Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים סינגפור משרד הבריאות של המועצה הלאומית למחקר רפואי, NMRC CBRG15may017, את סינגפור משרד של החינוך, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.).

<ol>
	<li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development.">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li><li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers.">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).</li><li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&amp;#34;self&amp;#34;+in+T-cell+activation.">A role for &amp;#34;self&amp;#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li><li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation.">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li><li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC.">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling.">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development.">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling.">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development.">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li><li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+human+autoimmunity:+current+practice+and+future+prospects.">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li><li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity.">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li><li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate.">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li><li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li><li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation.">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).</li><li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules.">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants.">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li><li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis.">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li><li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry.">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li><li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase,+2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+(LY294002).">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors.">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li><li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine,+K-252+and+UCN-01:+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases.">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li><li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2,3-Bisarylmaleimides.">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li><li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1.">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li><li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A.">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li><li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel compounds. , (2003).</li><li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase.">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li><li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway.">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors.">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).</li><li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts.">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li><li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+neonatal+thymus:+evidence+for+a+transient+thymic+involution.">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li><li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus.">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li><li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and/or+IFN-gamma-producing+CD4++and+CD8++T+cells.">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li><li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+ADMET.">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li></ol>

הסופר Chyan יינג Ke הוא מועסק ע י ביוסיסטמס Curiox, אשר מייצר את דה-תא כביסה ומייבש צלחות DA-תא להשתמש במאמר זה.

האסטרטגיה ההקרנה המוצע כאן מעריך את היכולת של מעכבי מולקולה קטנה כדי לדכא את ההשפעות אפופטוטיים להיפגע ב thymocytes לאחר גירוי, בנוסף סמנים קונבנציונליים יותר של קולטנים upregulation הפעלה-CD69 T-cell TCR downregulation . סמנים נוספים ניתן גם לכלול כדי לאפשר הניתוח של קבוצות משנה שונים thymocyte32. האספקט המעניין וזמינותו הנוכחי טמון בעובדה כי מעכבי הפוגעים TCR איתות גם לצנן את אינדוקציה של אפופטוזיס, נוסף המדגיש את ההבחנה TCR שאינו תלוי תופעות שמעכבי יכול להיות על גרימת מוות של תאים. יתר על כן, וזמינותו זרימה-cytometry מבוססי מאפשר השימוש של מספר הקריאות הבאות כסמני הפעלה נפרדות, אשר יכולה לדווח את השפעות מעכבי על ענפים בודדים שונים של TCR איתות. במקרה המוצג כאן, היו מעכבי הראה על עיכוב דיפרנציאלית של הפעלת קספאז-3 וקולטנים upregulation CD69. כי תרכובות מסוימות עשוי להשפיע על פונקציות משק כגון סינתזה של חלבון או סחר vesicular, זה לא מפתיע להתבונן אפקטים על קולטנים של upregulation דה נובו מסונתז סמנים (למשל, CD69) אך לא על posttranslational שינויים (למשל, הפעלת הפרוטאוליטי של קספאז-3).
כמו וזמינותו שהוצגו כאן מודד אפופטוזיס כמו העתק, זה הכרחי כי ההשפעות הרעילות החבויים של מעכבי לא יסתירו את התוצאות. לדוגמה, במסך, אנחנו? האם לא לדלל staurosporine מעבר 1 ננומטר, למרות שזה עדיין רעילה לתאים-הריכוז הזה. התוצאות נציג הן מסכים עם staurosporine להיות מעכב קינאז מופקרת של משרן של אפופטוזיס33. בלי לדילול מספיקות של תרכובות נבדק ריכוזי רעילים, זה אפשרי להתעלם להיטים פוטנציאלים.
האסטרטגיה ההקרנה מפורט כאן יהיה קשה להחיל על בני אדם בשל סיבוכים הקשורים עם קבלת מספר מספיק של thymocytes להקרנה תפוקה גבוהה. עם זאת, ניתן לקבל התימוס האנושי דגימות הביופסיה של הלב ילדים34,35 או36,העוברים37. בכל זאת, כמו TCR איתות משעולים, רצפי חומצות אמינו איתות חלבונים בעיקר נשמרים בין בעכברים ובבני אדם, וזמינותו thymocyte מספק סינון ראשוני שימושי אסטרטגיה, והשיג תוצאות עם זה וזמינותו באמצעות העכבר thymocytes, לאחר מכן, ניתנת לאימות כמקורית העיקרי לימפוציטים אנושיים.
מגבלה אחת של פרוטוקול צנטריפוגה תלוית קונבנציונאלי מתייחס האפשרות של איבוד תאים, אשר ניתן לייחס אופי רב-שלבי התהליך, הכוללת צעדים כגון תא permeabilization, צנטריפוגה. כל צנטריפוגה וצעד resuspension באופן בלתי נמנע גורמת לאובדן של תאים. בעוד אובדן כזה לא יכול להיות קריטי עבור מחקרים שכללו מספר מצומצם של דוגמאות, זה עלול להעמיד את בעיות בעת החלת סינון תפוקה גבוהה יותר, במיוחד כמו assay עיצוב מתקדם 96-384 כדי 1536-ובכן. דרך אחת לעקוף בעיה זו היא באמצעות חיישנים תא חדיר קספאז פלורסנט38 המאפשרים הגילוי של קספאז ההפעלה תוך הימנעות את הסיבוכים של תא permeabilization, מנקי מספר5. לחלופין, העסקת שיטה שאינה תלויה צנטריפוגה לרחוץ את התאים על ידי זרימה שכבתית אפשרי גם להפחתה עד כדי איבוד תאים. עם צלחת אוטומטיות תחנת בשיתוף עם צלחת קיר-פחות רחיצת, תאים נשטפים על ידי זרימה שכבתית ללא שימוש צנטריפוגה. דילול מעריכית של ריאגנטים מאפשר יסודי ויעיל שטיפה של תאים בפחות מ 3 דקות, אשר מייצג של דילול שוות ערך ל שני סיבובים של כביסה צנטריפוגלי. ללא לחצים חיצוניים בשל צנטריפוגה, התאים הם מעשית יותר, תא הפסדים הן מזעריות.
חרשנו גם את האפשרות של שימוש לצלחת אוטומטיות תחנת רחיצת לאחר culturing את thymocytes ב 96-ובכן U-התחתון צלחות, בנוסף, את culturing של תאים ישירות בצלחות קיר-פחות תואם הצלחת אוטומטיות תחנת רחיצת. Culturing של תאים בהלוחות קיר-פחות זמינה חיסול של כל השלבים צנטריפוגה, ממוזער איבוד תאים על-ידי ביטול הצורך להעברת הדגימה על פני הלוחות. באופן כללי, שלושה פרוטוקולים שונים דומים גירוי היעילות והן מכתים. התחנה כביסה אוטומטיים מספקת את היתרון של אוטומציה, מהירות ויעילות, מה שהופך אותו קל יותר לניתוח תפוקה גבוהה יותר. יתר על כן, עם אוטומציה מוגברת, השלבים כביסה יכול להתבצע מהר יותר, יש יותר עקביות בין ניסויים או ניסויים. עם זאת, תחנת כביסה יש חסרונות מסוימים: כמויות גדולות של כביסה מאגרי נדרשים עבור מכונת כביסה הטרמה (150 מ"ל לכל שינוי מאגר, מהן 50 מ ל משמש לרחצה); טיפול נוסף נדרש בעת הטיפול לצלחת כדי למנוע כל זיהום צולב מן הבארות עקב החלוקה למחיצות מוגבלת בין הבארות של הצלחת בנפח מצומצם; מאגר שיורית של µL 25 ב הבארות לאחר כביסה מחייבת שימוש ריאגנטים מוכן במלון גבוהה יותר מאשר 1 x ריכוז. כדי לטפל הבעיות של נפח שיורית וקיבולת אחסון מוגבל של הצלחת, אביזר להרחיב הדגירה לאמצעי האחסון של 70 µL 150 µL ניתן להוסיף, הקלה על האימוץ של פרוטוקולים קונבנציונלי. בעוד מערכות אוטומטיות צלחת זמינים כיום, יש להם טביעת משמעותית לעומת המערכת למינריות לשטוף, אשר הוא יחידה קטנה של ~ 1 רגל מעוקב (~0.028 ז3). יתר על כן, השילוב של צנטריפוגה בצלחת אוטומטיות, מערכות טיפול הוא מאתגר, להגביל את השימוש בהם בכביסה לתא. כיום יש פלאפון צנטריפוגה-עצמאיים אחרים שטיפת הכלים העומדים לרשותנו, ככל הידוע לנו.
האסטרטגיה ההקרנה המובאת כאן היא היכולת לזהות מולקולות קטנות, ואת שלהם kinases המטרה כביכול, המשפיעות TCR איתות והפעלה T-cell. ספריית המשמש כאן כוללת בעיקר מעכבי מולקולה קטנה של kinases והיה מסוגל לייצר מספר שעשוי להיות מעניין להיטים. הפרוטוקול ניתן בקלות להחיל גם לספריות המדכא של מחלקות אחרות אנזים או סוגים אחרים של מולקולות קטנות, כמו גם ספריות של תרכובות אחרות (למשל, מקרומולקולות שונים). הפרוטוקול יכול לשמש גם למסך סוגי תאים אחרים, כגון היקפי לימפוציטים מסוג T או תאים מונצחים, כולל אלה ביטוי TCRs הטרנסגניים או נושא מערכות כתב. זיהוי ואפיון מתווכים חדשים של T-cell איתות ניתן לשפר את הידע שלנו על מסלול איתות, גם לסייע בפיתוח של טיפול ממוקד מחלות מערכת החיסון13,14,15, 16. בסך הכל, מחקר זה מוסיף מגוון האפשרויות הזמינות איתור מגשרים של T-cell איתות באמצעות תפוקה גבוהה מבחני המיון.

תאי T הם שושלת של לימפוציטים לשחק תפקיד מרכזי קיום החסינות מסתגלת. הם מבטאים TCR, המאפשרת להם לזהות ליגנדים שלהם, מתחמי המורכב של מולקולה מורכבת histocompatibility הגדולות (MHC) עם פפטיד מאוגד, אשר נמצאים על פני השטח של אנטיגן תאים (נגמ שים). מפעילה של TCR איתות באמצעות האינטראקציה TCR/MHC חיוני להפעלת תא T ופיתוח1.
בפיתוח T-cell, עצם מח-נגזר hematopoietic תאי גזע (HSCs) העברת התימוס, שבו הם עוברים התמיינות, לעבור את השלבים של T-cell שושלת היוחסין התקדמות2. Thymocytes (DP) כפול-חיובית, לבטא coreceptors CD4 והן CD8, לעסוק עם עצמי-פפטיד/MHC על נגמ שים. Thymocytes עם משיכה מתון על ליגנדים העצמי-פפטיד/MHC שלהם בוגרת כדי להפוך thymocytes (SP) CD4 או CD8 יחיד-חיובית, תהליך הנקרא כבחירה חיובי. לעומת זאת, thymocytes מקבל גירוי מוגזם TCR דרך העצמי-פפטיד/MHCs עוברים אפופטוזיס באמצעות בחירה שלילי3,4. תהליך זה של אפופטוזיס הנוצרות על-ידי גירוי, תלויי-קספאז ניתן חיקה במבחנה על ידי גירוי thymocytes, לדוגמה עם חרוזים מצופים נוגדן anti-CD3/285. בוגרת תאי T עוברים תהליך הבחירה מופעלים על ידי ליגנדים הלא-העצמי-פפטיד/MHC של נגמ שים בפריפריה. העצמי-פפטיד/MHCs עדיין רלוונטיות עבור היקפיים בתאי T, בהקשר של טוניק איתות הישרדות, התפשטות homeostatic, את הבידול של תאי T helper של השיפור של T-cell התגובות הלא-העצמי-פפטיד/MHCs דרך coagonism6,7,8,9. גבוהה-זיקה TCR קשירה ליגנד פפטיד/MHC מפעילה מספר מסלולים איתות במורד הזרם, בהם מעורבים הרבה מולקולות איתות ויוצרים של TCR מורכבים איתות רשת10. המסלולים איתות TCR נחקרו במשך כמה עשורים, אך הגילוי של מגשרים חדשים של מסלול מלמד אין האטה11,12. יכול לכלול שמגדיל יכולתו T-cell תגובות עבור יישומים immunotherapeutic או עיכוב של T-cell תגובות עבור הפקד של מחלת חיסון עצמי13, ויש הרלוונטיות הקלינית האפנון של TCR איתות המסלולים. אסטרטגיות האפנון של T-cell תגובות תלויים בעיקר על שיבוש קינאז או פוספטאז פעילות14,15,16.
אנו מתארים יישום של assay המבוססות על זרימת-cytometry להקרנה של תרכובות כימיות קטנות יכולתם לווסת TCR איתות ו T-cell הפעלה17. וזמינותו נשענות על התופעה של thymocytes הפעלת מסלול אפופטוזיס כאשר הם נחשפים אותות TCR חזקה. וזמינותו הוא רגיש מספיק כדי לזהות שינויים גירוי כוח; המקננת thymocytes לבטא הטרנסגניים TCR עם פפטיד/MHC tetramers עם הגדלת זיקה הביא וגידול מקביל קספאז ההפעלה המשמשות כמדד של התגובה מוות5. עבור המסך, אנו בשימוש ספריה של מעכבי קינאז, העריך יכולתם לווסת את התגובה thymocyte לאותות TCR חזקה.
מספר אסטרטגיות המבוססות על זרימת-cytometry או זריחה-כתב מבוססי תוארו להקרנה תפוקה גבוהה של מגוון פנוטיפים ההפעלה היקפיים של קבוצות משנה T-cell שונים. אסטרטגיות כאלה כוללות שימוש כתבים פלורסנט גנטית כדי להעריך את התזמון ואת סדר הגודל של T-cell הפעלה18, השימוש degranulation של readout ציטוטוקסיות T-cell פעילות19,20, וכן הניתוח של זרחון של חלבונים שונים המעורבים הסלולר איתות21.
וזמינותו ההקרנה המובאת כאן היא בהצלחה לזהות תרכובות המעכבות מולקולות הקנוני של TCR איתות לשביל, וכן תרכובות פוטנציאל, הרומן עם מעכבות ההשפעות על TCR איתות. לדוגמה, אנחנו מזוהות מעכבי GSK3β ו Hsp90 תרכובות חדשות המשפיעים על T-cell תגובות17. וזמינותו הוא מסוגל להבחין את מעכבי להפריע אותות, עקב ירידה בתגובה אפופטוטיים להיפגע, מהשפעות TCR שאינו תלוי מעכבי על רעילות הסלולר. בנוסף אינדוקציה של אפופטוזיס, אנחנו גם למדוד קולטנים upregulation CD69 ו- TCR downregulation כסמנים של הפעלה. כמו TCR איתות רשתות מורכבות, השימוש מרובות הקריאות הבאות יכול להגדיל את הסיכוי של גילוי מולקולות עם השפעות ספציפיות על מסלול יחיד. כאן, אנחנו מוסיפים גם השימוש של פרוטוקול שאינו תלוי-צנטריפוגה כחלופה תפוקה גבוהה הפרוטוקול המקורי במהלך ההכתמה של התאים לקראת הניתוח cytometric זרימה. וזמינותו המתוארים במאמר זה משתמש בספריית מתחם קטן של מעכבי קינאז, אבל, באופן עקרוני, ניתן להשתמש להקרנה תפוקה גבוהה יותר. הספריה של הבחירה ניתן גם לשלב מגוון רחב של מעכבי או מולקולות אחרות.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

הקולטן T-cell (TCR) איתות לשביל כוללת שפע של מגשרים המעבירים אותות על הפעלת TCR. יש כבר הציע, מיושמת לצורך זיהוי מתווכים חדשים של TCR איתות, אשר היה לשפר את ההבנה של התהליכים T-cell, כולל הפעלה ובחירת הרתי אסטרטגיות שונות. אנו מתארים וזמינותו של ההקרנה המאפשרת הזיהוי של מולקולות המשפיעים TCR איתות בהתבסס על ההפעלה של פיתוח thymocytes. אותות TCR חזקה לגרום thymocytes המתפתח להפעלת מכונות אפופטוטיים להיפגע בתהליך המכונה הבחירה שלילי. באמצעות היישום של מעכבי קינאז, אלה עם מטרות המשפיעות TCR איתות מסוגלים לעקוף את התהליך של בחירת שלילי. השיטה מפורט במאמר זה יכול לשמש כדי לזהות מעכבים של kinases הקנוני עם תפקידים הוקמה ב המסלולים איתות TCR וגם מעכבים של kinases החדש עדיין כדי שהוקם המסלולים איתות TCR. ניתן להחיל את ההקרנה האסטרטגיה כאן למסכים של תפוקה גבוהה יותר לצורך זיהוי מטרות druggable הרומן TCR איתות.

הגישה וזמינותו ההקרנה מסוכם ב איור 1A. מעכבי קינאז הוקרנו קודם על השפעתם סמויה על יכולת הקיום thymocyte. כפקד חיובי עבור אפופטוזיס, דקסמתזון שימש סוכן proapoptotic. Gating עבור האוכלוסייה תא חי נקבע בהתבסס על הפקדים שלילי שלא טופלו שהפקדים שטופלו דקסמתזון חיובי (איור 1B). מעכבי נבדקו לראשונה ב- 10 מיקרומטר על thymocytes, אחוז התאים קיימא נמדדה לאחר המקננת על 18 h. חלון 20% עבור מוות תאים נבחר כך תרכובות וגרמתי גדול יותר מ- 20% אובדן תאי השער תא חי, לעומת הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד, נבדקו בריכוזים נמוכים (איור 1B). FACS נציג, חלקות דגימות שטופלו מעכב שנבחרו מוצגים להמחשת וזמינותו הכדאיות. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; רשויות אישורים 154447-36-6), מעכב PI3K22, לא להגביר באופן משמעותי מוות של תאים ב- 10 מיקרומטר, המדכא-10 מיקרומטר שומש את מבחני עוקבות. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; רשויות אישורים 1202884-94-3), מעכב כפול של PI3Kα/mTOR23, המושרה רמות גבוהות של מוות של תאים ב- 10 מיקרומטר ו- 1 מיקרומטר אך לא 0.1 מיקרומטר, 0.1 מיקרומטר היה נחוש בדעתו להיות הריכוז מתאים עבור יישום מבחני במורד הזרם. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; רשויות אישורים 62996-74-1), מעכב פאן-חלבון קינאז C עם יכולת הוקמה כדי לגרום אפופטוזיס24, המושרה בתא משמעותיים מוות בריכוזים כל נבדק, אפילו ב 0.1 מיקרומטר. זה היה בשימוש מבחני עוקבות-מיקרומטר 0.1 כפקד של חיוביים נוספים.
ריכוז סופי מעכבי נבחרו על סמך הריכוזים הגבוהים ביותר שבו הם לא מרחיבים מוות של תאים על-ידי יותר מ- 20% מכלל הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד. עם ריכוז סופי מעכבי נחוש, צלחת מניות של מעכבי הוכן כך כל המעכבים היו 500 פעמים את הריכוז כאשר חל על התאים. איור 1C ממחיש את הפריסה צלחת צלחת מניות, עם ריכוז סופי מעכבי. בפרוטוקול חלופית של המקננת התאים ישירות הצלחות קטנות בנפח זרימה שכבתית שטיפה assay, השימוש באמצעי אחסון קטן המתחייבות לדילול נוסף לבית חולים. כדי להבטיח כי תוכן דימתיל סולפוקסיד התרבויות לאחר תוספת מעכב לא תהיה גבוהה מדי עבור התאים, מעכבי היו עוד יותר מעורבבת עם RPMI מלאה, במקדם דילול של 5, כך הם היו 100 פעמים המיועד הריכוז כאשר חל תאים.
מעכבי, מדולל ריכוזי רעילים, שימשו וזמינותו של אפופטוזיס TCR-גירוי-induced thymocytes5,17. הגירוי בוצע באמצעות אנטי-CD3/CD28 חרוזים עבור 18 h, התאים היו מוכתמים לאחר מכן עבור הפעלת קספאז-3 ב- CD4+ ו CD8+ DP thymocyte האוכלוסייה (איור 2). עלייה קספאז-3 ההפעלה ואת הביטוי CD69, וגם TCR downregulation, נצפו גם את האנטי-CD3/CD28-גירוי וגם דימתיל סולפוקסיד-מוק-טיפול אנטי-CD3/28-גירוי הדגימות, לעומת הדגימות nonstimulated. הדגימות שטופלו דקסמתזון הראה עלייה קספאז-3 הפעלה עצמאית של קולטנים upregulation CD69, אשר צפוי של אפקט בתדר אפופטוזיס להיות עצמאית של גירוי TCR.
איור 3A מסכם את התוצאות של הספרייה הקרנת assay עבור מעכבי שנבחרו. הפעלת קספאז-3 והן CD69 יכול לשמש כדי לזהות פוטנציאל מעכבי עניין בשל הדיכוי של הביטוי. כצפוי, מעכבי של מתווכים הקנוני של TCR איתות הופיע בתור חיובי כניסות במסכים. מעכבי כזה, אשר הציג בדרגות שונות של עוצמה מעכבות, כולל מעכבי רחבת-טווח שכוונו kinases מרובים ועוד, כמו כן, מעכבי ספציפיים. כמה מעכבי הצליחו לדכא את קספאז-3 הפעלה והן קולטנים upregulation CD69 (איור 3B, השורה העליונה, לוחות שמאלה). אחד מעכב כזה הוא bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; רשויות אישורים 137592-45-1), אשר מעכב כל חלבון קינאז C איזופורמים, בנוסף קינאז A ו PDK125,26,27. מעכב אחר בקטגוריה זו הוא CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CA 494772-86-0), מעכב המוצע של IKK228.
היו תרכובות עכבות קולטנים upregulation CD69, אך לא לפגום הפעלה קספאז-3 (איור 3B, השורה העליונה, לוחות נכון). CAY10626, מעכב של PI3Kα, mTOR23, ו- U-0126 (2, 3-bis [אמינו [(2-aminophenyl) thio] מתילן]-butanedinitrile; רשויות אישורים 109511-58-2), מעכב MEK29, היו חלק מעכבי שזוהה. התוצאות מציגות כי מעכבי שונים מיקוד kinases שונה מענפים ספציפיים של מסלול איתות TCR, במיוחד אלה מיקוד kinases בשלב מאוחר, יכול לגרום ירידת ערך סלקטיבי התופעות הפעלה T-cell.
היו שם גם מעכבי זה לא לדכא קולטנים upregulation CD69 וגם ההפעלה קספאז-3 (איור 3B, שורה תחתונה, לוחות שמאלה). פקליטקסל (βS-(benzoylamino) - αR - הידרוקסי-חומצה benzenepropanoic, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , אסתר 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl; רשויות אישורים 33069-62-4), מפצל של דינמיקה microtubule30ו- necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; רשויות אישורים 337349-54-9), מעכב של קינאז RIP131, הן שני מעכבי מזוהה להיות בקטגוריה זו. במקרים כאלה איפה קולטנים upregulation CD69 והפעלה קספאז-3 לא היו לקוי, זה יכול להיות עקב מעכבי לא מאתרת של קינאז הרלוונטיים של TCR איתות.
כפי שהוזכר קודם, staurosporine שימש את המסכים, על ריכוז זה עדיין המושרה אפופטוזיס thymocytes. כצפוי, המדגם שטופלו staurosporine הראו רמות גבוהות של הפעלת קספאז-3 (איור 3B, שורה תחתונה, בעמודה הימנית). רמות נמוכות של CD69 הביטוי ניתן לייחס עיכוב בתיווך staurosporine של PKC, כפי bisindolylmaleimide II, מעכב עוד פאן-PKC, גם לדכא את הביטוי של CD69. לחלופין, staurosporine המושרה אפופטוזיס בתאים לפני שהם הצליחו upregulate הביטוי CD69.
כדי להגביר את התפוקה ואת אוטומציה של הפרוטוקול, הוכנו פרוטוקולים מקבילים כרוך בשימוש צלחת אוטומטיות שטיפת המערכת באמצעות זרימה שכבתית. שני פרוטוקולים נפרד באמצעות התקן כביסה זה צלחת אוטומטיות היו trialed בהשוואה לשיטה המקובלת culturing בתאי לוחיות 96-ובכן, צביעת תאי פרוטוקול תלויי-צנטריפוגה. שיטה אחת מעורבת culturing התאים צלחות 96-ובכן, לפי הנוהל המקובל, והשלבים, העברת תאי תואם למכונת הכביסה צלחת אוטומטית הלוחות על ההכתמה (איור 4, דגימות DA-כביסה). השיטה האחרת מעורב culturing ישירות בתאים הלוחות תואמת-מכונת כביסה-צלחת וממשיכים עם פרוטוקול מכתימים באותה צלחת (איור 4, דגימות DA-תרבות). הפרוטוקולים צנטריפוגה תלויית לא נותנים הרבה ניגודים ונתנים פעיל קספאז-3, CD69, או TCRβ מכתים מדגמים שונים שנבדקו, לעומת בפרוטוקול צנטריפוגה תלוית קונבנציונאלי (איור 4). הבדלים בעוצמת מכתימים ניתן לייחס באמצעות נוגדנים בריכוזים שונים במקצת במהלך השלבים מוכתמים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> איור 1 : Thymocyte הכדאיות לאחר טיפול עם מעכבי. (א) המתאר ניסיוני של הצעדים העיקריים ב וזמינותו ההקרנה. קיימות שלוש שיטות המוצע הגירוי, כתמים thymocytes בשימוש וזמינותו הפעלה, כלומר (1) culturing של thymocytes ב רגיל צלחות 96-ובכן, ואחריו מכתים באמצעות פרוטוקול מבוסס צנטריפוגה המקובלת, (2) culturing של thymocytes ב רגיל צלחות 96-ובכן, ואחריו מכתים באמצעות פרוטוקול תלוי צנטריפוגה-כביסה, ו- (3) culturing של thymocytes בתוך צלחות בנפח מצומצם, ואחריו מכתים לוחית לאותו שימוש פרוטוקול שאינו תלוי-צנטריפוגה כביסה. (B) Gating אסטרטגיות המשמשים את מבחני יכולת הקיום. השער תא חי נגזר מן הפיזור קדמי (FSC), לצד פיזור (האס) מתווה, כפי שתואר לעיל17. מעכבי שנמצאו גם רעיל-ריכוז שנבדקו היו עוד מבחני הכדאיות בריכוזים נמוכים 10-fold. מדגמים מייצגים שטופלו מעכב מוצגים. הערה הפקד הנפוץ (שטופלו דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]) המשמש את 1 מיקרומטר ודוגמאות מיקרומטר 0.1. (ג) צלחת הפריסה של מעכבי מדולל. ייצוג סכמטי של לוחיות הרישוי. של מעכבי מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד כדי ריכוז של 500 x ריכוז סופי המיועד. כל אחד מייצג טוב אחד מעכב ייחודי; הבארות האפור הן ריקות. הריכוזים המוצגות הן הריכוז הסופי כאשר נוספו תרביות תאים, כלומר 10 מיקרומטר (אדום כהה), (פוקסיה) 1 מיקרומטר ו 0.1 מיקרומטר (כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> איור 2 : צלחת הפריסה של וזמינותו הפעלת thymocyte. (למעלה) עמודות 1 ו-12 שמורים עבור פקדים, בעוד העמודות 2 עד 11 הן דגימות שטופלו מעכב (בז). בארות A1 כדי D1 שממלא הפקד שליליות (nonstimulated [NS]; אפור), ותופס הפקד חיובי עבור מוות של תאים (דקסאמתאזון שטופלו [דקס]; סגול) וולס E1 ל H1. עמודות 2 עד 12 מכילות thymocytes מגורה עם חרוזים אנטי-CD3/CD28. שממלא הפקד חיובי עבור הפעלת thymocyte (דוגמאות מגורה [α-CD3/CD28]; ירוק) וולס A12 D12 ולאחר הפקד הרכב (מגורה, שטופלו דימתיל סולפוקסיד [α-CD3/CD28 + דימתיל סולפוקסיד]; אדום) תופסת בארות E12 כדי H12. (למטה) Flow cytometry חלקות פעיל קספאז-3 (ActCasp3), CD69, ו TCRβ מכתים של thymocytes מגודרת בתוך השער (DP) כפול-חיוביות. מגרשים נציג של פקדים שונים מוצגים. NS = nonstimulated; דקס = דגימות שטופלו דקסמתזון; Α-CD3/CD28 + דימתיל סולפוקסיד = דגימות מגורה עם חרוזים CD3/CD28-מצופה ו שטופלו דימתיל סולפוקסיד; Α-CD3/CD28 = דגימות מגורה עם חרוזים CD3/CD28-מצופה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> איור 3 : הקרנה של הספרייה מעכב על ההפעלה thymocyte. (א) סיכום נתונים של הפעלת וזמינותו. אלו הן התוצאות של ניסוי נציג מציג את הערכים המנורמל של תאים עם קספאז מופעל-3 ו- CD69 ביטוי עבור מעכבי שנבחרו. נורמליזציה נעשה על-ידי השוואת האחוז של תאים פעילים-קספאז-3-חיובית או שער CD69-חיובית לערך של הפקד שטופלו דימתיל סולפוקסיד, אשר מוגדר לערך היחסי של 0 בגרף. (B) נבחר FACS חלקות. חלקות cytometry זרימה של מעכבי זה דיכא קספאז-3 הפעלה והן קולטנים upregulation CD69 (למעלה משמאל), דיכא קולטנים רק CD69 upregulation (למעלה מימין), או לא היתה השפעה על הפעלת קספאז-3 ו- CD69 קולטנים upregulation (משמאל למטה). מגרשים של המדגם שטופלו staurosporine מוצגים כדי להמחיש את ההשפעות של שימוש מעכב בריכוזים רעילים (הימנית התחתונה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> איור 4 : השוואה של הפרוטוקולים assay שונה. Flow cytometry חלקות פעיל קספאז-3 (ActCasp3), CD69, ואת וזמינותו TCRβ מכתים של DP thymocytes עוקב אחר שלושת הפרוטוקולים. ארבעה תנאים שונים נבדקים, כלומר הפקד שליליות (nonstimulated [NS]), את הפקד חיובי עבור מוות תאי (דקסאמתאזון שטופלו [דקס]), הפקד הרכב (מגורה, שטופלו דימתיל סולפוקסיד [α-CD3/CD28 + דימתיל סולפוקסיד]), מעכב- מטופלים לדוגמה (מגורה וטיפל פיק-75 [α-CD3/CD28 + פיק-75]). קונבנציונאלי = את culturing של thymocytes ב תקן 96-ובכן צלחות ואת מכתים עם פרוטוקול מבוסס צנטריפוגה קונבנציונאלי; DA-כביסה = culturing של thymocytes בתוך צלחות 96-ובכן תקן וצביעת באמצעות זרימה שכבתית שטיפה פרוטוקול; DA-תרבות = culturing של thymocytes בתוך צלחות בנפח מצומצם, צביעת לוחית אותו באמצעות זרימה שכבתית שטיפה פרוטוקול.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

נייר זה משתמש assay המבוססות על זרימת-cytometry לספריות מסך של מעכבי כימיים לצורך זיהוי מעכבי ו המטרות שלהם להשפיע על איתות לקולטן T-cell. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן גם עבור הקרנות תפוקה גבוהה.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

התפוקה הגבוהה שלנו מוסיפה לשיטות הזמינות לזיהוי מולקולות קטנות ולמטרות שלהן המווסתות איתות TCR והפעלת תאי T. להערכה שלנו יש היבט של תיקון עצמי באמצעות סינון תרכובות רעילות וזיהוי מעכבי איתות TCR ו אפופטוזיס הנגרמת על ידי גירוי. זיהוי של מתווכים של איתות TCR יכול לסייע בהתפתחויות של טיפול במחלות חיסוניות.סיפקנו גירוי חזק עבור thymocytes נגזר עכברים TCR-polyclonal. ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים TCR ולעורר אותם עם tetramers ליגנד פפטיד אחרים עבור גירוי חלש יותר. ההתקף הזה כרוך בשימוש בכמויות קטנות ובצלחות בנפח קטן לפולחן התאים.זה מחייב טיפול זהיר של הצלחות ותכולתו. ישנם תרכובות רבות בספרייה של מעכבי קינאז אשר נחשבים מסוכנים. משיקולי בטיחות, התייחסו לכל התרכובות כמסוכנות באותה מידה, ופעלו בהתאם לאמצעי הבטיחות המומלצים של הספק.כדי להתחיל את הטיפול thymocytes עם מעכבי קינאז, להשתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 40 microliters לכל באר של thymocytes לצלחת נפח קטן. שים את הצלחת על קרח. ואז פיפטה חלק אחד של מעכבי קינאז, DMSO, ו dexamethasone, וארבעה חלקים של מדיה RPMI מלא לתוך צלחת 96 היטב.ייעוד שמונה בארות של הלוח בנפח קטן לפקדים לא מטופלים, ארבע בארות לפקדים חיוביים שטופלו dexamethasone למוות של תאים על ידי הוספת dexamethasone מדולל בריכוז של חמישה מיקרומולרים, וארבע בארות לפקדים שטופלו ברכב, על ידי הוספת 0.5 microliters של DMSO מדולל. לאחר מכן, מן הבאר המתאימה של צלחת מעכב, להוסיף 0.5 microliters של כל מעכב מדולל לצלחת 96 היטב. כדי להתחיל גירוי thymocyte, תחילה ודא נגד CD-3 ו CD-28 חרוזים מושעים מחדש באופן אחיד.לאחר מכן, לשטוף מיליליטר אחד של חרוזים עם שני מיליליטר של חיץ PBS. שים את הצינור על מעמד מגנטי כדי להפריד חרוזים מן supernatant ולשאפת את הפתרון. ואז להשעות מחדש את חרוזים במיליליטר אחד של מדיום RPMI מלא.הוסיפו 10 מיקרוליטרים לבאגם של מתלי חרוזים לכל דגימה שטופלה על ידי מעכבים, ארבע הדגימות שטופלו ב-DMSO וארבע מתוך שמונת הדגימות שלא טופלו. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של ה-RPMI המלא לארבעת הבירות הנותרות שלא טופלו. השתמש שייקר מסלולית מיקרופלאט כדי להתסיס בעדינות את הצלחת.לאחר מכן, הדגירה thymocytes ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה במשך 17 עד 20 שעות, או לילה. ראש מכונת כביסה אוטומטית לזרימת למינאר, תחילה עם 150 מיליליטר של פתרון אתנול Tween, לאחר מכן עם מים deionized בתוספת 1%Tween 20, ולבסוף, עם חיץ לשטוף FACS. בסוף הדגירה באמצעות מערכת מכונת הכביסה צלחת, לשטוף את הצלחת עם חיץ לשטוף FACS באמצעות מחזור כביסה תשע פעמים.כל שטיפה מוסיפה ומסיר 55 microliters של חיץ לשטוף על ידי זרימה למינארית, וכתוצאה מכך דילול מעריכי של reagents בארות. כדי להכתים אנטיגנים פני השטח, תחילה לדלל נפח יחידה אחת של אנטי-CD-3, אנטי-CD-4, אנטי-CD-8, ונוגדנים נגד CD-69 באמצעי אחסון של 100 יחידות של מאגר לשטוף FACS. ואז להשעות מחדש את התאים ב 25 microliters של תערובת נוגדנים מכתים.השתמש שייקר מסלולית מיקרופלאט בעדינות להתסיס את הצלחת, ולאחר מכן להשאיר את הצלחת על הקרח במשך 30 דקות. כדי לתקן את התאים, לשטוף תחילה את הצלחת עם 55 microliters של מאגר לשטוף FACS באמצעות מחזור כביסה תשע פעמים כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מאגר האימפוליזציה של קיבעון לכל באר.מערבבים היטב להחגירה את הצלחת על הקרח במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הכינו סולן חד-X ושטפו חיץ על ידי דילול 25 מיליליטר של מלאי ה-10X שסופק ב-225 מיליליטר של מים Ultrapure. ראש מכונת הכביסה צלחת עם חיץ אחד X ולשטוף את הצלחת עם 55 microliters של חיץ X אחד באמצעות מחזור כביסה תשע פעמים כמתואר קודם לכן.כדי להתחיל, לערבב מיליליטר אחד של נוגדן נגד caspase 3 עם שני מיליליטר של פרם X אחד ואת חיץ לשטוף. מוסיפים 25 מיקרוליטר לגם של התערובת לתאים הקבועים. השתמש שייקר מסלולית מיקרופלאט כדי להתסיס בעדינות את הצלחת.תשאיר את הצלחת על הקרח למשך שעה. בסוף הדגירה, חזור על שלב הכביסה תשע פעמים עם perm X אחד ומאגר לשטוף. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה FACS לכל בארות הצלחת.פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון. לבסוף, להעביר את הדגימות המעורבות לתוך צינורות microtiter. הברג את הצינורות עם מאגר הכביסה של FACS לנפח כולל של 200 מיקרוליטרים, והמשך לניתוח ציטומטריית הזרימה.בעקבות אנטי CD-3, גירוי CD-28, עלייה בהפעלת Caspase-3 ואת רגולציה TCR נצפו הן בדגימות מטופלות והן DMSO ללעוג. כמו כן, עלייה בביטוי CD-69 נצפתה בשתי הדגימות מגורה. הדגימות שטופלו dexamethasone הראו עלייה בהפעלת CASPASE-3 ללא תלות ב- CD-69 upregulation, כצפוי עבור אפקט אפופטוזיס עצמאי וגירוי TCR.הפגיעה הסלקטיבית בתופעות הפעלת תאי T הוכחה על ידי מעכבים שונים שהדחיקה הן את הפעלת Caspase-3 והן את תקנת CD-69, או את רגולציית CD-69 מעוכבים, אך לא פגעה בהפעלת Caspase-3. היו גם מעכבים שלא למקד קינאז רלוונטי של מסלול איתות TCR, ולכן לא לדכא הן CD-69 upregulation ו caspase-3 הפעלה. תוצאת המסך של staurosporine, השליטה החיובית אפופטוזיס, הראה רמות גבוהות של הפעלת caspase-3, כצפוי.עם זאת, התוצאה גם הראתה רמות נמוכות של ביטוי CD-69 שניתן לייחס או עיכוב מתווך של חלבון קינאז C או אפופטוזיס המושרה שלה לפני ביטוי CD-69. השוואה בין פרוטוקולי התקנה שונים לא הראתה הבדלים בקאספסה-3 פעילה, CD-69 וכתמי TCR של הבקרה השלילית, השליטה החיובית במוות התא, בקרת הרכב ודגימה שטופלה במעכבים. שלבי טרום הדגירה נועדו להקל על השימוש בצלחת בנפח קטן עבור culturing של התאים.הפרוטוקול הסטנדרטי התלוי בצנטריפוגה ניתן גם בכתב היד. מעכבים או מטרות שעשויים להיות מעניינים יכולים להיות מאומתים באמצעות סוגי תאים שונים וגם במינים שונים, כגון לימפוציטים עכבר פגופרי או תאים ראשוניים אנושיים. אפיון עוקב של המולקולות שזוהו והיעדים יכולים לעזור לשפר את ההבנה של ביולוגיה של תאי T ולהרחיב על מטרות אפשריות לאימונומודולציה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

באמצעות רנטגן קריסטלוגרפיה, ביופיזיקה, מבחנים תפקודיים לקביעת הכרת קולטן מנגנוני שלטון תאי T של אנטיגנים הסרטן

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...