Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Consiglio del Singapore Ministero della sanità nazionale delle ricerche mediche, NMRC CBRG15may017 e il Ministero dell'istruzione, 2014 Singapore-T2-1-136 (a N.R.J.G.).

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L'autore Chyan Ying Ke è un dipendente di Curiox Biosystems, che produce la cellula DA lavatrice e piastre DA-cellulare utilizzati in questo articolo.

La strategia di screening proposta qui valuta la capacità di piccole molecole per sopprimere gli effetti apoptotici in timociti dopo stimolazione, oltre alle più convenzionali marcatori di cellula T upregulation di attivazione-CD69 e downregulation TCR . Ulteriori marcatori possono anche essere inclusi per consentire l'analisi di timociti diversi sottoinsiemi32. Un aspetto interessante del dosaggio attuale sta nel fatto che gli inibitori che ostacolano la segnalazione TCR rallenterebbe anche l'induzione di apoptosi, evidenziando ulteriormente la distinzione degli effetti di TCR-indipendente che gli inibitori possono avere sull'induzione della morte delle cellule. Inoltre, un'analisi di citometria a flusso-base consente l'utilizzo di più letture come marcatori di attivazione distinte, che potrebbero riferire gli effetti degli inibitori sui rami separati singoli di segnalazione TCR. Nel caso presentato qui, c'erano gli inibitori che hanno mostrato un'inibizione differenziale dell'attivazione di caspase-3 e CD69 upregulation. Poiché alcuni composti potrebbero influire sulle funzioni di pulizia come la sintesi proteica o traffico vescicolare dei suini, non è sorprendente osservare effetti sul upregulation del de novo sintetizzati gli indicatori (ad es., CD69) ma non su posttranslational modifiche (ad esempio, l'attivazione proteolitica di caspase-3).
Come il saggio presentato qui misure apoptosi come una lettura, è imperativo che gli effetti tossici latenti degli inibitori non oscurare i risultati. Ad esempio, nella schermata, abbiamo non diluire staurosporine oltre 1 nM, nonostante fosse ancora tossico per le cellule a quella concentrazione. I risultati rappresentativi sono d'accordo con staurosporine essendo un inibitore della chinasi promiscua e un induttore di apoptosi33. Senza una sufficiente diluizione dei composti testati a concentrazioni non tossiche, è possibile trascurare potenziali hit.
La strategia di screening dettagliata qui sarebbe difficilmente applicabile agli esseri umani dovuto le complicazioni connesse con l'ottenimento di un numero sufficiente di timociti per high throughput screening. Tuttavia, è possibile ottenere campioni di timo umano da biopsie cardiache pediatrica34,35 o da feti36,37. Ciò nonostante, come TCR segnalazione percorsi e le sequenze di aminoacidi delle proteine di segnalazione sono in gran parte conservate tra topi e nell'uomo, il dosaggio di timociti fornisce una strategia di screening preliminare utile, e tutti i risultati ottengono con questo test utilizzando il mouse timociti, quindi, verificabile in linfociti umani primari.
Una limitazione del protocollo dipendente dalla centrifugazione convenzionale riguarda la prospettiva di perdita delle cellule, che può essere attribuita alla natura più fasi del processo, che prevede misure quali la permeabilizzazione delle cellule e centrifugazione. Ogni centrifugazione e risospensione passo inevitabilmente comporta la perdita delle cellule. Mentre tali perdite potrebbero non essere fondamentale per gli studi che coinvolgono un numero limitato di campioni, si potrebbero porre dei problemi quando applicato nello screening di throughput più elevato, in particolare col progredire della analisi formato da 96 - a 384 - a 1536-bene. Un modo per aggirare questo problema è attraverso l'uso di sensori cellula-permeabile caspase fluorescente38 che permettono il rilevamento di attivazione delle caspasi, evitando le complicazioni di permeabilizzazione delle cellule e più lavaggi5. In alternativa, impiegando un metodo di centrifugazione indipendente di lavaggio celle di flusso laminare è anche possibile per minimizzare la perdita delle cellule. Con una piastra automatizzata stazione in combinazione con un piatto di parete-meno di lavaggio, le cellule vengono lavate da flusso laminare senza l'uso di una centrifuga. La diluizione esponenziale dei reagenti permette per la pulizia accurata ed efficiente di cellule in meno di 3 min, che rappresenta una diluizione equivalente a due giri di centrifuga lavaggio. Senza sollecitazioni esterne a causa di centrifugazione, le cellule sono più vitali e le perdite delle cellule sono ridotti al minimo.
Abbiamo anche esplorato la possibilità di utilizzare la piastra automatizzata stazione di lavaggio dopo la coltura i timociti in fondo U 96 pozzetti piastre e, anche, alla coltura delle celle direttamente in placche a muro-meno compatibili con la piastra automatizzata stazione di lavaggio. La coltura delle cellule nelle placche a muro-meno abilitato l'eliminazione di tutte le fasi di centrifugazione e ridotto al minimo la perdita delle cellule eliminando la necessità di un trasferimento di campione attraverso piastre. Generalmente, i tre protocolli differenti sono paragonabili in efficienza di stimolazione e la macchiatura. La stazione di lavaggio automatico fornisce il vantaggio di automazione, velocità ed efficienza, che rende più facile per un throughput più elevato analisi. Inoltre, con una maggiore automazione, i passaggi di lavaggio possono essere effettuati più velocemente, e c'è una maggiore coerenza tra gli esperimenti o sperimentatori. Tuttavia, la stazione di lavaggio presenta alcuni inconvenienti: grandi volumi di buffer di lavaggio sono necessari per la rondella di adescamento (150 mL ogni cambiamento di buffer, di cui 50 mL è utilizzato per il lavaggio); cura supplementare è necessaria quando si maneggia la piastra per evitare qualsiasi contaminazione dei pozzi a causa di partizionamento limitato tra i pozzetti della piastra piccolo-volume; buffer di residuo di 25 µ l nei pozzetti dopo lavaggio richiede l'uso di reagenti preparati a un più elevato di concentrazione di 1 x. Per risolvere i problemi di volume residuo e capacità di volume limitato della piastra, può essere aggiunto un accessorio per espandere il volume di incubazione da 70 µ l a 150 µ l, facilitando l'adozione di protocolli convenzionali. Mentre i sistemi di movimentazione automatizzata piastra sono attualmente disponibili, che hanno un'impronta significativa rispetto al sistema di lavaggio laminare, che è una piccola unità di ~ 1 piede cubico (~0.028 m3). Inoltre, l'integrazione di centrifugazione in piastra automatizzato, sistemi di movimentazione è impegnativo, limitando il loro uso nel lavaggio delle cellule. Non ci sono attualmente nessun altra cella centrifuga-indipendente lavaggio degli strumenti disponibili, per quanto sappiamo.
La strategia di screening qui presentata è in grado di identificare piccole molecole e loro chinasi destinazione presunta, che colpiscono TCR di segnalazione e attivazione delle cellule T. La libreria utilizzata qui comprende principalmente piccole molecole inibitori delle chinasi ed era in grado di generare un numero di hit potenzialmente interessanti. Il protocollo può anche essere prontamente applicato librerie inibitore di altre classi di enzimi o ad altri tipi di piccole molecole, così come librerie di altri composti (per esempio, varie macromolecole). Il protocollo è utilizzabile anche per altri tipi di cellule, quali i linfociti T periferici o cellule immortalizzate, compresi quelli che esprimono TCR transgenici o che trasportano sistemi reporter a schermo. Identificare e caratterizzare nuovi mediatori del T-cell signaling può migliorare la nostra conoscenza del pathway di segnalazione e anche un aiuto nello sviluppo della terapia mirata in malattie immuni13,14,15, 16. nel complesso, questo studio aggiunge alla gamma di opzioni disponibili per la rilevazione dei mediatori di segnalazione tramite HTS saggi di T-cellulare.

Le cellule T sono un lignaggio dei linfociti che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'immunità adattativa. Essi esprimono TCR, che permette loro di riconoscere i loro ligandi, costituito da una molecola di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di complessi con un peptide associato, che si trovano sulle superfici del presentanti l'antigene (APCs) di cellule. L'attivazione del TCR via attraverso l'interazione di TCR/MHC di segnalazione è cruciale per l'attivazione delle cellule T e sviluppo1.
Nello sviluppo delle T-cellule, derivate da midollo osseo di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) migrano al timo, dove subiscono differenziazione e passare attraverso le fasi di progressione di T-cellula lineage2. Timociti di doppio-positivi (DP), che esprimono sia il CD4 e CD8 corecettori, impegnano con self-peptide/MHC sulle APCs. Timociti con una moderata affinità per loro ligandi self-peptide/MHC maturo per diventare timociti (SP) CD4 o CD8 singolo-positivi, un processo definito come selezione positiva. Al contrario, timociti che ricevono un'eccessiva stimolazione del TCR attraverso l'auto-peptide/MHCs subiscono apoptosi tramite selezione negativa3,4. Questo processo di apoptosi indotta da stimolazione, caspasi-dipendente può essere imitato in vitro stimolando i timociti, ad esempio con perline rivestite con anticorpo anti-CD3/285. Cellule T mature che passano il processo di selezione vengono attivate da ligandi non-self-peptide/MHC da APC nella periferia. Self-peptide/MHCs sono ancora rilevanti per cellule di T periferiche, nel contesto del tonico di segnalazione per la sopravvivenza e proliferazione omeostatica, la differenziazione dei linfociti T helper e il potenziamento delle risposte delle cellule T per non-self-peptide/MHCs attraverso coagonism6,7,8,9. Associazione di TCR ad alta affinità per il ligando di peptide/MHC attiva diverse vie di segnalazione a valle, che coinvolgono molte molecole di segnalazione che formano un complesso TCR segnalazione rete10. Le vie di segnalazione TCR sono state studiate per diversi decenni, e ancora la scoperta di nuovi mediatori del pathway non mostra alcun segno di cedimento,11,12. La modulazione delle vie di segnalazione di TCR ha rilevanza clinica e può coinvolgere potenzianti risposte a cellula T per applicazioni immunoterapeutiche o l'inibizione di risposte a cellula T per il controllo di autoimmunità13. Strategie per la modulazione delle risposte a cellula T dipendono principalmente la rottura della chinasi o fosfatasi attività14,15,16.
Descriviamo un'applicazione di un test di base di citometria a flusso per lo screening di piccoli composti chimici per la loro capacità di modulare la segnalazione di TCR e di attivazione delle cellule T17. Il dosaggio si basa sul fenomeno dei timociti attivazione della via di apoptosi quando esposti a forti segnali di TCR. Il dosaggio è sufficientemente sensibile per identificare i cambiamenti nella forza di stimolazione; incubando timociti che esprimono TCR transgenici con tetrameri di peptide/MHC con l'aumento di affinità ha provocato un aumento corrispondente di caspase attivazione-usato come misura della risposta apoptotica5. Per lo schermo, abbiamo usato una biblioteca degli inibitori della chinasi e valutare la loro capacità di modulare la risposta di timociti a forti segnali di TCR.
Diverse strategie di flusso cytometry-basato o fluorescenza-reporter sono state descritte per lo screening di alto-rendimento di un assortimento di fenotipi di attivazione periferica in vari sottoinsiemi a cellula T. Tali strategie includono l'uso di reporter genetici fluorescenti per valutare i tempi e la grandezza di cellula T attivazione18, l'uso del degranulation come una lettura di citotossica delle cellule T attività19,20e l'analisi della fosforilazione di varie proteine coinvolte nella segnalazione21cellulare.
Il test di screening qui presentato è in grado di identificare correttamente i composti che inibiscono molecole canoniche del TCR signaling pathway, nonché potenziali, romanzo composti con effetti inibitori su segnalazione TCR. Ad esempio, abbiamo identificato gli inibitori di GSK3β e Hsp90 come nuovi composti che interessano la cellula T risposte17. Il dosaggio è in grado di distinguere gli inibitori che interferiscono con la trasduzione del segnale, a causa di una riduzione nella risposta apoptotica, dagli effetti TCR-indipendente degli inibitori sulla tossicità cellulare. Oltre l'induzione di apoptosi, misuriamo anche upregulation di CD69 e TCR downregulation come marcatori di attivazione. Come TCR segnalazione reti sono complesse, l'utilizzo di più letture possa aumentare le probabilità di scoprire molecole con effetti specifici su un singolo percorso. Qui, presentiamo anche l'uso di un protocollo di centrifugazione-indipendente come alternativa ad alta produttività per il protocollo originale durante la colorazione delle cellule in preparazione per l'analisi cytometric di flusso. L'analisi descritta in questo articolo utilizza una piccola biblioteca composta degli inibitori della chinasi ma, in linea di principio, può essere utilizzato per lo screening di prestazioni superiore. La biblioteca di scelta può anche incorporare una varietà di inibitori o altre molecole.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprende una moltitudine di mediatori che trasmettono i segnali al momento dell'attivazione del TCR. Diverse strategie sono state proposte e attuate per l'identificazione di nuovi mediatori di segnalazione TCR, che migliorerebbe la comprensione dei processi di T-cellula, compreso l'attivazione e selezione timica. Descriviamo un test di screening che consente l'identificazione di molecole che influenzano TCR di segnalazione basato sull'attivazione di sviluppare timociti. Segnali di forte TCR causa timociti in via di sviluppo attivare il macchinario apoptotico in un processo noto come selezione negativa. Attraverso l'applicazione degli inibitori della chinasi, quelli con gli obiettivi che riguardano la segnalazione TCR sono in grado di ignorare il processo di selezione negativa. Il metodo descritto in questo documento può essere utilizzato per identificare gli inibitori delle chinasi canoniche con ruoli stabiliti nelle vie di segnalazione TCR e anche gli inibitori delle chinasi nuove ancora ad essere istituito nelle vie di segnalazione TCR. La strategia di screening qui può essere applicato agli schermi di un throughput più elevato per l'identificazione di nuovi bersagli nella segnalazione di TCR.

L'approccio al test di screening è riassunto nella Figura 1A. Gli inibitori di chinasi in primo luogo sono stati schermati per i loro effetti latenti sulla vitalità di timociti. Come controllo positivo per apoptosi, desametasone è stato usato come agente proapoptotici. Il gating per la popolazione di cellule vive è stato determinato in base ai comandi negativi non trattati e i controlli positivi trattati con desametasone (Figura 1B). Gli inibitori sono stati analizzati a 10 µM su timociti, e la percentuale di cellule vitali è stata misurata dopo incubazione per 18 h. Una finestra di 20% per la morte delle cellule è stato scelto tale che i composti che ha indotto una più grande del 20% perdita di cellule nel cancello cellule vive, rispetto ai campioni trattati con DMSO, sono stati testati a concentrazioni più basse (Figura 1B). Appezzamenti di FACS rappresentativi di campioni trattati con inibitore selezionati sono mostrati per illustrare l'analisi di attuabilità. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), un inibitore di PI3K22, non ha notevolmente aumentato la morte delle cellule a 10 µM e l'inibitore è stato usato a 10 µM per le analisi successive. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), un inibitore doppio di PI3Kα/mTOR23, indotta da alti livelli di morte delle cellule a 10 µM e 1 μm, ma non a 0,1 µM e 0,1 µM è stata determinata per essere la concentrazione adatta per applicazione nelle analisi a valle. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), un inibitore di chinasi C pan-proteina con una consolidata capacità di indurre apoptosi24, ha indotto la morte cellulare significativo a tutte le concentrazioni testate, anche a 0,1 µM. Nelle successive analisi a 0,1 µM fungeva un ulteriore controllo positivo.
Le concentrazioni finali degli inibitori sono state selezionate sulle più alte concentrazioni in cui hanno non amplificare la morte delle cellule di oltre il 20% dei campioni trattati con DMSO. Con le concentrazioni finali degli inibitori determinati, una piastra d'archivio degli inibitori è stata preparata tale che tutti gli inibitori erano 500 volte la concentrazione quando applicato alle celle. Figura 1 illustra il layout della piastra della piastra d'archivio, con le concentrazioni finali degli inibitori. Nel protocollo alternativo di incubando le cellule direttamente nelle piastre di piccolo volume per il dosaggio di lavaggio a flusso laminare, l'utilizzo di piccoli volumi hanno reso necessaria un'ulteriore diluizione degli inibitori. Per garantire che il contenuto di DMSO delle culture dopo aggiunta di inibitore non sarebbe troppo alto per le cellule, gli inibitori sono stati diluiti ulteriormente in RPMI completo, per un fattore di diluizione di 5, tale che si trovavano a 100 volte la concentrazione prevista quando applicato alla cellule.
Gli inibitori, diluiti a concentrazioni non tossiche, sono stati utilizzati nell'analisi per TCR-stimolazione-induced apoptosis in timociti5,17. La stimolazione è stata effettuata utilizzando anti-CD3/CD28 perline per 18 h, e le cellule sono state successivamente macchiate per attivazione di caspase-3 il CD4+ e CD8+ DP popolazione timociti (Figura 2). Un aumento nell'attivazione di caspase-3 e CD69 espressione e anche un downregulation TCR, sono stati osservati in anti-CD3/CD28-stimolata e i campioni anti-CD3/28-stimolata con DMSO-mock-trattati, rispetto ai campioni nonstimulated. I campioni trattati con desametasone hanno mostrato un aumento nell'attivazione di caspase-3 indipendente di CD69 upregulation, che ci si aspetta dall'effetto di induzione è indipendente di stimolazione del TCR.
Figura 3A riassume i risultati della biblioteca lo screening test per inibitori selezionati. Sia l'attivazione di caspase-3 e CD69 può essere utilizzato per identificare potenziali inibitori di interesse dovuto la soppressione dell'espressione. Come previsto, inibitori della canoniche mediatori di segnalazione TCR si presentò come risultati positivi nelle schermate. Tali inibitori, che hanno esibito vari gradi di potenza inibitoria, inclusi gli inibitori ad ampio spettro che target chinasi multiple e, inoltre, più inibitori specifici. Alcuni inibitori sono stati in grado di sopprimere l'attivazione di caspase-3 e la upregulation di CD69 (Figura 3B, riga superiore, pannelli a sinistra). Una tale inibitore è bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), che inibisce tutte le isoforme di proteina chinasi C, oltre a chinasi di proteina A e PDK125,26,27. Un altro inibitore in questa categoria è CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), un inibitore della proposta di IKK228.
C'erano composti che hanno inibito il upregulation di CD69 ma non hanno alterato l'attivazione di caspasi-3 (Figura 3B, riga superiore, pannelli di destra). CAY10626, un inibitore della PI3Kα e mTOR23e U-0126 (2,3-bis [ammino [(2-aminophenyl) thio] metilene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), un inibitore MEK29, erano alcuni degli inibitori identificati. I risultati mostrano che diversi inibitori targeting diverse chinasi da rami specifici del pathway di segnalazione TCR, specialmente quelli targeting chinasi in fase avanzata, possono provocare il danno selettivo dei fenomeni di attivazione delle cellule T.
C'erano anche gli inibitori che non sopprimere sia upregulation di CD69 e attivazione di caspase-3 (Figura 3B, riga inferiore, pannelli a sinistra). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - idrossi-acido benzenepropanoic, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl estere; CAS 33069-62-4), un disgregatore di microtubule dynamics30e necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), un inibitore della chinasi di RIP131, sono due inibitori identificati per essere in questa categoria. In tali casi dove upregulation di CD69 e attivazione di caspase-3 non sono state alterate, questo può essere dovuto gli inibitori non targeting una chinasi pertinente del TCR via di segnalazione.
Come accennato in precedenza, è stato utilizzato staurosporine nelle schermate, ad una concentrazione che ancora ha indotto gli apoptosi nei timociti. Come previsto, il campione staurosporine-trattati ha mostrato alti livelli di attivazione di caspase-3 (Figura 3B, riga inferiore, la colonna di destra). I bassi livelli di espressione CD69 possono essere attribuiti all'inibizione staurosporine-mediata di PKC, come bisindolylmaleimide II, un altro inibitore PKC-pan, inoltre ha soppresso l'espressione di CD69. In alternativa, staurosporine indotto apoptosi nelle cellule prima che fossero in grado di aumentare l'espressione CD69.
Per aumentare il throughput e l'automazione del protocollo, sono stati preparati protocolli paralleli che comportava l'uso di una piastra automatizzato di lavaggio sistema tramite flusso laminare. Due protocolli separati utilizzando questo dispositivo di lavaggio automatico piastra erano sperimentati e rispetto al metodo convenzionale della coltura delle cellule in piastre da 96 pozzetti e macchiatura le cellule in un protocollo di centrifugazione-dipendente. Un metodo ha coinvolto coltivando le cellule in piastre da 96 pozzetti, come da procedura standard, e quindi, trasferire le cellule a placche compatibili con la rondella piastra automatizzati per la macchiatura passaggi (Figura 4, campioni DA lavare). L'altro metodo ha coinvolto coltura le cellule direttamente nelle piastre piastra-rondella-compatibile e continuando con il protocollo di colorazione sulla stessa piastra (Figura 4, campioni DA-Culture). I protocolli di centrifugazione-indipendente non danno molte differenze percepibili in attiva caspase-3, CD69 o TCRβ colorazione attraverso i diversi campioni testati, rispetto al protocollo convenzionale di centrifugazione-dipendente (Figura 4). Differenze nell'intensità di colorazione possono essere attribuite a usando gli anticorpi alle concentrazioni leggermente differenti durante la procedura di colorazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figura 1 : Redditività thymocyte dopo trattamento con inibitori. (A) struttura sperimentale dei passaggi principali nel test di screening. Ci sono tre metodi proposti per la stimolazione e la macchiatura dei timociti usati per il test di attivazione, vale a dire (1) alla coltura di timociti in piastre standard da 96 pozzetti, seguite dalla macchiatura utilizzando un protocollo basato su centrifugazione convenzionale, (2) i coltura di timociti in piastre standard da 96 pozzetti, seguite dalla macchiatura utilizzando un protocollo di lavaggio indipendente dalla centrifugazione e (3) la coltura dei timociti in piastre di piccolo volume, seguita dalla macchiatura delle piastre stesse utilizzando un protocollo di lavaggio indipendente dalla centrifugazione. (B) Gating strategie utilizzate nei saggi di vitalità. Il cancello di tensione delle cellule è stato derivato dal forward scatter (FSC) e tracciati a dispersione laterale (SSC), come descritto in precedenza17. Inibitori che sono stati ritenuti per essere troppo tossico alla concentrazione testata erano soggette a ulteriori saggi di vitalità alle concentrazioni più basse di 10 volte. Campioni rappresentativi di inibitore-trattati sono mostrati. Nota il controllo comune (DMSO-trattati [DMSO]) utilizzato per la 1 µM e 0,1 µM campioni. (C) layout di piastra di inibitori diluiti. Una rappresentazione schematica delle piastre di inibitori diluiti in DMSO a una concentrazione di 500 x la concentrazione finale prevista. Ognuno rappresenta anche un unico inibitore; i pozzetti grigi siano vuoti. Le concentrazioni mostrate sono la concentrazione finale quando aggiunto a colture cellulari, vale a dire 10 µM (rosso scuro), 1 µM (fucsia) e 0,1 µM (blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figura 2 : Layout di piastra del dosaggio attivazione timociti. (In alto) Le colonne 1 e 12 sono riservate per i controlli, mentre le colonne 2 e 11 sono campioni trattati con inibitore (beige). Il controllo negativo (nonstimulated [NS]; grigio) occupa pozzetti A1 a D1, e il controllo positivo per la morte delle cellule (trattati con desametasone [DEX]; viola) occupa pozzetti E1 H1. Le colonne 2 e 12 contengono timociti stimolati con anti-CD3/CD28 perline. Il controllo positivo per l'attivazione di timociti (campioni stimolati [α-CD3/CD28]; verde) occupa pozzi A12 a D12 e controllo del veicolo (stimolato e trattati con DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]; rosso) occupa pozzi E12 a H12. (In basso) Flusso cytometry appezzamenti di attiva caspase-3 (ActCasp3), CD69 e TCRβ la macchiatura dei timociti recintati all'interno del cancello (DP) doppio-positivi. Appezzamenti rappresentativi di diversi controlli vengono visualizzati. NS = nonstimulated; DEX = campioni trattati con desametasone; Α-CD3/CD28 + DMSO = campioni stimolati con perline CD3/CD28-rivestito e trattati con DMSO; Α-CD3/CD28 = campioni stimolati con perline CD3/CD28-rivestito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figura 3 : Screening della libreria inibitore sull'attivazione di timociti. (A) i dati del test attivazione di riepilogo. Questi sono i risultati di un esperimento rappresentanza mostrando i valori normalizzati delle cellule con attivato caspase-3 e l'espressione CD69 inibitori selezionati. Normalizzazione è stato fatto confrontando la percentuale di cellule nel cancello di CD69-positivi per il valore del controllo trattati con DMSO, che è impostato su un valore pari a 0 nel grafico relativo o attivo-caspase-3-positive. (B) selezionato FACS trame. Flusso cytometry trame di inibitori che ha soppresso l'attivazione di caspase-3 e la CD69 upregulation (in alto a sinistra), soppresso solo CD69 upregulation (in alto a destra), o non ha avuto effetto sull'attivazione di caspase-3 e CD69 upregulation (in basso a sinistra). Trame del campione staurosporine-trattati sono mostrati per illustrare gli effetti dell'utilizzo di un inibitore alle concentrazioni tossiche (in basso a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figura 4 : Confronto tra i protocolli di analisi differenti. Flusso cytometry appezzamenti di attiva caspase-3 (ActCasp3), CD69, e TCRβ la macchiatura dei timociti DP seguendo tre diverse analisi di protocolli. Quattro diverse condizioni sono testate, vale a dire il controllo negativo (nonstimulated [NS]), il controllo positivo per la morte delle cellule (trattati con desametasone [DEX]), il controllo del veicolo (stimolato e trattati con DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) e trattati con un inibitore campione (stimolato e PIK-75-trattati [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Convenzionale = la coltura dei timociti in piastre standard da 96 pozzetti e la colorazione con un protocollo basato su centrifugazione convenzionale; DA lavare = alla coltura dei timociti in piastre standard da 96 pozzetti e che macchia usando un flusso laminare lavaggio protocollo; DA-Culture = alla coltura dei timociti in piastre di piccolo volume e colorazione delle piastre stesse utilizzando un protocollo di lavaggio a flusso laminare.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Il nostro saggio ad alta produttività si aggiunge ai metodi disponibili per l'identificazione di piccole molecole e dei loro obiettivi che modulano la segnalazione TCR e l'attivazione delle cellule T. Il nostro saggio ha un aspetto auto-correttivo filtrando i composti tossici e identificando gli inibitori della segnalazione TCR e dell'apoptosi indotta dalla stimolazione. L'identificazione di mediatori della segnalazione TCR può aiutare nello sviluppo della terapia per le malattie immunitarie.Abbiamo fornito un forte stimolo per i timociti derivati da topi TCR-policlonali. È possibile utilizzare topi TCR-transgenici e stimolarli con altri tetrameri del ligando peptidico per una stimolazione più debole. Questo saggio prevede l'uso di piccoli volumi e di lastre di piccolo volume per la coltivazione delle cellule.Ciò richiede un'attenta movimentazione delle piastre e del suo contenuto. Ci sono molti composti nella libreria di inibitori della chinasi che sono considerati pericolosi. Per motivi di sicurezza, trattare tutti i composti come ugualmente pericolosi e seguire le precauzioni di sicurezza raccomandate dal fornitore.Per iniziare il trattamento dei timociti con inibitori della chinasi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 40 microlitri per pozzo di timociti a una piastra di piccolo volume. Metti il piatto sul ghiaccio. Quindi pipettare una parte degli inibitori della chinasi, DMSO e desametasone, e quattro parti del supporto RPMI completo in una piastra a 96 potte.Designare otto pozzi della piastra di piccolo volume a comandi non trattati, quattro pozzi per i controlli positivi trattati con desametasone per la morte cellulare aggiungendo il desametasone diluito alla concentrazione di cinque micromolare e quattro pozzi ai comandi trattati con veicolo, aggiungendo 0,5 microlitri del DMSO diluito. Successivamente, dai pozzi corrispondenti della piastra inibitore, aggiungere 0,5 microlitri di ogni inibitore diluito alla piastra da 96 po '. Per iniziare la stimolazione del timocita, assicurarsi prima che le perline anti-CD-3 e CD-28 siano sospese uniformemente.Quindi, lavare un millilitro delle perline con due millilitri del tampone PBS. Mettere il tubo su un supporto magnetico per separare le perline dal supernatante e aspirare la soluzione. Quindi sospendere di nuovo le perline in un millilitro del mezzo RPMI completo.Aggiungere 10 microlitri per pozzo della sospensione del tallone a ciascun campione trattato con inibitori, ai quattro campioni trattati con DMSO e a quattro degli otto campioni non trattati. Aggiungere 10 microlitri dell'RPMI completo ai restanti quattro pozzi non trattati. Utilizzare uno shaker orbitale a micropiastra per agitare delicatamente la piastra.Successivamente, incubare i timociti in 37 gradi Celsius e 5% di ambiente di anidride carbonica per 17-20 ore o durante la notte. Innescare una rondella automatica a flusso laminare, prima con 150 millilitri di soluzione Tween di etanolo, poi con acqua deionizzata integrata con 1%Tween 20 e, infine, con tampone di lavaggio FACS. Al termine dell'incubazione utilizzando il sistema di lavaggio della piastra, lavare la piastra con tampone di lavaggio FACS utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte.Ogni lavaggio aggiunge e rimuove 55 microlitri di tampone di lavaggio per flusso laminare, con conseguente diluizione esponenziale dei reagenti nei pozzi. Per macchiare gli antigeni superficiali, diluire prima un volume unitario di anticorpi anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 e anti-CD-69 in volumi di 100 unità del tampone di lavaggio FACS. Quindi sospendere di nuovo le cellule in 25 microlitri della miscela di anticorpi di colorazione.Utilizzare uno shaker orbitale micropiastra per agitare delicatamente la piastra, quindi lasciare la piastra sul ghiaccio per 30 minuti. Per fissare le celle, lavare prima la piastra con 55 microlitri di tampone di lavaggio FACS utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte superiore a quello descritto in precedenza. Quindi aggiungere 50 microlitri del buffer di fissazione-impermeablizzazione ad ogni pozzo.Mescolare bene e incubare il piatto sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, preparare una X perm e lavare il tampone diluire 25 millilitri dello stock 10X fornito in 225 millilitri di acqua Ultrapure. Innescare la rondella con tampone one-X e lavare la piastra con 55 microlitri del tampone one-X utilizzando un ciclo di lavaggio nove volte come descritto in precedenza.Per iniziare, mescolare un millilitro dell'anticorpo anti-caspasi 3 con due millilitri del perm one-X e del tampone di lavaggio. Aggiungere 25 microliter per pozzo della miscela alle celle fisse. Utilizzare uno shaker orbitale a micropiastra per agitare delicatamente la piastra.Lasciare il piatto sul ghiaccio per un'ora. Al termine dell'incubazione, ripetere il passaggio di lavaggio nove volte con l'una X perm e il tampone di lavaggio. Quindi aggiungere 25 microlitri del tampone di lavaggio FACS a tutti i pozzi della piastra.Pipetta su e giù un paio di volte per mescolare la soluzione. Infine, trasferire i campioni misti in tubi a microtitoro. Ricaricare i tubi con il tampone di lavaggio FACS fino a un volume totale di 200 microlitri e procedere all'analisi della citometria del flusso.A seguito della stimolazione anti-CD-3, CD-28, è stato osservato un aumento dell'attivazione della caspasi-3 e la downregolazione TCR sia nei campioni non trattati che in quello pretrattato DMSO. Inoltre, è stato osservato un aumento dell'espressione del CD-69 in entrambi i campioni stimolati. I campioni trattati con desametasone hanno mostrato un aumento dell'attivazione della caspasi-3 indipendente dall'upregolazione cd-69, come previsto per l'effetto indipendente che induce l'apoptosi e la stimolazione TCR.La compromissione selettiva dei fenomeni di attivazione delle cellule T è stata mostrata da diversi inibitori che hanno soppresso sia l'attivazione della caspasi-3 che l'up-regulation del CD-69, o l'up-regulation del CD-69, ma non hanno compromesso l'attivazione della caspasi-3. C'erano anche inibitori che non miravano a una chinasi rilevante della via di segnalazione TCR, e quindi non sopprimevano sia l'upregolazione CD-69 che l'attivazione della caspasi-3. Il risultato dello schermo della staurosporina, il controllo positivo all'apoptosi, ha mostrato alti livelli di attivazione della caspasi-3, come previsto.Tuttavia, il risultato ha anche mostrato bassi livelli di espressione cd-69 che possono essere attribuiti alla sua inibizione mediata della protein chinasi C o alla sua apoptosi indotta prima dell'espressione cd-69. Il confronto di diversi protocolli di dosaggio non ha mostrato differenze nella colorazione attiva della caspasi-3, CD-69 e TCR del controllo negativo, del controllo positivo per la morte cellulare, del controllo del veicolo e di un campione trattato con inibitori. Le fasi di pre-incubazione hanno lo scopo di facilitare l'uso della piastra di piccolo volume per la lavorazione delle cellule.Il protocollo standard dipendente dalla centrifuga è fornito anche nel manoscritto. Inibitori o bersagli potenzialmente interessanti possono essere convalidati utilizzando diversi tipi di cellule e anche in diverse specie, come i linfociti pagoferali del topo o le cellule primarie umane. La successiva caratterizzazione delle molecole identificate e degli obiettivi può aiutare a migliorare la comprensione della biologia delle cellule T ed espandere i possibili obiettivi per l'immunomodulazione.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

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I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

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Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l&#39;esplorazione del Biblioteche composto naturale

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Utilizzando cristallografia a raggi X, Biofisica, e saggi funzionali per determinare i meccanismi di amministrazione delle cellule T del recettore Riconoscimento di cancro antigeni

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...