Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Singapur Gesundheitsministeriums National Medical Research Council, NMRC CBRG15may017 und die Singapore Ministry of Education, 2014-T2-1-136 (zu N.R.J.G.) unterstützt.

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Der Autor Chyan Ying Ke ist ein Mitarbeiter des Curiox Biosystems, die DA-Zelle Unterlegscheibe und DA Zellplatten in diesem Artikel verwendeten produziert.

Die hier vorgeschlagene Screeningstrategie bewertet die Fähigkeit des Small-Molecule-Inhibitoren, die Apoptotic Effekte in Thymozyten nach Stimulation, neben eher konventionellen Marker der T-Zell-Aktivierung-CD69-Hochregulation und TCR Herabregulation unterdrücken . Zusätzliche Marker können auch ermöglichen die Analyse der verschiedenen Thymocyte Teilmengen32einbezogen werden. Ein interessanter Aspekt des aktuellen Tests liegt in der Tatsache, dass Inhibitoren, die TCR-Signalisierung behindern auch die Induktion der Apoptose, weitere Hervorhebung die Unterscheidung des TCR-unabhängige Effekte haben die Inhibitoren auf Zelltod induzieren dämpfen würde. Darüber hinaus ermöglicht ein Flow-Zytometrie-based Assays die Verwendung von mehrere Messwerte als unterschiedliche Aktivierungsmarker, die die Auswirkungen der Inhibitoren auf getrennten einzelnen Zweigen der TCR-Signalisierung berichten könnte. Im hier vorgestellten Fall gab es Hemmstoffe, die eine differenzierte Hemmung der Aktivierung von Caspase-3 und CD69 Hochregulation zeigte. Da einige Verbindungen Funktionen wie Proteinsynthese oder vesikuläre Menschenhandel auswirken können, ist es nicht verwunderlich, Auswirkungen auf die Hochregulation der de Novo synthetisiert Marker (z. B. CD69) aber nicht auf posttranslationale beobachten Änderungen (z. B. die proteolytische Aktivierung von Caspase-3).
Als der Test präsentiert hier Maßnahmen Apoptose als eine Anzeige, ist es unerlässlich, dass die latente toxischen Wirkungen der Inhibitoren die Ergebnisse nicht verdecken. Zum Beispiel auf dem Bildschirm wir nicht verdünnen Staurosporine über 1 nM, obwohl es immer noch für die Zellen in dieser Konzentration giftig. Die repräsentativen Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Staurosporine wird ein promiscuous Kinase-Inhibitor und einem Induktor von Apoptose33. Ohne eine ausreichende Verdünnung der Verbindungen nicht toxische Konzentrationen getestet ist es möglich, potentielle Hits zu übersehen.
Die Screeningstrategie hier wäre schwierig anzuwenden, Menschen aufgrund von Komplikationen im Zusammenhang mit der Erlangung ausreichender Zahl von Thymozyten für Hochdurchsatz-Screening. Jedoch ist es möglich, menschlichen Thymus Proben von pediatric cardiac Biopsien34,35 oder von Föten36,37zu erhalten. Dennoch als TCR signalisiert, dass die Wege und die Aminosäure-Sequenzen von Signalproteinen zwischen Mäusen und Menschen, größtenteils erhalten geblieben sind der Thymocyte-Test bietet eine nützliche Vorauswahl-Strategie und Ergebnisse mit dieser Assay mit Maus Thymozyten können, dann, im primären menschlichen Lymphozyten überprüft werden.
Eine Einschränkung des herkömmlichen Zentrifugation-abhängige Protokolls bezieht sich auf die Perspektive des Zellverlustes, die mehrstufige Natur des Prozesses, zugeschrieben werden kann die Schritte wie Zelle Permeabilisierung und Zentrifugation beinhaltet. Jede Zentrifugation und Wiederfreisetzung Schritt führt unweigerlich zum Verlust von Zellen. Während solche Verluste nicht für Studien, die eine begrenzte Anzahl von Proben von entscheidender Bedeutung sein können, könnte es Probleme bei Anwendung im höheren Durchsatz Screening, insbesondere Fortschreiten der Assay-Format von 96 -, 384-1536 gut darstellen. Eine Möglichkeit zur Umgehung dieses Problems ist die Verwendung von Zelle durchlässig fluoreszierende Caspase Sensoren38 , die den Nachweis von Caspase-Aktivierung unter Vermeidung von Komplikationen der Zelle Permeabilisierung und mehrere Wäschen5ermöglichen. Alternativ ist es auch möglich, zur Minimierung der Zellverlust, beschäftigt eine Zentrifugation-unabhängige Methode Zellen durch laminare Strömung zu waschen. Mit einer automatisierten Platte Waschplatz in Verbindung mit einem Wand-weniger Teller werden Zellen von Laminar-Flow ohne den Einsatz einer Zentrifuge gewaschen. Die exponentielle Verdünnung der Reagenzien ermöglicht die gründliche und effiziente Spülung von Zellen in weniger als 3 min, die eine entsprechende Verdünnung auf zwei Runden der zentrifugalen waschen darstellt. Ohne äußere Belastungen durch Zentrifugation die Zellen sind rentabler und Zelle Verluste minimiert.
Wir haben auch die Möglichkeit der Verwendung der automatisierten Platte Waschstation nach Kultivierung der Thymozyten in 96-Well U-Boden Platten und auch die Kultivierung der Zellen direkt in Wand-weniger Platten kompatibel mit der automatisierten Platte Waschplatz. Die Kultivierung von Zellen in der Wand weniger Platten aktiviert die Beseitigung aller Schritte, Zentrifugation und Zellverlust durch den Wegfall der Notwendigkeit einer Probentransfer über Platten minimiert. In der Regel sind drei verschiedene Protokolle vergleichbar Stimulation Effizienz und Färbung. Die automatische Waschanlage bietet den Vorteil der Automatisierung, Geschwindigkeit und Effizienz, höherer Durchsatz Analyse erleichtert. Darüber hinaus mit erhöhte Automatisierung, die Waschschritte können schneller durchgeführt werden, und gibt es eine größere Kohärenz zwischen den Experimenten oder Experimentatoren. Die Waschanlage hat jedoch einige Nachteile: große Mengen an Wäsche Puffer sind erforderlich für Waschmaschine Grundierung (150 mL pro Puffer wechseln, von denen 50 mL zum Waschen dient); besondere Vorsicht ist beim Umgang mit der Plattenrandes notwendig, um Kreuzkontamination der Brunnen durch begrenzte Partitionierung zwischen den Brunnen der kleinvolumigen Platte zu vermeiden; verbleibende Puffer von 25 µL in den Vertiefungen nach Waschen erfordert die Verwendung von Reagenzien mit einer höheren vorbereitet als 1 X Konzentration. Um die Fragen der Restvolumen und begrenzte Kapazität der Platte, kann ein Accessoire, um die Inkubation Volumen von 70 µL bis 150 µL erweitern hinzugefügt werden, um die Annahme von herkömmlichen Protokollen erleichtern. Automatisierte Platte-Handling-Systeme derzeit verfügbar sind, haben sie einen bedeutenderen Fußabdruck im Vergleich zu der laminaren waschen System, das eine kleine Einheit von ~ 1 Kubikfuß (~0.028 m3). Darüber hinaus ist die Integration der Zentrifugation in automatisierte Handlingsysteme Platte anspruchsvoll, Begrenzung ihrer Verwendung in Zelle waschen. Derzeit gibt es keine andere Zentrifuge-unabhängige Zelle waschen Instrumente zur Verfügung, soweit wir wissen.
Hier vorgelegte Screeningstrategie ist in der Lage, kleine Moleküle und ihre angeblichen Ziel Kinasen, die TCR-Signalisierung und T-Zell-Aktivierung zu identifizieren. Die hier verwendete Bibliothek umfasst vor allem kleine Molekül Inhibitoren der Kinasen und war in der Lage, eine Reihe von potenziell interessante Treffer zu generieren. Das Protokoll kann auch ohne weiteres Inhibitor Bibliotheken anderer Enzym-Klassen oder auf andere Arten von kleinen Molekülen sowie Bibliotheken von anderen Verbindungen (z.B. verschiedene Makromoleküle) angewendet werden. Das Protokoll kann auch verwendet werden, andere Zelltypen wie peripheren T-Lymphozyten oder verewigt Zellen, einschließlich derjenigen mit dem Ausdruck transgenen TCR oder Reporter Tragesysteme auf den Bildschirm. Identifizierung und Charakterisierung neue Mediatoren der T-Zell-Signalisierung verbessern unser Wissen über den Signalweg und auch Hilfe bei der Entwicklung von gezielten Therapie bei Immunerkrankungen13,14,15, 16., fügt dieser Studie auf die Palette der verfügbaren Optionen für den Nachweis von Mediatoren der T-Zelle Signalisierung über Hochdurchsatz-Screening-Assays.

T-Zellen sind eine Linie von Lymphozyten, die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der adaptiven Immunität zu spielen. Sie drücken die TCR, ermöglicht ihnen, ihrer Liganden, komplexe, bestehend aus einem großen Histocompatibility komplexes Molekül (MHC) zu erkennen mit ein gebundenes Peptid, die befinden sich auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs). Die Auslösung der TCR Signalweg durch die TCR/MHC-Interaktion ist entscheidend für die T-Zell-Aktivierung und Entwicklung1.
In T-Zell-Entwicklung migrieren Bone-Marrow-derived hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) zu den Thymus, wo sie unterziehen, Differenzierung und gehen durch die Stadien der T-Zell-Linie Fortschreiten2. Doppel-positiv (DP) Thymozyten, mit dem Ausdruck der CD4 und CD8 Corezeptoren engagieren mit selbst-Peptid/MHC auf die APCs. Thymozyten mit mäßiger Affinität für ihre selbst-Peptid/MHC-Liganden Reifen Single-positiv (SP) CD4 oder CD8 Thymozyten, einen Prozess als positive Selektion bezeichnet werden. Im Gegensatz dazu unterziehen Thymozyten, die übermäßige TCR Stimulation durch die selbst-Peptid/MHCs erhalten Apoptose über negative Auslese3,4. Dieser Prozess der Stimulation induzierte, Caspase-abhängigen Apoptose kann durch die Stimulierung der Thymozyten, zum Beispiel mit Anti-CD3/28 Antikörper-beschichtete Perlen5nachgeahmt in Vitro . Reife T-Zellen, die das Auswahlverfahren bestehen werden durch nicht-selbst-Peptid/MHC-Liganden von APCs in der Peripherie aktiviert. Selbst-Peptid/MHCs sind immer noch relevant für die peripheren T-Zellen, im Rahmen des Tonikums Signalisierung für überleben und homöostatische Proliferation, Differenzierung der T-Helferzellen und die Verbesserung der T-Zell-Reaktionen auf nicht-selbst-Peptid/MHCs durch Coagonism6,7,8,9. Hohe Affinität TCR Bindung an das Peptid/MHC-Liganden aktiviert mehrere nachgeschaltete Signalwege, die viele Signalmoleküle bilden eine komplexe TCR Signalisierung Netzwerk10beinhalten. Die TCR-Signalwege sind seit mehreren Jahrzehnten untersucht worden, und doch zeigt die Entdeckung von neuen Mediatoren des Weges ungebrochen11,12. Die Modulation des TCR Signalwege hat klinischen Relevanz und kann mit T-Zell-Reaktionen für Immuntherapie Anwendungen oder die Hemmung der T-Zell-Reaktionen für die Kontrolle der Autoimmunität13potenzierende. Strategien für die Modulation des T-Zell-Reaktionen hängen hauptsächlich von der Störung der Kinase oder Phosphatase-Aktivität14,15,16ab.
Wir beschreiben eine Anwendung eines Flow-Zytometrie-based Assays für das Screening von kleinen chemischen Verbindungen für ihre Fähigkeit, TCR Signal- und T-Zell-Aktivierung-17zu modulieren. Der Test steht und fällt auf das Phänomen der Thymozyten Apoptose-Signalweg wenn starke TCR Signale ausgesetzt aktivieren. Der Test ist ausreichend empfindlich auf Veränderungen in der Stärke der Stimulation zu identifizieren; eine entsprechende Zunahme der Aktivierung verwendet als Maß für die Apoptotic Antwort5Caspase führte Inkubation Thymozyten transgenen TCR mit Peptid/MHC-Tetramers mit zunehmender Affinität zum Ausdruck zu bringen. Für den Bildschirm wir nutzten eine Bibliothek von Kinase-Inhibitoren und bewertet ihre Fähigkeit, die Thymocyte Reaktion auf starke Signale TCR modulieren.
Für den Hochdurchsatz-Screening von einem Sortiment von peripheren Aktivierung Phänotypen in verschiedenen T-Zell-Subsets wurden mehrere Flow-Zytometrie-based oder Fluoreszenz-Reporter-basierte Strategien beschrieben. Solche Strategien umfassen die Verwendung von genetischen fluoreszierende Reporter, der Zeitpunkt und das Ausmaß des T-Zell-Aktivierung-18zu bewerten, die Verwendung von Degranulation ein Auslesen der zytotoxischen T-Zell-Aktivität19,20, sowie die Analyse von der Phosphorylierung von verschiedenen Proteinen in Cellular signaling21beteiligt.
Der Screening-Test hier vorgestellten kann erfolgreich Verbindungen zu identifizieren, die kanonische Moleküle des TCR Signalisierung Weg sowie potenzielle, neue Verbindungen mit hemmenden Effekte auf TCR Signalisierung zu hemmen. Beispielsweise haben wir als neue Verbindungen beeinflussen T-Zell-Antworten-17Inhibitoren der GSK3β und Hsp90 identifiziert. Der Test ist in der Lage, die Inhibitoren zu unterscheiden, die Signaltransduktion durch Reduzierung der Apoptotic Antwort, die TCR-unabhängige Effekte der Inhibitoren auf zelluläre Toxizität stören. Neben der Induktion der Apoptose messen wir auch CD69 Hochregulation und TCR Downregulation als Marker der Aktivierung. Als TCR signalisiert, dass Netzwerke komplex sind kann die Verwendung von mehreren Anzeigen die Chancen Moleküle mit speziellen Wirkungen auf einen einzigen Weg zu entdecken erhöhen. Hier stellen wir auch die Verwendung eines Protokolls Zentrifugation-unabhängige als Hochdurchsatz-Alternative zu dem ursprünglichen Protokoll während der Färbung der Zellen zur Vorbereitung der durchflusszytometrischen Analyse. Der in diesem Dokument beschriebenen Test verwendet eine kleine Verbindung Bibliothek von Kinase-Inhibitoren, aber im Prinzip, es kann für höheren Durchsatz-Screening verwendet werden. Die Bibliothek der Wahl kann auch eine Vielzahl von Inhibitoren oder andere Moleküle enthalten.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

Der T-Zell-Rezeptor (TCR) signalisieren, dass Weg umfasst eine Vielzahl von Mediatoren, die übertragen Signale auf die Aktivierung des TCR. Unterschiedliche Strategien wurden vorgeschlagen und für die Identifizierung von neuen Mediatoren der TCR-Signalisierung, die Verbesserung des Verständnisses der T-Zell-Prozesse, einschließlich Aktivierung und Zebrafischembryonen Auswahl würde umgesetzt. Wir beschreiben eine Screening-Test, die es die Identifikation von Molekülen, die TCR Signalisierung basierend auf die Aktivierung ermöglicht der Thymozyten Entwicklung zu beeinflussen. Strong TCR Signale führen Entwicklung Thymozyten Apoptose Maschinen in einem Prozeß bekannt als negative Auswahl aktivieren. Durch die Anwendung der Kinase-Inhibitoren sind die mit den Zielen, die TCR-Signalisierung betreffen, den Prozess der negativen Auslese zu überschreiben. Die Methode detailliert in diesem Papier kann verwendet werden, um Inhibitoren der kanonischen Kinasen mit etablierten Rollen in die TCR-Signalwege und auch Inhibitoren der neuen Kinasen noch, sich in die TCR-Signalwege aufzustellen zu identifizieren. Die Screeningstrategie hier kann auf Bildschirmen der höheren Durchsatz für die Identifizierung von Roman druggable Ziele in TCR Signalisierung angewendet werden.

Der Ansatz der Screening-Test ist in Figur 1Azusammengefasst. Die Kinase-Inhibitoren wurden zuerst für ihre latente Wirkung auf Thymocyte Lebensfähigkeit untersucht. Dexamethason wurde als Positivkontrolle für die Apoptose als Proapoptotic Mittel verwendet. Die Anspritzung für live Zellpopulation wurde basierend auf den unbehandelten Negativkontrollen und Dexamethason behandelt Positivkontrollen (Abbildung 1 b) bestimmt. Die Inhibitoren wurden zunächst bei 10 µM auf Thymozyten getestet, und der Anteil der lebensfähigen Zellen nach Inkubation für 18 h gemessen wurde. Eine 20 %-Fenster für Zelltod wurde so gewählt, dass die Verbindungen, die induziert einen größeren als 20 % Verlust von Zellen im live Zelle Tor, im Vergleich zu DMSO-behandelten Proben, bei niedrigeren Konzentrationen (Abbildung 1 b) getestet wurden. Repräsentative FACS Grundstücke von ausgewählten Inhibitor behandelten Proben werden angezeigt, um die Lebensfähigkeit Assay zu veranschaulichen. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS-154447-36-6), eine PI3K Inhibitor22, nicht stark erhöhte Zelltod bei 10 µM und die Inhibitor wurde bei 10 µM für die nachfolgenden Tests verwendet. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS-1202884-94-3), eine duale Inhibitor des PI3Kα/mTOR23, induziert hohe Zelltod bei 10 µM und bei 1 µM, aber nicht bei 0,1 µM und 0,1 µM war entschlossen, die geeignete Konzentration für den Einsatz in nachgeschalteten Assays. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), ein Pan-Protein-Kinase C-Inhibitor mit einer etablierten Fähigkeit induzieren Apoptose24, induziert signifikante Zelltod bei allen Konzentrationen getestet, auch bei 0,1 µM. Es wurde in nachfolgenden Tests bei 0,1 µM als eine zusätzliche Positivkontrolle verwendet.
Die Endkonzentrationen der Inhibitoren wurden anhand der höchsten Konzentrationen, wobei sie Zelltod nicht um mehr als 20 % der DMSO-behandelten Proben verstärken ausgewählt. Mit die Endkonzentrationen der Inhibitoren bestimmt war eine Lager Platte von Inhibitoren vorbereitet, so dass die Inhibitoren 500 Mal die Konzentration bei den Zellen zugewiesen wurden. Abbildung 1 zeigt die Platte Layout der Lager Platte, mit die Endkonzentrationen der Inhibitoren. In der alternativen Protokoll der Inkubation der Zellen direkt in den kleinvolumigen Platten für die laminare Strömung waschen Assay erforderte die Verwendung von kleinen Mengen eine weitere Verdünnung der Inhibitoren. Um sicherzustellen, dass den DMSO-Inhalt der Kulturen nach Inhibitor Ergänzung nicht zu hoch für die Zellen wäre, die Inhibitoren wurden weiter verdünnt in komplette RPMI, durch ein Verdünnungsfaktor von 5, so dass sie bei 100 Mal die beabsichtigte Konzentration angewandt auf waren die Zellen.
Die Inhibitoren, nicht toxische Konzentrationen verdünnt dienten im Test TCR-Stimulation-induzierte Apoptose in Thymozyten5,17. Die Stimulation erfolgte mit Anti-CD3/CD28 Perlen für 18 h, und die Zellen wurden anschließend zur Aktivierung der Caspase-3 in der CD4 befleckt+ und CD8+ DP Thymocyte Bevölkerung (Abbildung 2). Zunahme der Caspase-3-Aktivierung und CD69 Ausdruck, und auch ein TCR Herabregulation wurden in die Anti-CD3/CD28-stimuliert und DMSO Mock-imprägnierte Anti-CD3/28-stimulierten Proben, im Vergleich zu den nonstimulated Proben beobachtet. Dexamethason-behandelten Proben zeigten eine Zunahme Caspase-3-Aktivierung unabhängig von CD69 Hochregulation, die der Apoptose-induzierende Wirkung unabhängig von TCR Stimulation erwartet wird.
Abbildung 3A fasst die Ergebnisse der screening-Test für ausgewählte Inhibitoren Bibliothek. Aktivierung von Caspase-3 und CD69 kann verwendet werden, um potenzielle Inhibitoren des Interesses durch die Unterdrückung der Meinungsfreiheit zu identifizieren. Wie erwartet, zeigte sich Inhibitoren der kanonischen Mediatoren der TCR-Signal als positive Treffer auf den Bildschirmen. Diese Inhibitoren, die unterschiedliche Grade der inhibitorischen Potenz ausgestellt, inklusive Breitspektrum-Inhibitoren, die auf mehrere Kinasen und auch spezifische Inhibitoren. Einige Inhibitoren konnten Caspase-3-Aktivierung und CD69 Hochregulation (Abb. 3 b, obere Reihe, links Platten) zu unterdrücken. Ein solcher Inhibitor ist Bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), die hemmt alle Protein Kinase C-Isoformen, neben Proteinkinase A und PDK125,26,27. Ein weiterer Hemmstoff in dieser Kategorie ist CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS-494772-86-0), eine vorgeschlagene Inhibitor des IKK228.
Es gab Verbindungen, die gehemmt CD69 Hochregulation aber Tat keinen Abbruch, Aktivierung der Caspase-3 (Abb. 3 b, obere Reihe, richtigen Platten). CAY10626, ein Inhibitor der PI3Kα und mTOR23und U-0126 (2,3-Bis [amino [(2-aminophenyl) Thio] Methylenblau]-Butanedinitrile; CAS 109511-58-2), ein MEK-Inhibitor29, waren einige der identifizierten-Inhibitoren. Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Inhibitoren gezielt verschiedene Kinasen aus bestimmten Branchen der TCR-Signalweg, vor allem diejenigen, die gezielt Spätstadium Kinasen, die selektive Beeinträchtigung der T-Zell-Aktivierung-Erscheinungen führen können.
Es gab auch Inhibitoren, die nicht CD69 Hochregulation und Aktivierung der Caspase-3 (Abb. 3 b, untere Reihe, links Platten) unterdrückt. Paclitaxel (β-(Benzoylamino) - αR - hydroxy-Benzenepropanoic Acid, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl Ester; CAS-33069-62-4), ein Disruptor Mikrotubuli Dynamik30und Necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS-337349-54-9), ein Inhibitor der RIP1 Kinase31, sind zwei Inhibitoren identifiziert, um in dieser Kategorie werden. In solchen Fällen, wo CD69 Hochregulation und Caspase-3-Aktivierung nicht beeinträchtigt wurden, kann dies aufgrund der Inhibitoren keinen entsprechenden Kinase Signalweg TCR ausgerichtet.
Wie bereits erwähnt, diente Staurosporine auf den Bildschirmen in einer Konzentration, die noch in der Thymozyten Apoptose induziert. Wie erwartet, die Staurosporine-behandelten Probe zeigte ein hohes Maß der Caspase-3-Aktivierung (Abb. 3 b, untere Reihe, rechts). Das niedrige Niveau der CD69 Ausdruck können die Staurosporine-vermittelte Hemmung der PKC, zugeschrieben werden, wie Bisindolylmaleimide II, eine andere Pfanne-PKC-Hemmer, auch den Ausdruck CD69 unterdrückt. Alternativ induzierte Staurosporine Apoptose in den Zellen bevor sie Upregulate konnten den Ausdruck CD69.
Um den Durchsatz und die Automatisierung des Protokolls zu erhöhen, wurden parallel Protokolle, die die Verwendung eines automatisierten Platte waschen über Laminar-Flow-System beteiligt vorbereitet. Zwei getrennte Protokolle verwenden diese automatisierten Platte Waschvorrichtung wurden erprobt und im Vergleich zur herkömmlichen Methode der Kultivierung von Zellen in 96-Well-Platten und Färbung der Zellen in einem Zentrifugation-abhängige-Protokoll. Eine Methode beteiligt Kultivierung der Zellen in 96-Well-Platten, nach Standardverfahren, und dann, die Zellen auf Platten kompatibel mit der automatisierten Platte Scheibe übertragen, für die Färbung tritt (Abbildung 4, DA waschen Proben). Die andere Methode beteiligt Kultivierung der Zellen direkt in die Platte-Waschmaschine-kompatiblen Platten und Weiterbildung mit der Färbung Protokoll auf der gleichen Platte (Abbildung 4, DA Kultur Proben). Die Zentrifugation-unabhängige Protokolle geben nicht viele wahrnehmbare Unterschiede in aktive Caspase-3, CD69 oder TCRβ Färbung in den verschiedenen Proben getestet, im Vergleich zu den herkömmlichen Zentrifugation-abhängige Protokoll (Abbildung 4). Unterschiede in der Intensität der Färbung können mit Antikörpern bei leicht unterschiedlichen Konzentrationen während der Färbung Schritte zugeschrieben werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Abbildung 1 : Thymocyte Rentabilität nach der Behandlung mit Inhibitoren. (A) experimentelle Überblick über die wichtigsten Schritte in der Screening-Test. Es gibt drei vorgeschlagene Methoden für die Stimulation und Färbung von der Thymozyten in die Aktivierung-Assay, nämlich (1) die Kultivierung von Thymozyten in standard 96-Well-Platten, gefolgt von Färbung mit einem konventionellen Zentrifugation-basierten Protokoll verwendet (2) Kultivierung von Thymozyten in standard 96-Well-Platten, gefolgt von Färbung mit einer Zentrifugation-unabhängige waschen-Protokoll, und (3) die Kultivierung von Thymozyten in kleinvolumigen Platten, gefolgt von Färbung in den gleichen Platten mit einer Zentrifugation-unabhängige waschen Protokoll. (B) Gating Strategien in die Lebensfähigkeit Assays verwendet. Live Cell Tor stammt aus der forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) geplottet wird, wie zuvor beschrieben17. Inhibitoren, die als galten auch giftig bei der getesteten Konzentration wurden weitere Lebensfähigkeit Assays in 10-divisibel niedrigeren Konzentrationen. Repräsentative Inhibitor behandelten Proben werden angezeigt. Beachten Sie die gemeinsame Kontrolle (DMSO behandelt [DMSO]) für 1 µM und 0,1 µM Proben verwendet. (C) Platte Layout von verdünnten Inhibitoren. Eine schematische Darstellung der Platten von Inhibitoren in DMSO zu einer Konzentration von 500 x die gewünschte Endkonzentration verdünnt. Jeder stellt auch eine einzigartige Inhibitor; die grauen Brunnen sind leer. Die Konzentrationen gezeigt sind die Endkonzentration wenn die Zellkulturen, nämlich 10 µM (dunkelrot), 1 µM (Fuchsia) und 0,1 µM (blau) hinzugefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Abbildung 2 : Platte Layout des Thymocyte Aktivierung Assays. (Oben) Spalten 1 und 12 sind für Steuerelemente, vorbehalten, während die Spalten 2 bis 11-Inhibitor behandelten Proben (Beige) sind. Die negative-Kontrolle (nonstimulated [NS]; grau) belegt Brunnen A1 auf D1 und die Positivkontrolle für Zelltod (Dexamethason behandelt [DEX]; lila) nimmt Brunnen E1 auf H1. Spalten 2 bis 12 enthalten Thymozyten mit Anti-CD3/CD28 Perlen stimuliert. Die Positivkontrolle für Thymocyte Aktivierung (stimulierten Proben [α-CD3/CD28]; grün) nimmt Brunnen A12 D12 und die Fahrzeugkontrolle (angeregt und DMSO behandelt [α-CD3/CD28 + DMSO]; rot) nimmt Brunnen E12, H12. (Unten) Flow Cytometry aktive Caspase-3 (ActCasp3), CD69, Grundstücke und TCRβ Färbung der Thymozyten gated innerhalb der Doppel-positiv (DP) Tor. Repräsentative Darstellungen der verschiedenen Steuerelemente werden angezeigt. NS = nonstimulated; DEX = Dexamethason-behandelten Proben; Α-CD3/CD28 + DMSO = Proben mit CD3/CD28-beschichtete Perlen stimuliert und behandelt mit DMSO; Α-CD3/CD28 = Proben mit CD3/CD28-beschichtete Perlen stimuliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Abbildung 3 : Der Inhibitor Bibliothek auf Thymocyte Aktivierung screening. (A) Daten des Assays Aktivierung zusammengefasst. Dies sind die Ergebnisse einer repräsentativen Experiment zeigt die normalisierte Werte der Zellen mit aktivierter Caspase-3 und CD69 Ausdruck für ausgewählte Inhibitoren. Normierung erfolgte durch den Vergleich des Anteil der Zellen in der aktiven-Caspase-3-positiven oder CD69-Positive Tor auf den Wert des Steuerelements DMSO behandelt, die auf einen relativen Wert 0 in das Diagramm gesetzt ist. (B) ausgewählte FACS Grundstücke. Flow Cytometry Grundstücke von Inhibitoren, die Aktivierung von Caspase-3 und CD69 Hochregulation (oben links), unterdrückt nur CD69 Hochregulation (oben rechts) unterdrückt oder hatte keinen Einfluss auf die Aktivierung der Caspase-3 und CD69 Hochregulation (unten links). Grundstücke der Staurosporine behandelten Probe werden angezeigt, um die Auswirkungen der Verwendung eines Inhibitors bei toxischen Konzentrationen (unten rechts) zu illustrieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Abbildung 4 : Vergleich der verschiedenen Test-Protokolle. Flow Cytometry aktive Caspase-3 (ActCasp3), CD69, Grundstücke und TCRβ Färbung der DP Thymozyten nach drei verschiedene Protokolle assay. Vier verschiedene Bedingungen getestet werden, nämlich die negativ-Kontrolle (nonstimulated [NS]), die Positivkontrolle für Zelltod (Dexamethason behandelt [DEX]), die Fahrzeugkontrolle (angeregt und DMSO behandelt [α-CD3/CD28 + DMSO]), und ein Inhibitor behandelt Probe (angeregt und PIK-75-behandelt [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Konventionelle = die Kultivierung von Thymozyten in standard 96-Well-Platten und Färbung mit einer konventionellen Zentrifugation-basiertes Protokoll; DA waschen = die Kultivierung von Thymozyten in standard 96-Well-Platten und Färbung mit einem Laminar-Flow waschen Protokoll; DA-Kultur = die Kultivierung von Thymozyten in kleinvolumigen Platten und Färbung in den gleichen Platten mit einem Laminar-Flow-Protokoll waschen.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Dieses Papier verwendet ein Flow-Zytometrie-based Assays auf Bildschirm Bibliotheken chemische Inhibitoren für die Identifizierung von Inhibitoren und ihre Ziele, die T-Zell-Rezeptor Signalisierung beeinflussen. Die hier beschriebenen Methoden können auch für Hochdurchsatz-Screenings erweitert werden.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Unser High-Throughput-Assay ergänzt die verfügbaren Methoden zur Identifizierung kleiner Moleküle und ihrer Ziele, die die TCR-Signalisierung und T-Zell-Aktivierung modulieren. Unser Assay hat einen selbstkorrigierenden Aspekt durch das Herausfiltern toxischer Verbindungen und die Identifizierung von Inhibitoren der TCR-Signalisierung und Stimulations-induzierten Apoptose. Die Identifizierung von Mediatoren der TCR-Signalisierung kann bei der Entwicklung der Therapie bei Immunerkrankungen helfen.Wir lieferten einen starken Stimulus für Thymosyten, die von TCR-polyklonalen Mäusen abgeleitet wurden. Es ist möglich, TCR-transgene Mäuse zu verwenden und sie mit anderen Peptid-Ligand-Tetrameren für eine schwächere Stimulation zu stimulieren. Dieser Test beinhaltet die Verwendung von kleinen Volumen und von kleinvolumigen Platten für die Kultivierung der Zellen.Dies erfordert einen sorgfältigen Umgang mit den Platten und ihrem Inhalt. Es gibt viele Verbindungen in der Bibliothek von Kinase-Inhibitoren, die als gefährlich gelten. Behandeln Sie aus Sicherheitsgründen alle Verbindungen als gleich gefährlich und befolgen Sie die vom Lieferanten empfohlenen Sicherheitsvorkehrungen.Um die Behandlung von Thymosyten mit Kinase-Inhibitoren zu beginnen, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 40 Mikroliter pro Brunnen Thymosyten zu einer Kleinbandplatte hinzuzufügen. Legen Sie die Platte auf Eis. Dann Pipette einen Teil der Kinase-Inhibitoren, DMSO, und Dexamethason, und vier Teile der gesamten RPMI-Medien in eine 96-Well-Platte.Legen Sie acht Brunnen der Kleinvolumenplatte für unbehandelte Kontrollen fest, vier Brunnen für Dexamethason-behandelte Positivkontrollen für den Zelltod, indem Sie das verdünnte Dexamethason bei der Fünf-Mikromolar-Konzentration hinzufügen, und vier Brunnen zu fahrzeugbehandelten Kontrollen, indem Sie 0,5 Mikroliter des verdünnten DMSO hinzufügen. Als nächstes, aus den entsprechenden Brunnen der Inhibitorplatte, fügen Sie 0,5 Mikroliter jedes verdünnten Inhibitors auf die 96-Well-Platte. Um mit der Thymosytenstimulation zu beginnen, stellen Sie zunächst sicher, dass Anti-CD-3- und CD-28-Perlen gleichmäßig wieder aufgehängt werden.Als nächstes waschen Sie einen Milliliter der Perlen mit zwei Millilitern des PBS-Puffers. Setzen Sie die Röhre auf einen magnetischen Ständer, um Perlen von Überstand zu trennen und die Lösung zu aspirieren. Dann die Perlen in einem Milliliter des gesamten RPMI-Mediums wieder aussetzen.Fügen Sie 10 Mikroliter pro Bohrkörper der Perlensuspension zu jeder inhibitorbehandelten Probe, den vier DMSO-behandelten Proben und vier der acht unbehandelten Proben hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter des gesamten RPMI zu den verbleibenden vier unbehandelten Brunnen hinzu. Verwenden Sie einen Mikroplatten-Orbital-Shaker, um die Platte sanft zu erregen.Als nächstes inkubieren Sie die Thymosyten in 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Umgebung für 17 bis 20 Stunden, oder über Nacht. Prime eine automatisierte laminare Durchflussplattenscheibe, zuerst mit 150 Milliliter Ethanol Tween Lösung, dann mit entionisiertem Wasser ergänzt mit 1%Tween 20, und schließlich mit FACS Waschpuffer. Am Ende der Inkubation mit dem Plattenwaschsystem die Platte mit FACS Waschpuffer mit einem neunfachen Waschzyklus waschen.Jede Wäsche fügt 55 Mikroliter Waschpuffer durch laminaren Fluss hinzu und entfernt sie, was zu einer exponentiellen Verdünnung der Reagenzien in den Brunnen führt. Um Oberflächenantigene zu färben, verdünnen Sie zunächst ein Einheitsvolumen von Anti-CD-3, Anti-CD-4, Anti-CD-8 und Anti-CD-69-Antikörpern in 100-Einheiten-Volumen des FACS-Waschpuffers. Dann die Zellen in 25 Mikroliter des Färbeantikörpergemisches wieder aufhängen.Verwenden Sie einen Mikroplatten-Orbital-Shaker, um die Platte sanft zu erregen, und lassen Sie die Platte dann 30 Minuten lang auf Eis. Um die Zellen zu fixieren, waschen Sie zuerst die Platte mit 55 Mikroliter FACS Waschpuffer mit neunfachen Waschzyklus wie zuvor beschrieben. Dann fügen Sie 50 Mikroliter des Fixierungs-Impermeablisationspuffers zu jedem Brunnen hinzu.Gut mischen und die Platte 30 Minuten auf Eis bebrüten. Nach der Inkubation einen Ein-X-Perm und Waschpuffer vorbereiten, indem Sie 25 Milliliter des mitgelieferten 10-Fach-Lagerbestands in 225 Milliliter Reinstwasser verdünnen. Die Plattenscheibe mit einem 1-X-Puffer grundieren und mit 55 Mikrolitern des Ein-X-Puffers mit einem neunfachen Waschzyklus wie zuvor beschrieben waschen.Zunächst einen Milliliter des Anti-Caspase-3-Antikörpers mit zwei Millilitern des 1-X-Perm und Waschpuffers mischen. Fügen Sie 25 Mikroliter pro Brunnen der Mischung zu den festen Zellen hinzu. Verwenden Sie einen Mikroplatten-Orbital-Shaker, um die Platte sanft zu erregen.Lassen Sie die Platte für eine Stunde auf Eis. Am Ende der Inkubation wiederholen Sie den Waschschritt neunmal mit dem Ein-X-Perm und dem Waschpuffer. Dann 25 Mikroliter des FACS Waschpuffers in alle Brunnen der Platte geben.Pipette ein paar Mal nach oben und unten, um die Lösung zu mischen. Schließlich übertragen Sie die gemischten Proben in Mikrotiter-Röhren. Die Rohre mit dem FACS-Waschpuffer auf ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern aufladen und mit der Durchflusszytometrieanalyse fortfahren.Nach Anti-CD-3, CD-28 Stimulation wurde eine Erhöhung der Caspase-3-Aktivierung und der TCR-Downregulation sowohl in den unbehandelten als auch in den DMSO-Mock-behandelten Proben beobachtet. Auch wurde eine Zunahme der CD-69-Expression in beiden stimulierten Proben beobachtet. Die mit Dexamethason behandelten Proben zeigten eine Erhöhung der Caspase-3-Aktivierung unabhängig von der CD-69-Upregulation, wie für die unabhängige apoptoseinduzierende Wirkung und die TCR-Stimulation erwartet.Die selektive Beeinträchtigung von T-Zell-Aktivierungsphänomenen wurde durch verschiedene Inhibitoren gezeigt, die entweder sowohl die Caspase-3-Aktivierung als auch die CD-69-Up-Regulation unterdrückten oder die CD-69-Up-Regulierung behinderten, aber die Caspase-3-Aktivierung nicht beeinträchtigten. Es gab auch Inhibitoren, die nicht auf eine relevante Kinase des TCR-Signalwegs abzielten und daher sowohl die CD-69-Upregulation als auch die Caspase-3-Aktivierung nicht unterdrückten. Das Bildschirmergebnis von Staurosporin, der Apoptose-positiv-Kontrolle, zeigte erwartungsgemäß einen hohen Grad an Caspase-3-Aktivierung.Das Ergebnis zeigte jedoch auch niedrige Konzentrationen der CD-69-Expression, die entweder auf seine vermittelte Hemmung der Proteinkinase C oder auf ihre induzierte Apoptose vor der CD-69-Expression zurückgeführt werden können. Der Vergleich verschiedener Assayprotokolle zeigte keine Unterschiede bei der aktiven Caspase-3-, CD-69- und TCR-Färbung der Negativkontrolle, der positiven Kontrolle des Zelltodes, der Fahrzeugkontrolle und einer inhibitorbehandelten Probe. Die Vorinkubationsstufen sollen die Verwendung der Kleinbandplatte zur Zellkultivierung erleichtern.Das standardzentrifugenabhängige Protokoll ist auch im Manuskript vorgesehen. Potenziell interessante Inhibitoren oder Targets können mit verschiedenen Zelltypen und auch bei verschiedenen Arten, wie z. B. pagopheralen Mauslymphozyten oder menschlichen Primärzellen, validiert werden. Die anschließende Charakterisierung der identifizierten Moleküle und der Targets kann dazu beitragen, das Verständnis der T-Zellbiologie zu verbessern und mögliche Ziele für die Immunmodulation zu erweitern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...