Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
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Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le ministère de l’éducation, 2014-T2-1-136 Singapour Conseil du Singapour ministère de la santé National de recherches médicales et NMRC CBRG15may017 (pour N.R.J.G.).

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L’auteur Chyan Ying Ke est un employé de Curiox Biosystems, qui produit la rondelle DA-cellulaire et plaques de DA-cellulaires utilisés dans cet article.

La stratégie de dépistage proposée ici évalue la capacité des inhibiteurs de petites molécules à supprimer les effets de l’apoptose dans les thymocytes après stimulation, en plus des marqueurs plus conventionnelles de lymphocytes activation-CD69 upregulation et downregulation TCR . Marqueurs additionnels peuvent être également inclus pour permettre l’analyse des thymocytes différents sous-ensembles32. Un aspect intéressant du test actuel réside dans le fait que les inhibiteurs qui entravent la TCR signalisation atténuerait également l’induction de l’apoptose, soulignant davantage la distinction des effets indépendants TCR que les inhibiteurs peuvent avoir à induire la mort cellulaire. En outre, un écoulement cytometry-test permet l’utilisation de multiples lectures comme marqueurs d’activation distinctes, qui pourront faire rapport les effets des inhibiteurs sur des branches individuelles distinctes du TCR de signalisation. Dans le cas présenté ici, il y avait des inhibiteurs qui ont montré une inhibition différentielle de l’activation de la caspase-3 et CD69 upregulation. Parce que certains composés peuvent affecter les fonctions domestiques tels que la synthèse des protéines ou le trafic vésiculaire, il n’est pas étonnant d’observer les effets sur la stimulation de l’expression des marqueurs de novo synthétisés (p. ex., CD69) mais pas sur post-traductionnelle modifications (par exemple, l’activation protéolytique de la caspase-3).
Comme l’essai présenté ici mesure l’apoptose comme une lecture, il est impératif que les effets toxiques latentes des inhibiteurs ne masquent pas les résultats. Par exemple, dans l’écran, on a fait pas diluer la staurosporine au-delà de 1 nM, bien qu’il soit toujours toxique pour les cellules à cette concentration. Les résultats représentatifs sont en accord avec la staurosporine étant un inhibiteur de la kinase de promiscuité et d’un inducteur de l’apoptose,33. Sans une dilution suffisante des composés testés à des concentrations non toxiques, il est possible d’oublier les hits potentiels.
La stratégie de dépistage détaillée ici serait difficile à appliquer à l’homme en raison de complications liées à l’obtention d’un nombre suffisant de thymocytes de criblage à haut débit. Toutefois, il est possible d’obtenir des échantillons de thymus humain de biopsies cardiaques pédiatriques34,35 ou de foetus36,37. Néanmoins, comme le RCT de signalisation des voies et des séquences d’acides aminés des protéines de signalisation sont conservés en grande partie entre les souris et les humains, le dosage de thymocytes fournit une stratégie de criblage préliminaire utile, et les résultats obtenus avec ce dosage à l’aide de la souris les thymocytes peuvent, ensuite, être vérifiées dans les lymphocytes humains primaires.
Une des limitations du protocole dépendante de centrifugation conventionnelle se rapporte à la perspective de la perte de cellules, qui peut être attribuée à la nature de plusieurs étapes du processus, qui implique des étapes comme la perméabilisation de la cellule et centrifugation. Chaque centrifugation et l’étape de la remise en suspension se traduisent inévitablement par la perte de cellules. Bien que ces pertes ne soient pas critiques pour les études portant sur un nombre limité d’échantillons, il pourrait poser des problèmes lorsqu’il est appliqué dans le dépistage des débits plus élevés, en particulier fur le dosage format de 96 - à 384 à 1536-puits. Une façon de contourner ce problème consiste à utiliser des perméable à la cellule fluorescente caspase capteurs38 qui permettent la détection d’activation de la caspase tout en évitant les complications de la perméabilisation de la cellule et plusieurs lavages5. Alternativement, utilisant une méthode indépendante de centrifugation de lavage des cellules à flux laminaire est également possible pour minimiser la perte de cellules. Avec une plaque automatisée station en conjonction avec une plaque de mur-moins de lavage, les cellules sont baignées par flux laminaire sans l’aide d’une centrifugeuse. La dilution exponentielle des réactifs permet le rinçage minutieux et efficace des cellules en moins de 3 min, ce qui représente une dilution équivalente à deux cycles de lavage centrifuge. Sans les sollicitations extérieures en raison de la centrifugation, les cellules ne sont plus viables et réduire au minimum les pertes des cellules.
Nous avons également examiné la possibilité d’utiliser la plaque automatisée station de lavage après les thymocytes en fond U 96 puits de culture plaques et, en outre, la mise en culture des cellules directement dans le mur sans plaques compatibles avec la plaque automatisée station de lavage. La mise en culture des cellules dans les plaques du mur sans permis l’élimination de toutes les étapes de centrifugation et réduit au minimum la perte de cellules en éliminant la nécessité d’un transfert de l’échantillon à travers des plaques. En général, les trois protocoles différents sont comparables en efficacité de la stimulation et la coloration. La station de lavage automatisé offre l’avantage de l’automatisation, la vitesse et efficacité, ce qui rend plus facile pour l’analyse des débits plus élevés. En outre, avec une automatisation accrue, les étapes de lavage peuvent être effectuées plus rapidement, et il y a une plus grande cohérence entre les expériences ou les expérimentateurs. Toutefois, la station de lavage a certains inconvénients : grands volumes de mémoires tampon de lavage sont requises pour rondelle d’amorçage (150 mL / changement de tampon, dont 50 mL est utilisée pour le lavage) ; Redoublez de prudence est nécessaire lors de la manipulation de la plaque pour éviter toute contamination croisée des puits en raison de la répartition limitée entre les puits de la plaque de petit volume ; tampon résiduel de 25 µL dans les puits après lavage nécessite l’utilisation de réactifs préparés à un niveau plus élevé que la concentration de 1 x. Pour aborder les questions du volume résiduel et capacité de volume limité de la plaque, un accessoire pour augmenter le volume de l’incubation de 70 µL à 150 µL peut être ajouté, facilitant l’adoption de protocoles classiques. Tandis que les systèmes de manutention automatisés plaque sont actuellement disponibles, ils ont une empreinte significative par rapport au système de lavage laminaire, qui est une petite unité de ~ 1 pi (~0.028 m3). En outre, l’intégration de la centrifugation en plaque automatisée des systèmes de manutention est un défi, limitant leur utilisation dans le lavage de la cellule. Il n’y a actuellement aucune autre cellule indépendante de centrifugeuse lavage des instruments disponibles, autant que nous sachions.
La stratégie de dépistage présentée ici est en mesure d’identifier des petites molécules et leurs kinases cible prétendue, qui affectent la signalisation de TCR et l’activation des lymphocytes T. La bibliothèque utilisée ici est composé principalement de petites molécules inhibiteurs de kinases et a réussi à générer un certain nombre de potentiellement intéressant hits. Le protocole peut également être facilement appliqué aux bibliothèques d’inhibiteur d’autres classes d’enzymes ou d’autres types de petites molécules, ainsi qu’aux bibliothèques d’autres composés (par exemple, diverses macromolécules). Le protocole permet également à l’écran des autres types de cellules, telles que les lymphocytes T périphériques ou des cellules immortalisées, y compris ceux exprimant TCRs transgéniques ou transportant des systèmes de journaliste. Identifier et caractériser de nouveaux médiateurs de T-cellule signalisation peut améliorer notre connaissance de la voie de signalisation ainsi que l’aide au développement de la thérapie ciblée en maladies immunitaires13,14,15, 16. dans l’ensemble, cette étude s’ajoute à la gamme des options disponibles pour la détection des médiateurs de T-cellule signalisation par criblage à haut débit des essais.

Les cellules T sont une lignée des lymphocytes qui jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’immunité adaptative. Ils expriment le TCR, qui leur permet de reconnaître leurs ligands, complexes consistant en une molécule complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) avec un peptide lié, qui se trouvent sur les surfaces des présentatrices d’antigène (CPA) des cellules. Le déclenchement du TCR voie grâce à l’interaction TCR/MHC de signalisation est indispensable pour l’activation des lymphocytes T et développement1.
Dans le développement des lymphocytes T, OS-moelle osseuse des cellules souches hématopoïétiques (CSH) migrent vers le thymus, où ils subissent une différenciation et passent par les étapes de lymphocytes de progression lineage2. Les thymocytes double-positifs de (DP), exprimant le CD4 et CD8 corécepteurs, s’engager avec self-peptide/MHC sur les véhicules. Thymocytes avec une affinité modérée pour leurs ligands du soi-peptide/MHC mature pour devenir les thymocytes (SP) CD4 ou CD8 positifs single, un processus qualifié de sélection positive. À l’inverse, les thymocytes qui reçoivent une stimulation excessive de TCR par le biais de la self-peptide/CML subissent l’apoptose via une sélection négative3,4. Ce processus de l’apoptose induite par stimulation, dépendante de la caspase peut être simulée en vitro en stimulant les thymocytes, par exemple avec des perles de recouverts d’anticorps anti-CD3/285. Des cellules T matures qui passent le processus de sélection sont activées par des ligands non-soi-peptide/MHC de TTB dans la périphérie. Self-peptide/CML est toujours d’actualité pour les cellules T périphériques, dans le cadre de la tonique de signalisation de survie et prolifération homéostatique, la différenciation des cellules T helper et l’amélioration des réponses de cellules T à non-soi-peptide/CML à travers coagonism6,7,8,9. Fixation de TCR de haute affinité pour le ligand de peptide/MHC active plusieurs voies de signalisation en aval, qui impliquent de nombreuses molécules de signalisation formant un complexe TCR signalisation réseau10. Les voies de signalisation de TCR ont été étudiés pendant plusieurs décennies, et encore la découverte de nouveaux médiateurs de la voie ne montre aucun signe de ralentissement11,12. La modulation des voies de signalisation de TCR a une pertinence clinique et peut impliquer potentialisant T-lymphocytes pour applications immunothérapeutiques ou l’inhibition des réponses de lymphocytes T pour le contrôle de l’auto-immunité,13. Stratégies pour la modulation des réponses des cellules T dépendent principalement de la perturbation de la kinase ou phosphatase activité14,15,16.
Les auteurs décrivent une application d’un écoulement cytometry-axée sur les test de screening de composés chimiques petits pour leur capacité à moduler la signalisation de TCR et activation de lymphocytes T17. Le test repose sur le phénomène des thymocytes activation de la voie de l’apoptose lorsqu’ils sont exposés à des signaux forts de TCR. L’essai est suffisamment sensible pour identifier les changements dans l’intensité de la stimulation ; incubant thymocytes exprimant le TCR transgénique avec tétramères peptide/MHC avec l’affinité a entraîné une augmentation correspondante de caspase activation-utilisé comme une mesure de l’apoptose réponse5. Pour l’écran, nous avons utilisé une bibliothèque des inhibiteurs de la kinase et évalué leur capacité à moduler la réponse de thymocytes à des signaux forts de TCR.
Plusieurs stratégies d’écoulement cytometry- ou fluorescence-journaliste ont été décrites pour le criblage à haut débit d’un assortiment de phénotypes d’activation périphérique dans divers sous-ensembles de T-cellule. Ces stratégies comprennent l’utilisation de génétiques reporters fluorescents pour évaluer le moment et l’ampleur de l' activation de lymphocytes T18, l’utilisation de dégranulation comme une lecture de cytotoxique lymphocytes activité19,20et l’analyse de la phosphorylation de diverses protéines impliquées dans21de signalisation cellulaire.
Le test de dépistage présenté ici est en mesure d’identifier correctement composés qui inhibent les molécules canoniques du TCR signalisation voie, mais aussi de potentiels, de nouveaux composés avec des effets inhibiteurs sur la signalisation de TCR. Par exemple, nous avons identifié des inhibiteurs de GSK3β et Hsp90 comme de nouveaux composés qui affectent les cellules T réponses17. Le test est capable de distinguer les inhibiteurs de transduction du signal, due à une diminution de la réponse apoptotique, contre les effets de la TCR-indépendant des inhibiteurs sur la toxicité cellulaire de gêner. En plus de l’induction de l’apoptose, nous mesurons l’upregulation CD69 et TCR downregulation comme marqueurs d’activation. Comme TCR signalisation réseaux sont complexes, l’utilisation des affichages multiples peut augmenter les chances de découvrir des molécules ayant des effets spécifiques sur une voie unique. Ici, nous présentons également l’utilisation d’un protocole indépendant de centrifugation comme une alternative de haut débit pour le protocole initial pendant la coloration des cellules en vue de la cytométrie. Le test décrit dans cet article utilise une petite bibliothèque composée des inhibiteurs de la kinase, mais, en principe, il peut être utilisé pour le dépistage de débit plus élevé. La bibliothèque de choix peut également incorporer une variété d’inhibiteurs ou d’autres molécules.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

Le récepteur des cellules T (TCR) signalisation voie comprend une multitude de médiateurs qui transmettent les signaux lors de l’activation du TCR. Différentes stratégies ont été proposées et mises en œuvre pour l’identification de nouveaux médiateurs de signalisation de la TCR, qui permettrait d’améliorer la compréhension des processus de lymphocytes T, y compris l’activation et la sélection thymique. Nous décrivons un test de dépistage qui permet l’identification de molécules qui influencent la TCR signalisation basée sur l’activation du développement des thymocytes. TCR de forts signaux provoquent des thymocytes en développement activer la machinerie apoptotique dans un processus appelé sélection négative. Grâce à l’application des inhibiteurs de la kinase, ceux avec des cibles qui affectent le TCR de signalisation sont en mesure de substituer le processus de sélection négative. La méthode détaillée dans cet article peut servir à identifier les inhibiteurs de kinases canoniques avec des rôles établis dans les voies de signalisation de TCR et aussi les inhibiteurs de kinases nouveau qui doit encore être mis en place dans les voies de signalisation de TCR. La stratégie de dépistage ici peut être appliquée aux écrans de débit plus élevé pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans la signalisation de TCR.

L’approche pour le test de dépistage est résumée dans la Figure 1 a. Les inhibiteurs de la kinase ont tout d’abord examinés leurs effets latents sur la viabilité des thymocytes. Comme témoin positif pour l’apoptosis, dexaméthasone a été utilisé comme agent pro-apoptotique. Le processus de blocage pour la population de cellules vivantes a été déterminé à l’issu des contrôles positifs traités au dexaméthasone (Figure 1 b) et le groupe témoin négatif. Les inhibiteurs ont été testés tout d’abord à 10 µM sur les thymocytes, et le pourcentage de cellules viables a été mesuré après incubation pendant 18 heures. Une fenêtre de 20 % pour la mort cellulaire a été choisie tels que les composés qui induit une plus grande que 20 % perte de cellules dans la barrière de cellules vivantes, par rapport aux échantillons traités DMSO, ont été testés à des concentrations plus faibles (Figure 1 b). Parcelles de FACS représentatifs des échantillons choisis imprégnées d’insecticide inhibiteur sont présentés pour illustrer l’analyse de la viabilité. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one ; CAS 154447-36-6), un inhibiteur de PI3K22, n’augmente pas considérablement la mort cellulaire à 10 µM, et l’inhibiteur servait à 10 µM pour les analyses ultérieures. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide ; CAS 1202884-94-3), un inhibiteur double de PI3Kα/mTOR23, provoquée par des niveaux élevés de mort cellulaire à 10 µM et à 1 µM, mais pas à 0,1 µM et 0,1 µM était déterminé à la concentration appropriée pour application dans les essais en aval. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one ; CAS 62996-74-1), un inhibiteur de kinase C pan-avec une capacité établie à induire l’apoptose24, induit une apoptose significative à toutes les concentrations testées, même à 0,1 µM. Il a été utilisé pour des tests ultérieurs à 0,1 µM comme un contrôle positif supplémentaire.
Les concentrations finales des inhibiteurs ont été sélectionnées selon les concentrations plus élevées dans lequel ils ne pas amplifier la mort cellulaire par plus de 20 % des échantillons traités DMSO. Avec les concentrations finales des inhibiteurs déterminés, une plaque de stock d’inhibiteurs a été préparée tel que tous les inhibiteurs sont 500 fois la concentration lorsqu’il est appliqué aux cellules. La figure 1 illustre le schéma de la plaque de stock avec les concentrations finales des inhibiteurs. Dans le protocole alternatif d’incubation des cellules directement dans les plaques de faible volume de l’écoulement laminaire, test de lavage, l’utilisation de petits volumes ont nécessité une dilution supplémentaire des inhibiteurs. Pour s’assurer que le contenu de DMSO des cultures après ajout de l’inhibiteur ne serait pas trop élevé pour les cellules, les inhibiteurs ont été davantage dilués dans RPMI complète, par un facteur de dilution de 5, tels qu’ils étaient à 100 fois la concentration prévue lorsqu’il est appliqué à la cellules.
Les inhibiteurs, dilués à des concentrations non toxiques, ont été utilisés dans le test pour induites par la stimulation-TCR apoptose des thymocytes5,17. La stimulation a été réalisée à l’aide de perles de l’anti-CD3/CD28 pendant 18 h, et les cellules ont été colorés par la suite pour l’activation de la caspase-3 dans le CD4+ et CD8+ DP population de thymocytes (Figure 2). Une augmentation de l’activation de la caspase-3, l’expression CD69 et une régulation négative du RCT, ont été observés dans l’anti-CD3/CD28-stimulée tant les DMSO mock-anti-CD3/28-stimulée échantillons traités, comparés aux échantillons non stimulées. Les échantillons traités au dexaméthasone ont montré une augmentation de l’activation de la caspase-3 indépendant de CD69 upregulation, qui est attendue de l’effet inducteur de l’apoptose étant indépendante de la stimulation du TCR.
Figure 3 résume les résultats de la bibliothèque de dosage pour certains inhibiteurs de dépistage. Activation de la caspase-3 tant CD69 peuvent servir à identifier les inhibiteurs potentiels d’intérêt due à la suppression de l’expression. Comme prévu, inhibiteurs des médiateurs canoniques de la signalisation de TCR a montré comme positifs hits dans les écrans. Ces inhibiteurs, qui présentaient des degrés de puissance inhibitrice, inclus des inhibiteurs à large spectre qui ciblent plusieurs kinases et, en outre, plus des inhibiteurs spécifiques. Certains inhibiteurs ont pu supprimer l’activation de la caspase-3 tant upregulation CD69 (Figure 3 b, rangée du haut, panneaux de gauche). Un inhibiteur de tel est bisindolylmaléimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione ; CAS 137592-45-1), qui inhibe toute protéine kinase C isoformes, en plus de la protéine kinase A et PDK125,26,27. Un autre inhibiteur de cette catégorie est CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide ; CAS 494772-86-0), un inhibiteur proposé de l’IKK228.
Il y avait des composés qui inhibent CD69 upregulation mais ne portait pas atteinte d’activation de la caspase-3 (Figure 3 b, rangée du haut, panneaux de droite). CAY10626, un inhibiteur de mTOR et PI3Kα23et U-0126 (2, 3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] méthylène]-butanedinitrile ; CAS 109511-58-2), un inhibiteur MEK29, ont été quelques-uns des inhibiteurs identifiés. Les résultats montrent que différents inhibiteurs ciblant différentes kinases des branches spécifiques de la voie de signalisation de TCR, surtout celles qui visent les kinases de stade avancé, peuvent entraîner une dégradation sélective des phénomènes d’activation de lymphocytes T.
Il y avait aussi des inhibiteurs qui n’a pas supprimé les CD69 upregulation et activation de la caspase-3 (Figure 3 b, rangée du bas, panneaux de gauche). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - hydroxy-acide bis, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester ; CAS 33069-62-4), un perturbateur de microtubules dynamiques30et necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile ; CAS 337349-54-9), un inhibiteur de kinase de RIP131, sont deux inhibiteurs identifiés pour être dans cette catégorie. Dans ce cas où l’upregulation CD69 et activation de la caspase-3 n’étaient pas affaiblies, cela peut être due à des inhibiteurs de la pas ciblant une kinase pertinente du TCR voie de signalisation.
Comme mentionné précédemment, la staurosporine a été utilisée dans les écrans, à une concentration qui a encore induit l’apoptose dans les thymocytes. Comme prévu, l’échantillon de la staurosporine traités a montré des niveaux élevés d’activation de la caspase-3 (Figure 3 b, rangée du bas, colonne de droite). Les faibles niveaux d’expression CD69 peuvent être attribuées à l’inhibition par la staurosporine de PKC, comme bisindolylmaléimide II, un autre inhibiteur de PKC-pan, supprima également l’expression de CD69. Par ailleurs, la staurosporine induit l’apoptose dans les cellules avant ils ont réussi à réguler positivement l’expression CD69.
Pour augmenter le débit et l’automatisation du protocole, des protocoles parallèles qui impliquait l’utilisation d’une plaque automatisée système via flux laminaire de lavage ont été préparés. Deux protocoles distincts à l’aide de cet appareil de lavage automatique plaque ont été testés et comparés à la méthode conventionnelle de cultivant les cellules en plaques 96 puits et de coloration des cellules dans un protocole de centrifugation-dépendant. Une méthode consistait à cultiver des cellules dans des plaques de 96 puits, conformément à la procédure standard, et ensuite, transférer les cellules aux plaques compatibles avec la rondelle plaque automatisé pour la coloration les étapes (Figure 4, DA-lavage échantillons). L’autre méthode impliquée cultivant les cellules directement dans les plaques plaque rondelle-compatible et en continuant avec le protocole de coloration sur la même plaque (Figure 4, échantillons de DA-Culture). Les protocoles de centrifugation indépendant ne donnent pas beaucoup de différences perceptibles dans active caspase-3, CD69 ou TCRβ coloration à travers les différents échantillons testés, contre le protocole conventionnel de centrifugation-dépendante (Figure 4). Différences dans l’intensité de coloration peuvent être attribuées à l’utilisation des anticorps à des concentrations légèrement différentes au cours des étapes de coloration.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figure 1 : Viabilité des thymocytes après traitement avec des inhibiteurs de. (A) schéma expérimental des principales étapes dans le test de dépistage. Il y a trois méthodes proposées pour la stimulation et la coloration des thymocytes utilisées dans le test de l’activation, à savoir (1) la mise en culture des thymocytes dans des plaques de 96 puits standards, suivies d’une coloration à l’aide d’un protocole centrifugation conventionnels, (2) les cultivant des thymocytes en plaques 96 puits standard, suivies d’une coloration à l’aide d’un protocole de lavage indépendants de centrifugation et (3) la mise en culture des thymocytes dans des petits plats, suivie de coloration dans les mêmes plaques en utilisant un protocole de lavage indépendants de centrifugation. (B) Gating stratégies utilisées dans les dosages de viabilité. La porte des cellules vivantes a été dérivée de la dispersion vers l’avant (FSC) et trace de diffusion latérale (SSC), comme décrit précédemment17. Inhibiteurs qui étaient considérées comme trop toxique à la concentration d’essai ont été soumis à plus amples essais de viabilité à 10 fois plus faibles concentrations. Imprégnées d’insecticide inhibiteur des échantillons représentatifs sont présentés. Remarque le contrôle commun (DMSO traités [DMSO]) utilisé pour la 1 µM et 0,1 µM échantillons. (C) schéma d’inhibiteurs dilués. Une représentation schématique des plaques d’inhibiteurs diluées dans le DMSO à une concentration de 500 fois la concentration finale prévue. Chacun représente bien un inhibiteur unique ; les puits gris sont vides. Les concentrations de montré sont la concentration finale lors de l’ajout de cultures cellulaires, à savoir 10 µM (rouge foncé), 1 µM (fuchsia) et 0,1 µM (bleu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figure 2 : Schéma de l’essai d’activation thymocyte. (En haut) Colonnes 1 et 12 sont réservés pour les contrôles, tandis que les colonnes 2 à 11 sont imprégnées d’insecticide inhibiteur échantillons (beige). Le contrôle négatif (non stimulé [NS] ; gris) occupe puits A1 à D1, et le contrôle positif pour la mort des cellules (traités au dexaméthasone [DEX] ; violet) occupe puits E1 à H1. Colonnes 2 à 12 contiennent des thymocytes stimulées avec des perles de l’anti-CD3/CD28. Le contrôle positif pour l’activation du thymocyte (échantillons stimulés [α-CD3/CD28] ; vert) occupe puits A12 à D12 et le contrôle du véhicule (stimulée et imprégnées de DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO] ; rouge) occupe les puits E12 à H12. (En bas) Flow cytometry parcelles de la caspase-3 actif (ActCasp3), CD69 et TCRβ la coloration des thymocytes bloquées dans la porte (DP) de double-positifs. Des emplacements représentatifs des différents contrôles apparaissent. NS = non stimulé ; DEX = échantillons traités au dexaméthasone ; Α-CD3/CD28 + DMSO = échantillons stimulée avec perles CD3/CD28-enduit et traité avec le DMSO ; Α-CD3/CD28 = échantillons stimulés avec perles CD3/CD28-enduit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figure 3 : Sélection de la bibliothèque de l’inhibiteur sur l’activation des thymocytes. (A) résume les données du test de l’activation. Ce sont les résultats d’une expérience représentative montrant les valeurs normalisées des cellules activées caspase-3 et expression CD69 pour certains inhibiteurs. Normalisation a été faite en comparant le pourcentage de cellules dans l’active-caspase-3-positives ou porte CD69 positifs pour la valeur du contrôle imprégnées de DMSO, qui a une valeur relative de 0 dans le graphique. (B) sélectionné FACS parcelles. Flow cytometry parcelles d’inhibiteurs qui suppriment les activation de la caspase-3 et CD69 upregulation (en haut à gauche), supprimée seulement CD69 upregulation (en haut à droite), ou n’avait aucun effet sur l’activation de la caspase-3 et CD69 upregulation (en bas à gauche). Parcelles de l’échantillon la staurosporine traités sont présentés pour illustrer les effets de l’utilisation d’un inhibiteur à des concentrations toxiques (en bas à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figure 4 : Comparaison des protocoles différents test. Flow cytometry parcelles de la caspase-3 actif (ActCasp3), CD69, et TCRβ la coloration des thymocytes DP suivant les trois différents protocoles de dosage. Quatre différentes conditions sont testées, à savoir le contrôle négatif (non stimulé [NS]), le contrôle positif pour la mort de cellules (traités au dexaméthasone [DEX]), le contrôle du véhicule (stimulée et imprégnées de DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) et imprégnées d’un inhibiteur de échantillon (stimulée et traités PIK-75 [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Classique = la mise en culture des thymocytes dans des plaques de 96 puits standard et coloration avec un protocole centrifugation conventionnels ; DA-lavage = la mise en culture des thymocytes dans des plaques de 96 puits standard et les taches à l’aide d’un flux laminaire lavage protocole ; DA-Culture = la mise en culture des thymocytes dans des petits plats et coloration dans les mêmes plaques à l’aide d’un protocole de lavage à flux laminaire.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Cet article utilise un écoulement cytometry-test aux bibliothèques d’écran d’inhibiteurs chimiques pour l’identification des inhibiteurs et leurs objectifs qui influent sur la signalisation de récepteur de T-cellule. Les méthodes décrites ici peuvent aussi être étendues pour des projections de haut débit.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Notre analyse à haut débit s’ajoute aux méthodes disponibles pour l’identification des petites molécules et de leurs cibles qui modulent la signalisation TCR et l’activation des cellules T. Notre analyse a un aspect auto-correcteur en filtrant les composés toxiques et en identifiant les inhibiteurs de la signalisation TCR et de l’apoptose induite par la stimulation. L’identification des médiateurs de la signalisation de TCR peut aider dans les développements de la thérapie pour des maladies immunisées.Nous avons fourni un stimulus fort pour des thymocytes dérivés des souris TCR-polyclonal. Il est possible d’utiliser des souris transgéniques TCR et de les stimuler avec d’autres tétramers ligand peptidiques pour une stimulation plus faible. Cet essai implique l’utilisation de petits volumes et de plaques à petit volume pour la culture des cellules.Cela nécessite une manipulation minutieuse des plaques et de son contenu. Il existe de nombreux composés dans la bibliothèque des inhibiteurs de la kinase qui sont considérés comme dangereux. Pour des raisons de sécurité, traitez tous les composés comme étant tout aussi dangereux et suivez les précautions de sécurité recommandées par le fournisseur.Pour commencer le traitement des thymocytes avec des inhibiteurs de la kinase, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 40 microlitres par puits de thymocytes à une plaque à petit volume. Mettez la plaque sur la glace. Puis pipette une partie des inhibiteurs de kinase, DMSO, et dexaméthasone, et quatre parties du média complet de RPMI dans une plaque de 96 puits.Désigner huit puits de la plaque à petit volume à des témoins non traités, quatre puits pour les contrôles positifs traités par la désxaméthasone pour la mort cellulaire en ajoutant la dexaméthasone diluée à la concentration de cinq micromolaires, et quatre puits aux commandes traitées par le véhicule, en ajoutant 0,5 microlitres de la DMSO diluée. Ensuite, à partir des puits correspondants de la plaque inhibitrice, ajouter 0,5 microlitres de chaque inhibiteur dilué à la plaque de 96 puits. Pour commencer la stimulation des thymocytes, assurez-vous d’abord que les perles anti-CD-3 et CD-28 sont uniformément re-suspendues.Ensuite, lavez un millilitre des perles avec deux millilitres du tampon PBS. Mettez le tube sur un support magnétique pour séparer les perles du surnatant et aspirer la solution. Suspendez ensuite les perles en un millilitre du milieu complet du RPMI.Ajouter 10 microlitres par puits de la suspension de perle à chaque échantillon traité par inhibiteur, les quatre échantillons traités par DMSO et quatre des huit échantillons non traités. Ajouter 10 microlitres de l’IRM complète aux quatre autres puits non traités. Utilisez un shaker orbital microplaqué pour agiter doucement la plaque.Ensuite, incuber les thymocytes en 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant 17 à 20 heures, ou pendant la nuit. Prime une laveuse automatique de plaque d’écoulement laminaire, d’abord avec 150 millilitres de solution d’éthanol Tween, puis avec de l’eau déionisée complétée par 1%Tween 20, et enfin, avec tampon de lavage FACS. À la fin de l’incubation à l’aide du système de lave-plaques, lavez la plaque avec un tampon de lavage FACS à l’aide d’un cycle de lavage neuf fois.Chaque lavage ajoute et élimine 55 microlitres de tampon de lavage par écoulement laminaire, ce qui entraîne une dilution exponentielle des reagents dans les puits. Pour tacher les antigènes de surface, diluez d’abord un volume unitaire d’anticorps anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 et anti-CD-69 dans des volumes de 100 unités du tampon de lavage FACS. Puis suspendre à nouveau les cellules dans 25 microlitres du mélange d’anticorps soudants.Utilisez un shaker orbital microplaqué pour agiter doucement la plaque, puis laissez la plaque sur la glace pendant 30 minutes. Pour fixer les cellules, lavez d’abord la plaque avec 55 microlitres de tampon de lavage FACS en utilisant neuf fois le cycle de lavage tel que décrit précédemment. Ajouter ensuite 50 microlitres du tampon fixation-impermébation à chaque puits.Bien mélanger et incuber la plaque sur la glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, préparer un perm one-X et laver le tampon en diluant 25 millilitres du stock fourni de 10X en 225 millilitres d’eau Ultrapure. Amorcez la laveuse à plaques avec un tampon X et lavez la plaque avec 55 microlitres du tampon one-X à l’aide d’un cycle de lavage neuf fois tel que décrit précédemment.Pour commencer, mélangez un millilitre de l’anticorps anti-caspase 3 avec deux millilitres du perm one-X et du tampon de lavage. Ajouter 25 microlitres par puits du mélange aux cellules fixes. Utilisez un shaker orbital microplaqué pour agiter doucement la plaque.Laissez la plaque sur la glace pendant une heure. À la fin de l’incubation, répétez l’étape de lavage neuf fois avec le perm one-X et le tampon de lavage. Ajouter ensuite 25 microlitres du tampon de lavage FACS à tous les puits de la plaque.Pipette de haut en bas à quelques reprises pour mélanger la solution. Enfin, transférer les échantillons mélangés dans des tubes de microtiter. Rechargez les tubes avec le tampon de lavage FACS à un volume total de 200 microlitres, et procéder à l’analyse de cytométrie de flux.Après la stimulation anti-CD-3, cd-28, une augmentation de l’activation de caspase-3 et la downregulation de TCR ont été observées dans les échantillons non traités et les échantillons simulés de DMSO. En outre, une augmentation de l’expression de CD-69 a été observée dans les deux échantillons stimulés. Les échantillons traités à la dexaméthasone ont montré une augmentation de l’activation de caspase-3 indépendamment de l’upregulation de CD-69, comme prévu pour l’effet apoptosis-induisant indépendant et la stimulation de TCR.L’affaiblissement sélectif des phénomènes d’activation de T-cellule a été montré par différents inhibiteurs qui ont supprimé l’activation de caspase-3 et le CD-69 up-regulation, ou ont empêché cd-69 up-regulation, mais n’ont pas altéré l’activation de caspase-3. Il y avait également des inhibiteurs qui n’ont pas visé une kinase pertinente de la voie tcr-signalisation, et n’ont donc pas supprimé la réglementation de CD-69 et l’activation de caspase-3. Le résultat d’écran de staurosporine, le contrôle apoptosis-positif, a montré des niveaux élevés d’activation de caspase-3, comme prévu.Cependant, le résultat a également montré de faibles niveaux d’expression de CD-69 qui peuvent être attribués à son inhibition médiatisée de la protéine kinase C ou à son apoptose induite avant l’expression de CD-69. La comparaison des différents protocoles d’analyse n’a montré aucune différence dans la caspase-3 active, le CD-69, et la coloration de TCR du contrôle négatif, le contrôle positif pour la mort cellulaire, le contrôle de véhicule, et un échantillon inhibiteur-traité. Les stades de pré-incubation sont destinés à faciliter l’utilisation de la plaque à petit volume pour la culture des cellules.Le protocole standard dépendant des centrifugeuses est également fourni dans le manuscrit. Des inhibiteurs ou des cibles potentiellement intéressants peuvent être validés à l’aide de différents types de cellules et aussi chez différentes espèces, telles que les lymphocytes de souris pagophéraux ou les cellules primaires humaines. La caractérisation ultérieure des molécules identifiées et des cibles peut aider à améliorer la compréhension de la biologie des cellules T et à élargir les cibles possibles pour l’immunomodulation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Recherche

Immunologie et infection

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RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Une plate-forme de dosages anti-biofilm Adaptés à l&#39;exploration des bibliothèques de composés naturels

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Utilisation de cristallographie aux rayons X, biophysique, et des tests fonctionnels pour déterminer les mécanismes d&#39;administration des lymphocytes T Reconnaissance des récepteurs du cancer Antigènes

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...