Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale Medical Research Council, NMRC CBRG15may017 en de Singapore ministerie van onderwijs, 2014-T2-1-136 (voor N.R.J.G.).

<ol>
	<li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development.">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li><li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers.">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).</li><li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&amp;#34;self&amp;#34;+in+T-cell+activation.">A role for &amp;#34;self&amp;#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li><li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation.">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li><li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC.">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling.">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development.">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling.">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development.">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li><li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+human+autoimmunity:+current+practice+and+future+prospects.">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li><li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity.">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li><li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate.">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li><li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li><li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation.">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).</li><li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules.">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants.">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li><li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis.">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li><li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry.">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li><li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase,+2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+(LY294002).">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors.">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li><li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine,+K-252+and+UCN-01:+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases.">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li><li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2,3-Bisarylmaleimides.">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li><li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1.">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li><li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A.">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li><li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel compounds. , (2003).</li><li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase.">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li><li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway.">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors.">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).</li><li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts.">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li><li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+neonatal+thymus:+evidence+for+a+transient+thymic+involution.">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li><li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus.">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li><li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and/or+IFN-gamma-producing+CD4++and+CD8++T+cells.">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li><li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+ADMET.">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li></ol>

De auteur Chyan Ying Ke is een medewerker van Curiox Biosystems, die produceert de DA-cel wasmachine en DA-cel platen gebruikt in dit artikel.

De hier voorgestelde strategie voor de screening evalueert het vermogen van kleine-molecuul remmers te onderdrukken de apoptotic effecten in thymocytes na stimulatie, naast meer conventionele markers van T-cel activatie-CD69 opregulatie en TCR Downregulatie . Extra markeringen kunnen ook worden opgenomen om de analyse van verschillende thymocyte deelverzamelingen32. Een interessant aspect van de huidige bepaling ligt in het feit dat remmers die TCR signalering belemmeren zou ook het temperen van de inductie van apoptosis, verder benadrukt het onderscheid van TCR-onafhankelijke effecten die de remmers wellicht op inducerende celdood. Bovendien kan een stroom cytometry-gebaseerde bepaling het gebruik van meerdere uitlezingen als afzonderlijke activering markeringen, die de effecten van de remmers op aparte afzonderlijke takken van TCR signalering kunnen verslag. In het geval hier gepresenteerd, waren er remmers die een differentiële remming van activering van caspase-3 en CD69 opregulatie toonde. Omdat sommige verbindingen huishouden functies zoals eiwitsynthese of vesiculaire handel beïnvloeden kunnen, is het niet verwonderlijk te observeren van de effecten op de opregulatie van DOVO gesynthetiseerd markers (bijv CD69) maar niet op posttranslationele wijzigingen (bijvoorbeeld de Proteolytische activering van caspase-3).
Als de test aangeboden hier maatregelen apoptosis als een uitlezing, is het noodzakelijk dat de latente toxische effecten van de remmers niet van de resultaten verhullen doen. Bijvoorbeeld, in het scherm deden we niet verdunnen staurosporine dan 1 nM, ondanks dat het nog steeds giftig voor de cellen bij die concentratie. De representatieve resultaten zijn in overleg met de staurosporine wordt een promiscue kinase inhibitor en een inductor van apoptosis33. Zonder een voldoende verdunning van de stoffen niet giftig concentraties getest, is het mogelijk om te overzien van mogelijke hits.
De strategie van de screening gedetailleerde hier zou moeilijk toe te passen op de mens als gevolg van de complicaties geassocieerd met het verkrijgen van voldoende aantal thymocytes voor high-throughput screening. Het is echter mogelijk te krijgen menselijke thymus monsters pediatrische cardiale biopsieën34,€35 of36,37€ foetussen. Echter als de TCR signalering trajecten en de aminozuur sequenties van signalering eiwitten zijn grotendeels bewaard tussen muizen en mensen, de bepaling van de thymocyte biedt een nuttig oriënterende strategie en geen resultaten verkregen met deze test met behulp van de muis thymocytes kan vervolgens worden geverifieerd bij primaire menselijke lymfocyten.
Een beperking van de conventionele centrifugeren-afhankelijke protocol heeft betrekking op het vooruitzicht van verlies van de cel, die kan worden toegeschreven aan de meerstaps aard van het proces, waarbij stappen zoals cel permeabilization en centrifugeren. Elke centrifugeren en resuspensie stap leidt onvermijdelijk tot verlies van cellen. Hoewel dergelijke verliezen niet kritiek voor studies waarbij een beperkt aantal monsters worden kunnen, kan het problemen wanneer toegepast in hogere-throughput screening, met name als de assay formaat vordert van 96 - tot 384 - tot 1536-well opleveren. Eén manier om dit probleem te omzeilen is door het gebruik van cel-permeabele fluorescerende caspase sensoren38 , waarmee de opsporing van de activering van caspase terwijl het vermijden van de complicaties van cel permeabilization en meerdere wasbeurten5. Anderzijds is het ook mogelijk voor het minimaliseren van de cel verlies een centrifugeren-onafhankelijke methode voor het wassen van cellen door laminaire flow in dienst. Met een geautomatiseerd plaat wassen station in combinatie met een muur-minder plaat, worden de cellen gewassen door laminaire flow zonder het gebruik van een centrifuge. De exponentiële verdunning van reagentia voorziet de grondige en efficiënte spoelen van cellen in minder dan 3 min, die aangeeft van een gelijkwaardige verdunningsgraad twee rondes van centrifugaal wassen. Zonder externe stress als gevolg van centrifugeren, de cellen meer levensvatbaar zijn en cel verliezen worden geminimaliseerd.
Verkenden we ook de mogelijkheid van het gebruik van de geautomatiseerde plaat station wassen na het kweken van de thymocytes in 96-Wells U-bodem platen en, ook, het kweken van cellen rechtstreeks in de muur-minder platen compatibel is met de geautomatiseerde plaat wassen station. Het kweken van cellen in de platen van de muur-minder ingeschakeld de afschaffing van alle stappen van het centrifugeren en cel verlies door het elimineren van de noodzaak van de overdracht van een steekproef over platen tot een minimum beperkt. In het algemeen, de drie verschillende protocollen zijn vergelijkbaar in zowel stimulatie efficiëntie en kleuring. De geautomatiseerde wassen station biedt het voordeel van automatisering, snelheid en efficiëntie, waardoor het makkelijker voor hogere gegevensdoorvoer analyse. Bovendien, met toegenomen automatisering, de stappen wassen kunnen sneller worden uitgevoerd, en er is een grotere samenhang tussen de experimenten of onderzoekers. Echter, het wassen-station heeft bepaalde nadelen: grote volumes van het wassen van buffers vereist zijn voor wasmachine priming (150 mL per buffer wijziging, waarvan 50 mL wordt gebruikt voor het wassen); extra zorg nodig is bij de behandeling van de plaat om te voorkomen dat een kruisbesmetting van de putten te wijten aan de beperkte partitionering tussen de putjes van de plaat van de kleine-volume; residuele buffer van 25 µL in de putten na wassen vereist het gebruik van de reagentia voorbereid op een hoger dan 1 x concentratie. Om zaken van restvolume en de beperkte capaciteit van de plaat, kan een accessoire uit te breiden van het volume van de incubatie van 70 µL tot 150 µL worden toegevoegd, vergemakkelijken van de aanneming van conventionele protocollen. Terwijl geautomatiseerde plaat handlingsystemen momenteel beschikbaar zijn, hebben zij een significante voetafdruk in vergelijking met de laminaire wash systeem, dat een kleine eenheid van ~ 1 kubieke voet (~0.028 m3 is). Bovendien, de integratie van centrifugeren in geautomatiseerde plaat handling-systemen is uitdagend, beperking van het gebruik ervan in cel wassen. Er zijn momenteel geen andere centrifuge-zelfstandige cel wassen instrumenten beschikbaar, voor zover we weten.
De strategie van de screening die hier gepresenteerd is in staat kleine moleculen en hun vermeende doel kinases, die invloed hebben op de TCR signalering en T-cel activatie wordt aangeduid. De bibliotheek gebruikt hier omvat voornamelijk kleine-molecuul remmers van kinases en was in staat om het genereren van een aantal potentieel interessante hits. Het protocol kan ook gemakkelijk worden toegepast op remmer bibliotheken van andere klassen van enzym of naar andere soorten kleine moleculen, alsmede op de bibliotheken van andere stoffen (bijvoorbeeld, verschillende macromoleculen). Het protocol kan ook worden gebruikt om het scherm van andere celtypes, zoals perifere T lymfocyten of vereeuwigd cellen, met inbegrip van die transgene TCRs uiten of het dragen van verslaggever systemen. Identificatie en karakterisering van nieuwe bemiddelaars van T-cel signalering kan verbeteren van onze kennis van de signalering pathway en ook steun bij de ontwikkeling van gerichte therapie in immuun ziekten13,14,15, 16. in alle, deze studie wordt toegevoegd aan het bereik van beschikbare opties voor de detectie van bemiddelaars/mediators van T-cel signalering via high-throughput screening tests.

T-cellen zijn een geslacht van lymfocyten die een centrale rol in het behoud van adaptieve immuniteit spelen. Ze uiten de TCR, die hen in staat stelt om te herkennen hun liganden, bestaande uit een grote histocompatibility complex molecuul (MHC) complexen met een afhankelijke peptide, die zijn te vinden op de oppervlakken van het antigeen-presenteren cellen (APCs). Het genereren van de TCR traject door de interactie van de TCR/MHC signalering is van cruciaal belang voor T-cel activatie en ontwikkeling1.
In T-cel ontwikkeling migreren bot-merg-afgeleide hematopoietische stamcellen (HSCs) naar de thymus, waar ze een differentiatie ondergaan en doorlopen de stadia van T-cel lineage progressie2. Dubbel-positieve (DP) thymocytes, uiting geven aan zowel de CD4 en CD8 coreceptors, zich bezighouden met zelf-peptide/MHC op de APCs. Thymocytes met een matige affiniteit voor hun zelf-peptide/MHC liganden volwassen te worden honkslag-positieve (SP) CD4 of CD8 thymocytes, een proces genoemd als positieve selectie. Thymocytes die buitensporig TCR stimulatie door de zelf-peptide/MHCs ontvangen ondergaan omgekeerd, apoptosis via negatieve selectie3,4. Dit proces van stimulatie-geïnduceerde, caspase-afhankelijke apoptosis kan worden bootste in vitro door het stimuleren van de thymocytes, bijvoorbeeld met anti-CD3/28 antilichaam beklede kralen5. Volwassen T-cellen die overgaan van het selectieproces worden geactiveerd door niet-zelf-peptide/MHC liganden van APCs in de periferie. Zelf-peptide/MHCs nog steeds relevant zijn voor perifere T-cellen, in de context van tonic signalering voor overleving en homeostatische proliferatie, de differentiatie van helper T-cellen en de verhoging van de T-cel reacties op niet-zelf-peptide/MHCs via coagonism6,7,8,9. Hoge-affiniteit TCR binding aan de peptide/MHC-ligand activeert verschillende downstream signaalroutes, waarbij veel signalering moleculen vormen een complex TCR signalering netwerk10. De TCR signaalroutes decennialang zijn bestudeerd, en nog de ontdekking van nieuwe bemiddelaars van het leertraject vertoont geen11,12te verminderen. De modulering van de TCR signaalroutes heeft klinische relevantie en versterkend T-cel Responsie voor immunotherapeutische toepassingen of de remming van T-cel voor de controle van autoimmuniteit13reacties kunt betrekken. Strategieën voor de modulatie van T-cel reacties is voornamelijk afhankelijk van de verstoring van kinase of fosfatase activiteit14,15,16.
We beschrijven een toepassing van een stroom cytometry-gebaseerde assay voor de screening van kleine chemische verbindingen om hun vermogen om het moduleren van de TCR signalering en T-cel activatie17. De bepaling staat of valt met het fenomeen van de thymocytes activeren de apoptosis pathway wanneer blootgesteld aan sterke TCR signalen. De bepaling is voldoende gevoelig voor veranderingen in de sterkte van de stimulatie; thymocytes transgene TCR met peptide/MHC tetramers met toenemende affiniteit uitdrukken aan het broeden resulteerde in een overeenkomstige toename caspase activering-gebruikt als een maatregel van de apoptotic antwoord5. Voor het scherm, wij een bibliotheek van kinase-remmers gebruikt en beoordeeld op hun vermogen om het moduleren van het thymocyte antwoord op sterke TCR signalen.
Verschillende stroom cytometry-gebaseerde of fluorescentie-verslaggever gebaseerde strategieën zijn beschreven voor de high-throughput screening van een assortiment van perifere activering fenotypen in verschillende T-cel subsets. Dergelijke strategieën omvatten het gebruik van genetische fluorescerende verslaggevers om de timing en de omvang van T-cel activatie18te beoordelen, het gebruik van degranulatie als een uitlezing van cytotoxische T-cel-activiteit-19,20, en de analyse van de fosforylering van verschillende eiwitten die betrokken zijn bij mobiele21signalering.
De screening test hier gepresenteerd is kundig voor met succes het identificeren van stoffen die een remmende werking van canonieke moleculen van de TCR signalering traject, alsook de potentiële, nieuwe verbindingen met remmende effecten op de TCR signalering. Bijvoorbeeld, wij aangewezen remmers van GSK3β en Hsp90 als nieuwe verbindingen op het gebied van T-cel reacties17. De bepaling is in staat om te onderscheiden van de remmers die met de signaaltransductie, te wijten aan een vermindering van de apoptotic reactie, van de effecten van de TCR-onafhankelijk van de remmers op cellulaire toxiciteit interfereren. Naast de inductie van apoptosis meten we ook CD69 opregulatie en TCR Downregulatie als markers van activering. Als TCR signalering netwerken zijn complex, kan het gebruik van meerdere uitlezingen verhogen de kansen moleculen met specifieke effecten op een enkele weg om te ontdekken. Hier introduceren we ook het gebruik van een centrifugeren-onafhankelijke-protocol als een high-throughput alternatief voor de originele protocol tijdens de kleuring van de cellen in voorbereiding voor de stroom cytometrische analyse. De bepaling in dit artikel wordt beschreven gebruikt een kleine samengestelde bibliotheek van kinase-remmers, maar, in principe, kan het worden gebruikt voor hogere doorvoer screening. De bibliotheek van keuze kunt ook allerlei remmers of andere moleculen opnemen.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

De T-cel receptor (TCR) signalering traject bestaat uit een veelheid van bemiddelaars die zenden signalen op de activering van de TCR. Verschillende strategieën zijn voorgesteld en geïmplementeerd voor de identificatie van nieuwe bemiddelaars van TCR signalering, die het begrip van T-cel-processen, met inbegrip van activering en serie selectie zou verbeteren. We beschrijven een screening test waarmee de identificatie van moleculen die van invloed zijn TCR signalering op basis van de activering van de ontwikkeling van thymocytes. Sterke TCR signalen veroorzaken ontwikkelen thymocytes te activeren van apoptotic machines in een proces dat bekend staat als negatieve selectie. Door de toepassing van kinase-remmers kunnen die met doelen die invloed hebben op de TCR signalering overschrijven van het proces van negatieve selectie. De methode beschreven in dit document kan worden gebruikt om remmers van canonieke kinases met gevestigde rollen in de TCR signaalroutes en ook remmers van nieuwe kinases nog op te richten in de TCR signaalroutes te identificeren. De screening strategie hier kan worden toegepast op schermen van hogere doorvoer voor de identificatie van roman druggable doelen in TCR signalering.

De aanpak van de screening test is samengevat in figuur 1A. De kinase-remmers werden voor het eerst vertoond voor hun latente effecten op de levensvatbaarheid van de thymocyte. Als positieve controle voor apoptose, werd dexamethason gebruikt als een agent proapoptotic. De gating voor de levende cel bevolking werd bepaald op basis van de onbehandelde negatieve controles en de dexamethason behandeld positieve (figuur 1B). De remmers werden voor het eerst getest op 10 µM op thymocytes, en het aantal levensvatbare cellen werd gemeten na incubatie gedurende 18 uur. Een venster van 20% voor celdood werd zodanig gekozen dat de verbindingen die veroorzaakte een groter dan 20% verlies van cellen in de levende cel poort, in vergelijking met de monsters DMSO-behandeld, werden getest bij lagere concentraties (figuur 1B). Representatieve FACS percelen van de Inhibitor van de omwenteling-behandelde steekproeven worden getoond ter illustratie van de bepaling van de levensvatbaarheid. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), een PI3K remmer22, de dood van de cel op 10 µM niet sterk verhogen en de Inhibitor van de omwenteling werd gebruikt op 10 µM voor de daaropvolgende testen. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), een dubbele inhibitor van PI3Kα/mTOR23, veroorzaakte hoge niveaus van celdood op 10 µM en op 1 µM maar niet op 0.1 µM en 0.1 µM was vastgesteld dat de geschikte concentratie voor toepassing in downstream testen. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), een pan-proteïne kinase C-remmer met een vastgestelde capaciteit voor het opwekken van apoptosis24, veroorzaakte aanzienlijke celdood in alle concentraties getest, zelfs bij 0.1 µM. Het werd als een extra positieve controle gebruikt in daaropvolgende testen op 0.1 µM.
De eindconcentraties van de remmers werden geselecteerd op basis van de hoogste concentraties waarin ze niet celdood door meer dan 20% van de monsters van DMSO-behandeld versterken deed. Met de eindconcentraties van de remmers bepaald, een voorraad plaat van remmers opgesteld zodat alle de remmers 500 maal de concentratie waren wanneer toegepast op de cellen. Figuur 1 c illustreert de indeling van de plaat van de voorraad plaat, met de eindconcentraties van de remmers. In het alternatieve protocol van de cellen rechtstreeks in de platen van de kleine-volume voor de laminaire flow wassen assay het broeden, noodzakelijk het gebruik van kleine hoeveelheden een verdere verdunning van de remmers. Om ervoor te zorgen dat de inhoud van de DMSO van de culturen na toevoeging van de remmer zou niet te hoog voor de cellen, de remmers werden verder verdund in volledige RPMI, met een verdunningsfactor 5, zodanig dat ze op 100 maal de voorgenomen concentratie waren wanneer toegepast op de cellen.
De remmers, verdund tot de concentratie van het niet giftig, werden gebruikt in de bepaling voor TCR-stimulatie-veroorzaakte apoptosis in thymocytes5,17. De stimulatie werd uitgevoerd met behulp van anti-CD3/CD28 kralen voor 18u, en de cellen werden vervolgens gekleurd voor de activering van caspase-3 in de CD4+ en CD8+ DP thymocyte bevolking (Figuur 2). Een toename van de activering van caspase-3 en CD69 expressie, en ook een TCR Downregulatie, werden waargenomen in zowel de anti-CD3/CD28-gestimuleerd en de DMSO-mock-testgroep anti-CD3/28-gestimuleerd monsters, in vergelijking met de nonstimulated monsters. De monsters van dexamethason behandeld sprake van een toename in activering van caspase-3 onafhankelijk van CD69 opregulatie, die van het apoptose-inducerende-effect is onafhankelijk van TCR stimulatie wordt verwacht.
Figuur 3A geeft een overzicht van de resultaten van de screening assay voor geselecteerde remmers bibliotheek. Zowel de activering van caspase-3 en de CD69 kunnen worden gebruikt voor identificatie van potentiële remmers van belang als gevolg van de onderdrukking van de expressie. Zoals verwacht, opdagen remmers van canonieke bemiddelaars van TCR signalering als positieve hits in de schermen. Deze remmers, die tentoongesteld wisselend remmende potentie, opgenomen breedspectrum remmers die gericht zijn op meerdere kinases en ook meer specifieke remmers. Sommige remmers waren in staat om zowel activering van caspase-3 en CD69 opregulatie (figuur 3B, bovenste rij, linker panelen) te onderdrukken. Één dergelijke remmer is bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), die alle proteïne kinase C isoforms, naast proteïne kinase A en PDK125,26,27remt. Een ander remmer in deze categorie is CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), een voorgestelde inhibitor van IKK228.
Er zijn verbindingen die geremd CD69 opregulatie maar deed geen afbreuk doen aan de activering van caspase-3 (figuur 3B, bovenste rij, rechts panelen). CAY10626, een inhibitor van PI3Kα en mTOR23, en U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] methyleen]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), een MEK-remmer29, waren enkele van de geïdentificeerde remmers. Uit de resultaten blijkt dat verschillende remmers richten verschillende kinases van specifieke takken van de TCR signalering traject, met name die welke gericht op late-stadium kinases, leiden de selectieve schending van T-cel activatie verschijnselen tot kunnen.
Er waren ook remmers die niet CD69 opregulatie zowel activering van caspase-3 (figuur 3B, onderste rij, linker panelen onderdrukken deed). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - r - hydroxy-benzenepropanoic zuur, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), een disruptor van microtubulus dynamics30en necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), een inhibitor van de omwenteling van RIP1 kinase31, zijn twee remmers geïdentificeerd worden in deze categorie. In dergelijke gevallen waar CD69 opregulatie en activering van caspase-3 niet aangetast waren, dit kan worden als gevolg van de remmers niet gericht op een relevante kinase van de TCR signalering traject.
Zoals eerder vermeld, werd staurosporine gebruikt in de schermen, met een concentratie die nog apoptosis in de thymocytes veroorzaakte. Zoals verwacht, bleek het monster staurosporine-behandelde hoge niveaus van activering van caspase-3 (figuur 3B, onderste rij, rechterkolom). De lage niveaus van CD69 expressie kunnen worden toegeschreven aan de remming van staurosporine-gemedieerde van PKC, zoals bisindolylmaleimide II, een andere pan-PKC-remmer, ook de expressie van CD69 onderdrukt. U kunt ook veroorzaakte staurosporine apoptosis in de cellen voordat ze upregulate konden de expressie CD69.
Om te vergroten de gegevensdoorvoer en de automatisering van het protocol, werden parallelle protocollen die het gebruik van een geautomatiseerd plaat systeem via laminaire flow wassen voorbereid. Twee afzonderlijke protocollen gebruik van dit geautomatiseerde plaat wassen apparaat waren trialed en vergeleken met de conventionele methode van kweken van cellen in 96-wells-platen en vlekken van de cellen in een centrifugeren-afhankelijke protocol. Één methode betrokken kweken van de cellen in 96-wells-platen, volgens de standaardprocedure, en vervolgens de cellen overbrengen naar platen compatibel is met de geautomatiseerde plaat wasmachine voor de kleuring stappen (Figuur 4, DA-wassen monsters). De andere methode betrokken kweken de cellen rechtstreeks in de plaat-wasmachine-compatibele platen en wilt doorgaan met het kleuring protocol op de dezelfde plaat (Figuur 4, DA-cultuur monsters). De protocollen van centrifugeren-onafhankelijke geef niet veel waarneembare verschillen in actieve caspase-3, CD69, of TCRβ kleuring over de verschillende monsters getest, in vergelijking met de conventionele centrifugeren-afhankelijke protocol (Figuur 4). Verschillen in de intensiteit van kleuring kunnen worden toegeschreven aan het gebruik van antilichamen bij lichtjes verschillende concentraties tijdens de kleuring stappen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figuur 1 : Thymocyte levensvatbaarheid na behandeling met inhibitoren. (A) experimentele overzicht van de belangrijkste stappen in de screening test. Er zijn drie voorgestelde methoden voor het stimuleren en kleuring van het thymocytes gebruikt in de activering assay, namelijk (1) de kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen, gevolgd door de kleuring met een conventionele centrifugeren gebaseerde protocol, (2) kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen, gevolgd door de kleuring met behulp van een protocol centrifugeren-onafhankelijke wassen, en (3) het kweken van thymocytes in kleine volumes platen, gevolgd door de vlekken in de dezelfde platen met behulp van een centrifugeren-onafhankelijke wassen protocol. (B) Gating strategieën gebruikt in het testen van de levensvatbaarheid. De levende cel poort was afgeleid van de voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) percelen, als eerder beschreven17. Remmers die werden geacht te zijn ook giftig bij de geteste concentratie waren onderworpen aan verdere levensvatbaarheid testen bij 10-fold lagere concentraties. Representatieve monsters van de Inhibitor van de omwenteling-behandeld worden weergegeven. Opmerking het gemeenschappelijk besturingselement (DMSO-behandeld [DMSO]) wordt gebruikt voor de 1 µM en 0.1 µM monsters. (C) plaat lay-out van verdunde remmers. Een schematische weergave van de platen van remmers verdund in DMSO tot een concentratie van 500 x de beoogde uiteindelijke concentratie. Elk vertegenwoordigt goed een unieke remmer; de grijze putten zijn leeg. De concentraties die weergegeven zijn de uiteindelijke concentratie wanneer toegevoegd aan de celculturen, namelijk 10 µM (donkerrood), 1 µM (fuchsia) en 0.1 µM (blauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figuur 2 : Plaat lay-out van de bepaling van de activering thymocyte. (Boven) Kolommen 1 en 12 zijn gereserveerd voor besturingselementen, terwijl de kolommen 2 tot en met 11 remmer behandeld monsters (beige zijn). De negatieve controle (nonstimulated [NS]; grijs) bezet wells A1 naar D1, en de positieve controle voor de dood van de cel (dexamethason behandeld [DEX]; paars) bezet putten E1 tot en met H1. Kolommen 2 tot en met 12 bevatten thymocytes gestimuleerd met anti-CD3/CD28 kralen. De positieve controle voor thymocyte activering (gestimuleerd monsters [α-CD3/CD28]; groen) bezet wells A12 D12, en de controle van het voertuig (gestimuleerd en DMSO-behandeld [α-CD3/CD28 + DMSO]; rode) putten E12 tot H12 in beslag neemt. (Onder) Stroom cytometry percelen voor actieve caspase-3 (ActCasp3), CD69, en TCRβ vlekken van thymocytes gated binnen de dubbel-positieve (DP) poort. Representatieve percelen van de verschillende besturingselementen worden weergegeven. NS = nonstimulated; DEX = dexamethason behandeld monsters; Α-CD3/CD28 + DMSO = monsters gestimuleerd met CD3/CD28-gecoate kralen en behandeld met DMSO; Α-CD3/CD28 = monsters gestimuleerd met CD3/CD28-gecoate kralen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figuur 3 : Screening van de Inhibitor van de omwenteling-bibliotheek op thymocyte activering. (A) samengevatte gegevens voor de bepaling van de activering. Dit zijn de resultaten van een representatieve experiment toont de genormaliseerde waarden van cellen met geactiveerde caspase-3 en CD69 uitdrukking voor geselecteerde remmers. Normalisatie werd gedaan door het vergelijken van het percentage van de cellen in de actieve caspase-3-positieve of CD69-positieve poort naar de waarde van het besturingselement DMSO-behandeld, die is ingesteld op een relatieve waarde voor 0 in de grafiek. (B) geselecteerd FACS percelen. Stroom cytometry percelen van remmers die onderdrukt zowel activering van caspase-3 en CD69 opregulatie (links boven), alleen CD69 opregulatie (rechtsboven) onderdrukt, of hadden geen effect op de activering van caspase-3 en CD69 opregulatie (linksonder). Percelen van het monster staurosporine-behandeld worden weergegeven om te illustreren de effecten van het gebruik van een inhibitor van de omwenteling in toxische concentraties (rechtsonder). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figuur 4 : Vergelijking van de protocollen van de verschillende assay. Stroom cytometry percelen voor actieve caspase-3 (ActCasp3), CD69, en TCRβ kleuring van DP thymocytes na de drie verschillende assay protocollen. Vier verschillende voorwaarden worden getest, namelijk de negatieve controle (nonstimulated [NS]), de positieve controle voor de dood van de cel (dexamethason behandeld [DEX]), de controle van het voertuig (gestimuleerd en DMSO-behandeld [α-CD3/CD28 + DMSO]), en een inhibitor van de omwenteling-behandeld monster (gestimuleerd en PIK-75-testgroep [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Conventionele = het kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen en kleuring met een conventionele centrifugeren-gebaseerd protocol; DA-wassen = het kweken van thymocytes in standaard 96-wells-platen en kleuring met behulp van een laminaire flow wassen protocol; DA-cultuur = de kweken van thymocytes in kleine volumes platen en vlekken in de dezelfde platen met behulp van een laminaire flow wassen protocol.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Onze high-throughput test draagt bij aan de beschikbare methoden voor de identificatie van kleine moleculen en hun doelen die TCR signalering en T-cel activering moduleren. Onze test heeft een zelfcorrigerend aspect door het filteren van giftige verbindingen en het identificeren van remmers van TCR signalering en stimulatie-geïnduceerde apoptose. Identificatie van bemiddelaars van TCR signalering kan helpen bij de ontwikkeling van de therapie voor immuunziekten.We gaven een sterke stimulans voor thymocyten afgeleid van TCR-polyklonale muizen. Het is mogelijk om TCR-transgene muizen te gebruiken en te stimuleren met andere peptide ligandtetramers voor zwakkere stimulatie. Deze test omvat het gebruik van kleine volumes en van kleine volume platen voor het kweken van de cellen.Dit vereist een zorgvuldige behandeling van de platen en de inhoud ervan. Er zijn veel verbindingen in de bibliotheek van kinase remmers die worden beschouwd als gevaarlijk. Om veiligheidsredenen, behandel alle verbindingen als even gevaarlijk, en volg de aanbevolen veiligheidsmaatregelen van de leverancier.Om te beginnen met de behandeling van thymocyten met kinaseremmers, gebruik een multi-channel pipet om 40 microliter per put van thymocyten toe te voegen aan een kleine volumeplaat. Zet de plaat op ijs. Dan pipette een deel van kinase remmers, DMSO, en dexamethasone, en vier delen van de volledige RPMI media in een 96-put plaat.Acht putten van de kleine volumeplaat aanwijzen op onbehandelde bedieningselementen, vier putten tot dexamethason-behandelde positieve controles voor celdood door de verdunde dexamethason bij de concentratie van vijf micromolar toe te voegen, en vier putten aan voertuigbehandelde controles, door 0,5 microliter van de verdunde DMSO toe te voegen. Voeg vervolgens 0,5 microliter van elke verdunde remmer toe aan de 96-putplaat. Om te beginnen thymocyte stimulatie, eerst zorg ervoor dat anti-CD-3 en CD-28 kralen gelijkmatig opnieuw worden opgehangen.Was vervolgens een milliliter van de kralen met twee milliliter van de PBS-buffer. Leg de buis op een magnetische standaard om kralen te scheiden van supernatant en de oplossing aan te trekken. Hang de kralen vervolgens opnieuw op in één milliliter van het volledige RPMI-medium.Voeg 10 microliter per put van de kraalsuspensie toe aan elk met remmer behandeld monster, de vier met DMSO behandelde monsters en vier van de acht onbehandelde monsters. Voeg 10 microliters van de volledige RPMI toe aan de overige vier onbehandelde putten. Gebruik een microplate orbitale shaker om de plaat voorzichtig te roeren.Vervolgens, incubeer de thymocyten in 37 graden Celsius en 5% kooldioxide milieu voor 17 tot 20 uur, of 's nachts. Prime een geautomatiseerde laminaire stroom plaat wasmachine, eerst met 150 milliliter ethanol Tween oplossing, dan met gedeïoniseerd water aangevuld met 1%Tween 20, en ten slotte, met FACS wassen buffer. Aan het einde van de incubatie met behulp van de plaat wasmachine systeem, was de plaat met FACS wasbuffer met behulp van een negen keer wascyclus.Elke wasbeurt voegt en verwijdert 55 microliters van wasbuffer door laminaire stroom, wat resulteert in een exponentiële verdunning van de reagentia in de putten. Om oppervlakteantigenen te bevlekken, verdun je eerst een volume van anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 en anti-CD-69 antilichamen in volumes van 100 eenheden van de FACS-wasbuffer. Stel de cellen vervolgens opnieuw op in 25 microliters van het kleurstoffenmengsel.Gebruik een microplate orbitale shaker om de plaat zachtjes te roeren en laat de plaat 30 minuten op ijs staan. Om de cellen te repareren, eerst wassen van de plaat met 55 microliters van FACS wasbuffer met behulp van negen keer wascyclus zoals eerder beschreven. Voeg vervolgens 50 microliters van de fixatie-impermeablisatie buffer aan elke put.Meng goed en incubeer de plaat op ijs gedurende 30 minuten. Bereid na de incubatie een één-X-permanent en wasbuffer door 25 milliliter van de meegeleverde 10X-voorraad in 225 milliliter Ultrapure water te verdunnen. Prime de plaat wasmachine met een-X buffer en was de plaat met 55 microliter van de one-X buffer met behulp van een negen keer wascyclus zoals eerder beschreven.Om te beginnen meng je een milliliter van het anti-caspase 3-antilichaam met twee milliliter van de one-X-permanent en wasbuffer. Voeg 25 microliter per put van het mengsel toe aan de vaste cellen. Gebruik een microplate orbitale shaker om de plaat voorzichtig te roeren.Laat de plaat een uur op ijs staan. Herhaal aan het einde van de incubatie de wasstap negen keer met de één-X-permanent en wasbuffer. Voeg vervolgens 25 microliter van de FACS wasbuffer toe aan alle putten van de plaat.Pipet een paar keer op en neer om de oplossing te mengen. Breng ten slotte de gemengde monsters over in microtiterbuizen. Vul de buizen met de FACS wasbuffer aan tot een totaal volume van 200 microliters en ga naar de flow cytometrieanalyse.Na anti-CD-3, CD-28 stimulatie, een toename van caspase-3 activering en de TCR downregulation werden waargenomen in zowel de onbehandelde als de DMSO mock-behandelde monsters. Ook werd een toename van de CD-69 expressie waargenomen in beide gestimuleerde monsters. De dexamethasone behandelde monsters toonden een toename van caspase-3 activering onafhankelijk van CD-69 upregulatie, zoals verwacht voor de onafhankelijke apoptose-inducerende werking en de TCR stimulatie.De selectieve aantasting van T-cel activeringsverschijnselen werd aangetoond door verschillende remmers die ofwel caspase-3-activering en CD-69 up-regulation onderdrukten, ofwel cd-69 up-regulatie remden, maar caspase-3-activering niet aantastten. Er waren ook remmers die zich niet richten op een relevante kinase van de TCR-signalering pad, en dus niet onderdrukken zowel CD-69 upregulation en caspase-3 activering. Het scherm resultaat van staurosporine, de apoptose-positieve controle, toonde hoge niveaus van caspase-3 activering, zoals verwacht.Echter, het resultaat toonde ook lage niveaus van CD-69 expressie die kan worden toegeschreven aan ofwel de gemedieerde remming van eiwit kinase C of de geïnduceerde apoptose vóór CD-69 expressie. Vergelijking van verschillende testprotocollen toonde geen verschillen in actieve caspase-3, CD-69, en TCR kleuring van de negatieve controle, de positieve controle voor celdood, de controle van het voertuig, en een remmer-behandeld monster. De pre-incubatiestadia zijn bedoeld om het gebruik van de kleine volumeplaat voor het kweken van de cellen te vergemakkelijken.Het standaard centrifuge-afhankelijke protocol is ook opgenomen in het manuscript. Potentieel-interessante remmers of doelen kunnen worden gevalideerd met behulp van verschillende celtypes en ook in verschillende soorten, zoals pagopherale muis lymfocyten of menselijke primaire cellen. Latere karakterisering van de geïdentificeerde moleculen en de doelen kan helpen bij het verbeteren van het begrip van T-cel biologie en uit te breiden op mogelijke doelen voor immunomodulatie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live beeldvorming van T-cel signaleringscomplex Vorming

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...