulation CD69 (أسفل اليسار). يتم إظهار قطع العينة تعامل staurosporine لتوضيح آثار استخدام المانع تركيزات سامة (أسفل اليمين). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> الشكل 4 : مقارنة بين البروتوكولات المختلفة المقايسة. التدفق الخلوي المؤامرات النشطة caspase-3 (ActCasp3)، CD69، وتلطيخ TCRβ من الثيموسيه DP عقب ثلاثة مختلفة الاعتداء البروتوكولات. يتم اختبار أربعة شروط مختلفة، إلا وهي مراقبة سلبية (نونستيمولاتيد [م])، مراقبة إيجابية لموت الخلية (تعامل الديكساميتازون [DEX])، ومراقبة المركبات (حفز ويعامل [دمس] [α-CD3/CD28 + [دمس]])، والمعالجة مثبطات عينة (حفز وبيك-75-يعامل [α-CD3/CD28 + بيك-75]). التقليدية = استزراع من نمو في معيار 96-جيدا لوحات وتلطيخ مع بروتوكول تقليدية المستندة إلى استخدام الطرد المركزي؛ دا-الغسيل = استزراع الثيموسيه في معيار 96-جيدا لوحات وتلطيخ استخدام تدفق الصفحي الغسيل البروتوكول؛ دا-الثقافة = استزراع الثيموسيه في لوحات صغيرة الحجم والتلوين في لوحات نفس استخدام تدفق الصفحي الغسيل البروتوكول.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

يستخدم هذه الورقة مقايسة على أساس التدفق الخلوي لمكتبات الشاشة من الموانع الكيميائية لتحديد الموانع وأهدافها التي تؤثر على خلايا تي مستقبلات الإشارات. ويمكن أيضا توسيع الأساليب الموصوفة هنا لغربلة الفائق.

تحديد وسطاء من خلايا تي مستقبلات الإشارات عن طريق فحص مكتبات المانع الكيميائية

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

لدينا تحليل عالية الإنتاجية يضيف إلى الطرق المتاحة لتحديد الجزيئات الصغيرة وأهدافها التي تعدل TCR الإشارات وتفعيل T-الخلية. لدينا مقايسة لها جانب تصحيحية الذاتي من خلال تصفية المركبات السامة وتحديد مثبطات إشارات TCR والحث على التحفيز المبرمج. تحديد وسطاء من TCR الإشارات يمكن أن تساعد في التطورات العلاج للأمراض المناعية.قدمنا حافزا قويا للثثى المشتقة من الفئران البولي كلينال TCR. من الممكن استخدام فئران تحويلية TCR وتنشيطها مع رباعيات ليغاند الببتيد الأخرى لتحفيز أضعف. هذا مقايسة يتضمّن الإستعمال من حجيس صغيرة ولوحات صغيرة حجم ل زراعة من الخلايا.وهذا يتطلب التعامل الدقيق مع لوحات ومحتوياتها. هناك العديد من المركبات في مكتبة مثبطات كيناز التي تعتبر خطرة. لاعتبارات السلامة، تعامل جميع المركبات على أنها خطرة على قدم المساواة، واتبع احتياطات السلامة الموصى بها من قبل المورد.لبدء علاج الخلايا الزعتية مع مثبطات كيناز، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 40 ميكرولترات لكل بئر من الخلايا الزعتية إلى لوحة صغيرة الحجم. ضع الصحن على الثلج ثم ماص واحد جزء من مثبطات كيناز، DMSO، و ديكساميثازون، وأربعة أجزاء من وسائل الإعلام دورةنع أو حاسب بالكاونية في لوحة 96 جيدا.تعيين ثمانية آبار من الصفيحة الصغيرة الحجم لضوابط غير معالجة، وأربع آبار لضوابط إيجابية المعالجة بالديكساميثاسون لموت الخلايا عن طريق إضافة ديكساميثازون المخفف في تركيز الخمسة ميكرومولار، وأربع آبار إلى أجهزة التحكم المعالجة بالمركبات، عن طريق إضافة 0.5 ميكرولترات من DMSO المخفف. بعد ذلك ، من الآبار المقابلة من لوحة المانع ، أضف 0.5 ميكرولترات من كل مثبط مخفف إلى لوحة 96 بئرًا. لبدء التحفيز الزعتر، تأكد أولاً من أن الخرز المضاد للأقراص المضغوطة 3 و CD-28 يتم تعليقه بشكل موحد.بعد ذلك ، قم بغسل ملليلتر واحد من الخرز بمليلترين من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. وضع أنبوب على موقف مغناطيسي لفصل الخرز من افرحة وpirpirate الحل. ثم إعادة تعليق الخرز في ملليلتر واحد من المتوسط دورة ً كاملة.أضف 10 ميكرولترات لكل بئر من التعليق الخرز إلى كل عينة معالجة من مثبطات، وأربع عينات معالجة DMSO، وأربع من العينات الثماني غير المعالجة. أضف 10 ميكرولترات من الـ RPMI الكامل إلى الآبار الأربعة المتبقية غير المعالجة. استخدام شاكر المداري microplate لتهيج بلطف لوحة.بعد ذلك، احتضان الخلايا الزعتية في 37 درجة مئوية و 5٪ بيئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 17 إلى 20 ساعة، أو بين عشية وضحاها. رئيس لوحة تدفق لاريمل الآلي غسالة، أولا مع 150 ملليلتر من محلول الإيثانول توين، ثم مع المياه غير المؤينة تكمل مع 1٪ توين 20، وأخيرا، مع FACS غسل العازلة. في نهاية الحضانة باستخدام نظام غسالة لوحة، وغسل لوحة مع FACS غسل العازلة باستخدام دورة الغسيل تسع مرات.كل غسل يضيف ويزيل 55 ميكرولترات من عازلة غسل عن طريق تدفق لاريبار، مما أدى إلى إضعاف الأسي من الكواشف في الآبار. لطخ مستضدات السطح، أولا تخفيف وحدة واحدة حجم المضادة للأقراص المدمجة-3، المضادة للأقراص المضغوطة-4، المضادة للأقراص المضغوطة-8، ومضادة للأقراص المضغوطة-69 الأجسام المضادة في 100 وحدة من وحدات التخزين المؤقت غسل FACS. ثم إعادة تعليق الخلايا في 25 ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة تلطيخ.استخدم شاكر مداري microplate لإثارة اللوحة بلطف ، ثم اترك اللوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة. لإصلاح الخلايا، أولا غسل لوحة مع 55 ميكرولترات من FACS غسل العازلة باستخدام دورة الغسيل تسع مرات كما هو موضح من قبل. ثم إضافة 50 ميكرولتررس من العازلة التثبيت - impermeablization إلى كل بئر.اخلطي جيداً ويحضني الصحن على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وإعداد بيرم X واحد وغسل العازلة عن طريق تخفيف 25 ملليلتر من المخزون 10X المقدمة في 225 ملليلتر من المياه Ultrapure. رئيس غسالة لوحة مع واحد X العازلة وغسل لوحة مع 55 ميكروليتر من المخزن المؤقت واحد X باستخدام دورة الغسيل تسع مرات كما هو موضح من قبل.للبدء، مزيج ملليلتر واحد من الأجسام المضادة caspase 3 مع مليلترين من بيرم X واحد وغسل العازلة. إضافة 25 ميكرولتر في بئر من الخليط إلى الخلايا الثابتة. استخدام شاكر المداري microplate لتهيج بلطف لوحة.اتركي الصحن على الثلج لمدة ساعة في نهاية الحضانة، كرر خطوة الغسيل تسع مرات مع بيرم واحد X وغسل العازلة. ثم إضافة 25 ميكرولترات من FACS غسل العازلة إلى جميع الآبار من لوحة.الماصات صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط الحل. وأخيراً، نقل العينات المختلطة إلى أنابيب microtiter. قم بالأنابيب مع عازل غسل FACS إلى حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر، والمضي قدما في تحليل تدفق القياسات الكيسية.وبعد أن تم رصد مضادة للأقراص المدمجة-3، وCD-28، لوحظت زيادة في تنشيط الكاسباس-3، وفي نظام الدوائي TCR في كل من العينات غير المعالجة وعينات DMSO التي تم علاجها بالسخرية. ولوحظ أيضاً زيادة في التعبير CD-69 في كلتا العينتين المحفّزتين. وأظهرت العينات المعالجة dexamethasone زيادة في تنشيط caspase-3 مستقلة عن upregulation CD-69، كما هو متوقع للتأثير المستحثة تخثر الدم المستقلة وتحفيز TCR.وقد تبين ضعف انتقائي لظواهر تنشيط الخلايا التى من خلال مثبطات مختلفة إما قمعت كلا من تنشيط كاسباس -3 وCD-69 حتى التنظيم، أو CD-69 حتى التنظيم، ولكن لم يضعف التنشيط caspase-3. وكانت هناك أيضا مثبطات لم تستهدف كيناز ذات الصلة من مسار إشارة TCR، وبالتالي لم قمع كل من رفع التراكم CD-69 وتنشيط caspase-3. وأظهرت نتيجة الشاشة من staurosporine، والسيطرة على المبرمج إيجابية، مستويات عالية من التنشيط caspase-3، كما هو متوقع.ومع ذلك، أظهرت النتيجة أيضا مستويات منخفضة من التعبير CD-69 التي يمكن أن تعزى إلى تثبيطها بوساطة من بروتين كيناز C أو ه موت الخلايا المبرمج المستحثة قبل التعبير CD-69. وأظهرت المقارنة بين بروتوكولات فحص مختلفة أي اختلافات في caspase-3 النشطة، CD-69، وتلطيخ TCR من السيطرة السلبية، والسيطرة الإيجابية للوفاة الخلية، ومراقبة السيارة، وعينة المعالجة بالمثبطات. وتهدف مراحل ما قبل الحضانة إلى تسهيل استخدام لوحة صغيرة الحجم لمعالجة الخلايا.كما يتم توفير البروتوكول القياسي المعتمد على الطرد المركزي في المخطوطة. يمكن التحقق من صحة مثبطات أو أهداف مثيرة للاهتمام باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا وكذلك في أنواع مختلفة، مثل الخلايا الليمفاوية الماوس pagopheral أو الخلايا الأولية البشرية. ويمكن أن يساعد التوصيف اللاحق للجزيئات المحددة والأهداف في تحسين فهم بيولوجيا الخلايا التاتية والتوسع في الأهداف المحتملة للتحـدّم المناعي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear الفئران مع الخصوصيات المحددة مسبقا ضد مستقبلات الخلايا T المقوسة الغوندية الحصول عليها عن طريق SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

الكمي في وقت واحد T-خلية الدوائر مستقبلات الختان (TRECs) والدوائر K-حذف إعادة التركيب الختان (KRECs) من قبل في الوقت الحقيقي PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

باستخدام الأشعة السينية البلورات، الفيزياء الحيوية، وفحوصات وظيفية لتحديد آليات الحكم تي خلية مستقبلات الاعتراف السرطان المستضدات

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...