Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
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이 작품은 (N.R.J.G.)에 싱가포르 사역의 건강의 국립 의학 연구 위원회, NMRC CBRG15may017는 싱가포르 교육부의 교육, 2014-t 2-1-136에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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저자 Chyan 잉 애 다 셀 세탁기를 생산 하 고이 문서에서 사용 되는 다 셀 접시 Curiox 농의 직원입니다.

여기 제안 심사 전략 T 세포 활성화 CD69 upregulation와 TCR downregulation의 전통적인 마커 뿐만 아니라 자극 후 thymocytes에 apoptotic 효과 억제 하는 작은 분자 억제제의 기능 평가 . 추가 마커 다른 thymocyte 하위32의 분석을 포함 될 수 있습니다. 현재 분석 결과의 흥미로운 측면 TCR 신호 방해 억제제 또한 apoptosis, 더 TCR 독립적인 효과 억제제에 세포 죽음을 유도 할 수 있습니다의 구별을 강조의 유도 저해할 것 사실에서 속 인 다. 또한, cytometry 기반 시작 흐름 분석 결과 별도 개별 분기의 TCR 신호에 억제제의 효과 보고 수 고유 활성화 마커로 여러 표시기를 사용 하 여가 있습니다. 여기에 제시 된 경우, caspase 3 활성화 CD69 upregulation의 차동 저해는 저 해제 했다. 일부 화합물 단백질 합성 또는 기공을 밀매 같은 가사 기능에 영향을 미칠 수 있습니다, 때문에 그것은 놀라운 합성 드 노 보 마커 (예를 들어, CD69)의 upregulation에 하지만 posttranslational 효과 관찰 하 수정 (예를 들어, caspase 3의 분해 활성화).
분석 결과 제시로 여기 측정 apoptosis를 판독으로는 저 해제의 잠재 독성 효과 결과 가리지 않도록 할 필수적입니다. 예를 들어 화면에서 우리가 않았다 하지 희석 staurosporine 1 nM, 여전히 그 농도에서 세포에 독성이 되 고 그것에 불구 하 고. 대표 결과 무차별 kinase 억제제 및 apoptosis33의 유도 되 고 staurosporine와는. 비 독성 농도 시험 화합물의 충분 한 희석 하지 않고 잠재적인 안타를 간과 하기 가능 하다.
여기 상세한 심사 전략 높은 처리량 검열을 위한 thymocytes의 충분 한 숫자를 얻기와 관련 된 합병증으로 인해 인 간에 게 적용 하기 어려운 것입니다. 그러나, 그것이 소아 심장 biopsies34,35 또는 태아36,37에서 인간의 thymus 샘플을 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, TCR 신호 경로 및 신호 단백질의 아미노산 시퀀스는 주로 쥐와 인간 사이 보존으로 thymocyte 분석 결과 유용한 예비 심사 전략을 제공 하 고 마우스를 사용 하 여이 분석 결과 얻은 모든 결과 thymocytes 다음, 기본 인간 림프 톨에 확인할 수 있습니다.
기존의 원심 분리-의존 프로토콜의 한계가 셀 permeabilization 및 원심 분리 단계를 포함 하는 과정의 다단계 성격에 기 인할 수 있다 세포 손실의 장래성에 적용 됩니다. 각 원심 분리 및 물의 resuspension 단계 필연적으로 하지 셀의 손실에 결과. 이러한 손실을 제한 된 수의 샘플을 포함 하는 연구에 대 한 중요 한 되지 않을 수도 있습니다, 그것은 문제를 384-에 1536-잘에서 96-분석 결과 형식 진행으로 특히 높은 처리량 검열에서 적용 될 때를 내포할 수 있습니다. 이 문제를 우회 하는 한 가지 방법은 셀 permeabilization 및 여러 세척5의 합병증을 피하는 동안 caspase 활성화의 감지 하는 세포 침투성 형광 caspase 센서38 사용입니다. 또는, 고용 층 흐름에 의해 세포를 세척 하는 원심 분리 독립 방법 셀 손실 최소화에 대 한 가능성도 있다. 자동화 된 플레이트 벽 없는 접시와 함께에서 역 세척 세포 분리기의 사용 없이 층 흐름에 의해 세척 된다. 시 약의 지 수 희석 3 분 미만, 원심 세척의 2 라운드에 동등한 희석을 나타내는 셀의 철저 하 고 효율적인 rinsing에 대 한 수 있습니다. 원심 분리로 인해 외부 스트레스 없이 셀 더 실용적 이며 셀 손실 최소화 됩니다.
우리는 또한 96 잘 U-하단에 thymocytes 경작 후 역 세척 자동화 된 접시를 사용의 가능성을 탐험 접시와, 또한, 벽 없는 접시 역 세척 자동화 된 플레이트와 호환에서 직접 셀의 경작. 벽 없는 판에 셀의 경작의 모든 원심 분리 단계 제거 고 접시에 걸쳐 샘플 전송에 대 한 필요성을 제거 하 여 세포 손실 최소화. 일반적으로, 세 가지 다른 프로토콜 자극 효율성과 얼룩에 비교할 수 있습니다. 자동된 세척 역 자동화, 속도, 그리고 쉽게 더 높은 처리량 분석 효율의 이점을 제공 한다. 또한, 증가 자동화 세척 단계 수행할 수 있습니다 더 빨리, 그리고 실험 또는 경험 사이 큰 일관성. 그러나, 세척 역은 특정 단점: 대용량 버퍼 세척의 세탁기 못쓰게 버퍼 변경, 50 mL에 사용 되는 당 (150 mL);에 대 한 필요는 여분 배려; 작은 볼륨 판의 우물 사이의 제한 된 분할 때문에 우물의 어떤 상호 오염을 피하기 위해 접시를 처리할 때 필요 높은에서 준비 하는 시 약의 사용을 필요로 하는 세척 후 스에서 25 µ L의 잔여 버퍼 1 x 농도 보다. 해결 하기 위해 잔류 볼륨의 문제와 접시의 한정 된 볼륨 용량, 150 µ L 70 µ L에서 인큐베이션 볼륨 확장을 추가할 수 있습니다, 기존 프로토콜의 도입을 촉진. 자동된 판 처리 시스템 현재 사용할 수 있지만, 그들은 ~ 1 입방 피트 (~0.028 m3)의 작은 단위 층 류 세척 시스템에 비해 상당한 풋프린트가 있다. 또한, 시스템을 처리 하는 자동화 된 접시에 원심 분리의 통합, 셀 세척에서 그들의 사용을 제한 하는 도전 이다. 현재 다른 분리기 독립 셀 우리가 아는 악기, 세척이 있다.
여기에 제시 된 검사 전략은 작은 분자, TCR 신호 및 T 세포 활성화에 영향을 주는 그들의 의도적인된 목표 kinases 식별할 수 있습니다. 여기에 사용 하는 라이브러리 kinases의 주로 작은 분자 억제제를 구성 하 고 잠재적으로 흥미로운 안타의 숫자를 생성 하 수 있었다. 억제제 라이브러리 다른 효소 클래스 또는 작은 분자의 다른 종류 뿐만 아니라 다른 화합물 (예를 들어, 다양 한 고분자)의 라이브러리가 프로토콜은 또한 쉽게 적용 수 있습니다. 프로토콜 또한 주변 T 세포 또는 유전자 변형 TCRs 표현 또는 기자 시스템을 들고 그를 포함 하 여 불멸 하 게 셀 등 다른 세포 유형, 화면을 사용할 수 있습니다. 식별 및 T-세포 신호 통로의 우리의 지식을 향상 시킬 수 있으며 또한 면역 질환13,,1415, 에 타겟된 치료의 개발에 도움이 신호의 새로운 중재자 16. T 세포 신호 를 통해 높은 처리량 검열 분석 실험의 중재자의 검출에 대 한 사용할 수 있는 옵션의 범위를 추가,이 연구.

T 세포는 적응 면역 유지에 중추적인 역할을 하는 림프 톨의 혈통. 그들은 표현 수 있게 그들의 ligands, 단지 중요 한 조직 적합성 복잡 한 분자 (MHC)의 구성 된 인식 바운드 펩 티 드와 함께, TCR, 항 원 제시의 표면에서 발견 되는 세포 (Apc). TCR/MHC 상호 작용을 통해 통로 신호 하는 TCR의 발생 하는 것은 T 세포 활성화 및 개발1에 대 한 중요 합니다.
T-셀 개발, 뼈 골 수 유래 조 혈 줄기 세포 (HSCs) 마이그레이션할 thymus, 그들은 차별화를 받아야 하 고 T 세포 계보 진행2의 단계를 통해 이동. 더블-양성 (DP) thymocytes, c d 4와 CD8 coreceptors 표현 자체-펩 티 드 MHC는 APCs에 참여 합니다. 그들의 자기-펩 티 드/MHC ligands에 대 한 적당 한 선호도 thymocytes 성숙 될 단일 포지티브 (SP) CD4 또는 CD8 thymocytes, 긍정적인 선택으로 불리는 과정. 반대로, 자기-펩 티 드/MHCs 통해 과도 한 TCR 자극 받을 thymocytes apoptosis를 통해 부정적인 선택3,4를 받 다. 자극 유발, caspase 종속 apoptosis의이 과정은 안티-CD3/28 항 체 코팅 구슬5와 예 thymocytes를 자극 하 여 도출 생체 외에서 수 있습니다. 성숙한 T 세포 선택 과정을 통과 하는 주변에 있는 APCs에서 비-자체-펩 티 드/MHC ligands에 의해 활성화 됩니다. 자기-펩 티 드/MHCs는 여전히 비-자체-펩 티 드/MHCs 통해 T 세포 응답의 향상, 보조 T 세포의 분화 및 항상성 확산, 생존 신호 토 닉의 맥락에서 주변 T 세포에 대 한 관련 coagonism6,7,,89. 펩 티 드/MHC 리간드에 대 한 높은 선호도 TCR 바인딩을 여러 다운스트림 신호 경로 포함 하는 복잡 한 TCR 신호 네트워크10를 형성 하는 많은 신호 분자를 활성화 합니다. TCR 신호 경로 몇 십년 동안 연구 하 고 아직 통로의 새로운 중재자의 발견11,12사 그러의 흔적을 보여줍니다. TCR 신호 통로의 변조 임상 관련성을가지고 있으며 potentiating immunotherapeutic 응용 프로그램 또는 면역13의 컨트롤에 대 한 T 세포 응답의 억제에 대 한 T 세포 응답을 포함할 수 있다. T 세포 응답의 변조에 대 한 전략은 주로 키 또는 인산 가수분해 효소 활동14,,1516의 중단에 따라 달라 집니다.
우리는 TCR 신호 및 T 세포 활성화17을 조절 하는 능력에 대 한 작은 화합물의 심사에 대 한 흐름-cytometry 기반 분석 결과의 응용 프로그램을 설명 합니다. 분석 결과 thymocytes 강한 TCR 신호에 노출 되 면 apoptosis 통로 활성화의 현상에 경첩. 분석 결과 충분히 자극 강도; 변경 사항을 식별합니다 caspase apoptotic 응답5의 정품 인증 사용 증가 결과 선호도 증가 함께 펩 티 드/MHC tetramers와 유전자 변형 TCR 표현 thymocytes 잠복기. 화면에 대 한 우리 도서관 kinase 억제제를 사용 하 고 강한 TCR 신호 thymocyte 응답을 조절 하는 능력을 평가.
여러 흐름-cytometry-또는 형광 기자-기반 전략 다양 한 주변 활성화 고기 다양 한 T 세포 부분 집합에서의 높은 처리량 검열에 대 한 설명 했습니다. 타이밍 및 T 세포 활성화18의 진도 평가 하기 위해 유전자 형광 기자를 사용 하 여, 세포 독성 T 세포 활동19,의20, 판독 및 분석으로 degranulation 사용 하 여 이러한 전략 등은 21를 신호 하는 세포에 관련 된 다양 한 단백질의 인 산화.
여기에 제시 된 심사 분석 결과 성공적으로 TCR 신호에 대 한 억제 효과와 잠재적인, 소설 화합물으로 서 통로 신호 하는 TCR의 정식 분자를 억제 하는 화합물을 식별 할 수 있다. 예를 들어 우리는 T 세포 응답17에 영향을 미치는 새로운 화합물으로 GSK3β의 Hsp90 억제제를 식별. 분석 결과 신호 변환, 세포 독성에는 억제제의 TCR 독립적인 효과에서 apoptotic 응답에 있는 감소 때문에 방해가 억제제를 구별할 수 있다. Apoptosis 유도 이외에 우리 또한 측정 CD69 upregulation와 TCR downregulation 활성화의 표식. 네트워크는 복잡 한 신호 하는 TCR로 여러 정보를 사용 하 여 단일 통로에 특정 효과와 분자를 발견의 기회를 증가할 수 있다. 여기, 우리는 또한 흐름 cytometric 분석에 대 한 준비에 있는 세포의 착 색 하는 동안 원래 프로토콜에는 높은 처리량으로 원심 분리 독립 프로토콜의 사용을 소개 합니다. 이 문서에서 설명 하는 분석 결과 kinase 억제제의 작은 화합물 라이브러리를 사용 하지만, 원칙적으로, 그것은 더 높은 처리량 검열에 대 한 사용할 수 있습니다. 선택의 라이브러리 억제제 또는 다른 분자의 다양 한을 통합 수 있습니다.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

T-세포 수용 체 (TCR) 신호 통로 구성 하 고 다양 한 전송 하는 중재자는 TCR의 활성화 신호. 다른 전략을 제안 하 고 활성화 등 thymic 선택 T-셀 프로세스의 이해 개선 하는 것의 TCR 신호, 새로운 중재자의 식별을 위해 구현 되었습니다. TCR thymocytes 개발의 활성화에 따라 신호에 영향을 주는 분자의 식별을 가능 하 게 하는 심사 분석 결과 설명 합니다. 강력한 TCR 신호 부정적인 선택 이라는 프로세스에 apoptotic 기계를 활성화 하기 위해 개발 thymocytes 발생할. Kinase 억제제의 응용 프로그램을 통해 TCR 신호에 영향을 주는 목표와 그 부정적인 선택의 과정을 무시할 수 있습니다. 이 문서에 자세히 설명 하는 방법의 TCR 신호 경로에 설립 역할과 정식 kinases 억제제와 억제제의 TCR 신호 경로에 설립 되 고 아직 새로운 kinases 식별 하 사용할 수 있습니다. 여기에 심사 전략 TCR 신호에 소설 druggable 대상의 id 위한 높은 처리량의 화면에 적용할 수 있습니다.

심사 분석 결과에 대 한 접근은 그림 1A에 요약 됩니다. Kinase 억제제 thymocyte 생존에 그들의 잠재적인 효과 대 한 처음 상영 되었다. Apoptosis에 대 한 긍정적인 컨트롤로 dexamethasone proapoptotic 요원으로 사용 되었다. 라이브 세포 인구를 위한 게이팅 치료 부정적인 컨트롤 및 dexamethasone 취급 긍정적인 컨트롤 (그림 1B)에 따라 하는 것을 결정 했다. 억제제 thymocytes에 10 µ M에서 먼저 테스트 하 고 실행 가능한 세포의 비율 18 시간 배양 후 측정 했다. 세포 죽음에 대 한 20% 창 화합물을 유발 되도록 선정 되었다 큰 20% 보다 라이브 셀 게이트, DMSO 처리 샘플에 비해 셀의 손실 낮은 농도 (그림 1B)에서 시험 되었다. 선택한 억제제 치료 샘플의 대표적인 FACS 플롯 생존 능력 분석 결과 설명 하기 위해 표시 됩니다. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), PI3K 억제제22, 10 µ M에서 세포 죽음을 크게 증가 하지 않았다 고는 억제제 10 µ M에 후속 분석을 위해 사용 되었다. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3),23, PI3Kα/mTOR 이중 억제 물 유도 10 µ M에서 세포 죽음의 상부와 1 µ M에서만에 0.1 µ M와 0.1 µ M 다운스트림 분석 응용 프로그램에 대 한 적당 한 농도을 결정 했다. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1),24, apoptosis 유도 하기 위해 설립 능력 팬 단백질 키 니 아 제 C 억제 물 유도 모든 농도 0.1 µ M에도 테스트에서 중요 한 세포 죽음. 그것은 추가적인 긍정적인 컨트롤로 0.1 µ M에 후속 분석 실험에서 사용 되었다.
저 해제의 최종 농도 어떤 점에서 그들은 하지 DMSO 처리 샘플의 20% 이상 세포 죽음 증폭 않았다 높은 농도에 따라 선정 됐다. 억제제 결정의 최종 농도와 억제제의 사진 플레이트는 모든 억제제 했다 500 배 농도 있는 셀에 적용 될 때 준비 되었다. 그림 1C 는 억제제의 최종 농도와 주식 접시의 접시 레이아웃을 보여 줍니다. 분석 결과 세척 층 류 흐름에 대 한 작은 볼륨 번호판에서 직접 세포 배양의 대체 프로토콜에서 작은 볼륨의 사용은 억제제의 추가 희석 필요한. 되도록 DMSO는 문화 콘텐츠의 억제제의 추가 셀에 대 한 너무 높은 되지 않을 것 이라고 후는 억제제 했다 더 희석 완전 RPMI에 5, 희석 배 100 배는 원하는 농도에 적용 될 때에 그들이 그런는 셀입니다.
억제제, 비 독성 농도 희석 thymocytes5,17TCR 자극 유도 된 apoptosis에 대 한 분석 결과에서 사용 되었다. 자극 18 h에 대 한 안티-CD3/CD28 비즈를 사용 하 여 실시 되었다 그리고 셀 이후에 caspase 3는 CD4에 활성화에 대 한 스테인드 했다+ 와 CD8+ DP thymocyte 인구 (그림 2). Caspase 3 활성화 CD69 식 및 TCR downregulation의 증가 안티-CD3/CD28-자극 및 nonstimulated 샘플에 비해 DMSO 모의 치료 안티-CD3/28-자극 샘플, 모두에서 관찰 되었다. Dexamethasone 처리 샘플 CD69 upregulation TCR 자극의 독립적인 apoptosis 유도 효과의 예상 되는의 독립적인 caspase 3 활성화에 증가 보여주었다.
그림 3A 선택한 억제제에 대 한 분석 결과 심사 하는 라이브러리의 결과 요약 합니다. Caspase 3 활성화 및 CD69 식의 탄압으로 관심의 잠재적인 억제제를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예상 했던 대로, TCR 신호의 정식 중재자의 저 해제 화면에서 긍정적인 명 중으로 나타났다. 전시 금지 힘의 다양 한 각도, 같은 억제제 포함 여러 kinases 및 또한, 더 많은 대상으로 넓 스펙트럼 억제제 특정 억제제. 일부 억제제 caspase 3 활성화와 CD69 upregulation (그림 3B, 맨 위 행, 왼쪽된 패널)을 억제할 수 있었다. 이러한 한 억제제는 bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), 있는 모든 단백질 키 니 아 제 C isoforms 단백질 키 니 아 제 A와 PDK125,,2627억제. 이 범주에 다른 억제제는 CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), IKK228의 제안 된 억제 물.
CD69 upregulation 저해 하지만 caspase 3 활성화 (그림 3B, 위쪽, 오른쪽 패널)을 손상 하지 않은 화합물을 확인 하 고 있었다. CAY10626, PI3Kα 및 mTOR23및 U-0126의 억제제 (2, 3-두번째 [아미노 [(2-aminophenyl) thio] methylene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), 한 MEK 억제제29, 확인 된 억제제의 일부를 했다. 결과 표시 다른 억제제 TCR 신호 통로의 특정 지점에서 다른 kinases 특히 그 단계의 kinases 타겟팅 대상으로 T-세포 활성화 현상의 선택적 장애가 발생할 수 있습니다.
억제제 CD69 upregulation 및 caspase 3 활성화 (그림 3B, 맨 아래, 왼쪽된 패널)을 억제 하지 않았다 했다. Paclitaxel (βS-(benzoylamino)-αR-hydroxy-benzenepropanoic 산, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl 에스테 르; CAS 33069-62-4), microtubule 역학30및 necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile;의 방해는 CAS 337349-54-9), RIP1 니31, 억제제는이 카테고리에 식별 하는 두 억제제. 어디 CD69 upregulation 및 caspase 3 활성화 되지 않은 장애인 같은 경우에이 수 수는 억제제 인 하지 타겟팅 통로 신호 하는 TCR의 관련 키.
앞에서 설명 했 듯이, staurosporine는 여전히 thymocytes는에 있는 apoptosis를 유도 하는 농도에 스크린에 사용 되었다. 예상 했던 대로, staurosporine 처리 샘플 caspase 3 활성화 (그림 3B, 맨 아래, 오른쪽 열)의 높은 수준을 보여주었다. CD69 식의 저급 bisindolylmaleimide II, 다른 팬 PKC 억제제, 또한 억압 CD69 표현으로 PKC의 staurosporine 중재 금지를 지정할 수 있습니다. 또는, staurosporine 유도 된 세포에 있는 apoptosis 그들은 upregulate 수 있었다 전에 CD69 식.
처리량 및 자동화 프로토콜의 증가, 병렬 프로토콜 시스템 통해 층 류를 세척 하는 자동화 된 플레이트의 사용을 포함 하는 준비 되었다. 이 자동화 된 접시 세척 장치를 사용 하 여 두 개의 별도 프로토콜 trialed 되었고 96 잘 접시에서 세포를 배양 하 고 원심 분리-의존 프로토콜에서 세포를 얼룩이 지기의 종래의 방법에 비해. 한 가지 방법은 표준 절차, 당 96 잘 접시에 세포 배양 및 다음, (그림 4, 다 세척 샘플) 단계는 얼룩에 대 한 번호판 자동된 접시 세탁기와 호환 셀을 전송. 다른 방법은 배양 접시-세탁기-호환 접시에 직접 셀와 같은 접시 (그림 4, 다 문화 샘플)에 얼룩 프로토콜을 계속 관여. 원심 분리 독립 프로토콜 활성 caspase 3, CD69, 또는 TCRβ는 다른 테스트 샘플, 기존의 원심 분리-의존 프로토콜 (그림 4)에 비해 전체 얼룩에 많은 인지할 수 차이 영향을 주지 않는다. 착 강도 차이 착 단계 동안 약간 다른 농도에서 항 체를 사용 하 여 지정할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> 그림 1 : 억제제로 치료 후 thymocyte 생존. 심사 분석 결과 주요 단계 (A) 실험 개요. 세 가지 제안된 방법 자극 하 고 활성화 분석 결과, 즉 (1) 배양 thymocytes 기존의 원심 기반 프로토콜을 사용 하 여 얼룩 다음 표준 96 잘 접시에서의 사용 thymocytes의 얼룩에 대 한 (2)는 사용 하 여 동일한 격판덮개에 얼룩이 다음 작은 볼륨 접시, thymocytes 경작 thymocytes 얼룩 원심 분리 독립 세척 프로토콜 (3)을 사용 하 여 다음 표준 96 잘 접시에서의 경작을 원심 분리 독립 세척 프로토콜입니다. (B) 게이팅 생존 능력 분석 실험에서 사용 되는 전략. 라이브 셀 게이트 앞으로 분산형 (FSC)에서 파생 된 고 측 (SSC) 점도, 앞에서 설명한17. 억제제 너무 시험된 농도에서 독성 간주 했다 10 낮은 농도에서 더 생존 능력 분석 실험 대상이 됐다. 대표 억제제 치료 샘플 표시 됩니다. 1 µ M와 0.1 µ M 샘플에 사용 되는 공용 컨트롤 (DMSO 치료 [DMSO]) note (C) 희석된 억제제의 플레이트 레이아웃. DMSO에 의도 된 최종 농도 x 500의 농도를 희석 하는 저 해제의 접시의 도식 적인 표현입니다. 각 잘 한 독특한 억제제를;를 나타냅니다. 회색 웰 스 비어 있습니다. 표시 된 농도 최종 농도 세포 배양, 즉 10 µ M (짙은 빨간색), 1 µ M (적자 색), 그리고 0.1 µ M (블루)에 추가 될 때. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> 그림 2 : Thymocyte 활성화 분석 결과의 플레이트 레이아웃. (맨 위) 열 1 및 12 열 2 11 억제제 치료 샘플 (베이지색) 동안 컨트롤에 대 한 예약 되어 있습니다. 부정적인 제어 (nonstimulated [NS]; 그레이) D1, 하 웰 스 a 1을 차지 하 고 세포 죽음 (dexamethasone 취급 [덱 스]; 자주색)에 대 한 긍정적인 통제 우물 E1 H1 차지. 열 2 ~ 12 thymocytes 안티-CD3/CD28 구슬 자극된 포함 되어 있습니다. Thymocyte 활성화 (자극된 샘플 [α-CD3/CD28]; 녹색)에 대 한 긍정적인 제어 차지 웰 스 A12 D12, 및 차량 제어를 (자극과 DMSO 치료 [α-CD3/CD28 + DMSO] 빨간색;) 우물 E12 H12 차지. (아래) 활성 caspase-3 (ActCasp3), CD69, cytometry 플롯 흐름 및 TCRβ thymocytes 이중 양성 (DP) 게이트 내 문이의 얼룩. 다른 컨트롤의 대표 작이 표시 됩니다. NS = nonstimulated; 덱 스 = dexamethasone 처리 샘플; Α-CD3/CD28 + DMSO 샘플 CD3/CD28-코팅 구슬 자극과 DMSO; 치료 = Α-CD3/CD28 = 샘플 CD3/CD28-코팅 구슬 자극된. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> 그림 3 : Thymocyte 활성화에 억제제 라이브러리의 심사. (A) 데이터 활성화 분석 결과의 요약. 이 활성화 된 caspase 3와 CD69 식을 선택한 억제제에 대 한 셀의 정규화 된 값을 보여주는 대표적인 실험의 결과입니다. 정규화는 액티브 caspase 3 양성 또는 CD69 포지티브 게이트 그래프에서 0의 상대적인 값으로 설정 되어 있는 DMSO 처리 컨트롤의 값을 셀의 비율을 비교 하 여 이루어졌다. (B) 선택 FACS 플롯합니다. 억제제 caspase 3 활성화와 CD69 upregulation (왼쪽 상단), 억압의 흐름 cytometry 플롯만 CD69 upregulation (오른쪽 위), 억제 또는 caspase 3 활성화 및 CD69 upregulation (왼쪽 아래)에 영향을 주지 않습니다를 했다. Staurosporine 처리 샘플의 플롯 억제제를 사용 하 여 독성 농도 (오른쪽 하단)에서 효과 설명 하기 위해 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> 그림 4 : 다른 분석 결과 프로토콜의 비교. 활성 caspase-3 (ActCasp3), CD69, cytometry 플롯 흐름 그리고 프로토콜 분석 결과 TCRβ DP thymocytes 다음 다른 3의 얼룩. 4 다른 조건 테스트, 즉 부정적인 제어 (nonstimulated [NS]), 세포 죽음 (dexamethasone 취급 [덱 스])에 대 한 긍정적인 제어, 차량 제어 (자극과 DMSO 치료 [α-CD3/CD28 + DMSO]), 억제제 치료 샘플 (자극 그리고 PIK 75 취급 [α-CD3/CD28 + PIK-75]). 기존의 표준 96 잘 접시에서 thymocytes의 경작 및 기존의 원심 기반 프로토콜; 얼룩 = 다 세척 = thymocytes 표준 96 잘 접시에서의 경작 및 프로토콜; 세척 층 류를 사용 하 여 얼룩 다 문화 = thymocytes 작은 볼륨 판에서의 경작 및 세척 프로토콜 층 류를 사용 하 여 동일한 격판덮개에 얼룩.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

우리의 높은 처리량 분석법은 TCR 신호 및 T 세포 활성화를 조절하는 작은 분자 및 그들의 표적의 식별을 위한 유효한 방법에 추가합니다. 우리의 분석은 독성 화합물을 필터링하고 TCR 신호 및 자극 유발 세포멸의 억제제를 식별하여 자체 시정 측면을 가지고 있습니다. TCR 신호의 중재자의 식별은 면역 질환에 대한 치료의 개발에 도움이 될 수 있습니다.우리는 TCR 폴리클론 마우스에서 파생된 티모사이클에 대한 강력한 자극을 제공했습니다. TCR-트랜스제닉 마우스를 사용하고 약한 자극을 위해 다른 펩타이드 리간드 테트라머로 자극할 수 있습니다. 이 분석법은 세포의 배양을 위한 소량 및 소량 판의 사용을 포함합니다.이를 위해서는 플레이트와 그 내용물의 주의 깊게 다루어야 합니다. 위험한 것으로 간주되는 키나아제 억제제 라이브러리에는 많은 화합물이 있습니다. 안전 고려 사항에 대 한, 동등 하 게 위험 으로 모든 화합물을 치료, 그리고 공급 업체의 권장 된 안전 예방 조치를 따르십시오.키나제 억제제로 티모사이클을 치료하려면 다중 채널 파이펫을 사용하여 작은 볼륨 플레이트에 티모사이클의 웰당 40 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 키나아제 억제제, DMSO 및 덱사메타손의 한 부분, 및 전체 RPMI 미디어의 4개의 부분을 96웰 플레이트로 피펫합니다.소량 판의 8개의 우물을 치료되지 않은 컨트롤에 지정하고, 5마이크로몰러 농도에서 희석된 덱사메타손과 4개의 우물을 차량 처리 제어에 추가하여 세포 사멸을 위한 덱사메타손 처리양성 컨트롤에 4개의 우물을 지정하여 희석DMSO의 0.5 마이크로리터를 첨가하였다. 다음으로, 억제제 플레이트의 해당 우물에서, 96-well 플레이트에 각 희석 억제제의 0.5 마이크로리터를 추가한다. 티모세포 자극을 시작하려면 먼저 CD-3 반대 구슬과 CD-28 구슬이 균일하게 다시 일시 중단되었는지 확인하십시오.다음으로 PBS 버퍼의 2밀리리터로 구슬 1밀리리터를 세척합니다. 튜브를 자기 스탠드에 올려 놓고 구슬을 상체에서 분리하고 용액을 흡인시합니다. 그런 다음 전체 RPMI 매체의 1 밀리리터에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.비드 현탁액의 웰당 10마이크로리터를 각 억제제 처리 샘플, 4개의 DMSO 처리 샘플 및 8개의 처리되지 않은 샘플 중 4개에 추가합니다. 나머지 4개의 처리되지 않은 우물에 전체 RPMI의 마이크로리터 10개추가합니다. 마이크로 플레이트 궤도 셰이커를 사용하여 접시를 부드럽게 교반합니다.다음으로, 17~20시간 또는 하룻밤 동안 37도, 이산화탄소 환경 5%로 티모사이클을 배양합니다. 먼저 150밀리리터의 에탄올 트웬 용액을 장착한 자동 라미나르 플로우 플레이트 와셔를 프라임한 다음, 1%Tween 20으로 보충된 탈이온화된 물로, 마지막으로 FACS 워시 버퍼를 장착합니다. 플레이트 세탁기 시스템을 사용하여 인큐베이션의 끝에서, 9 회 세척 주기를 사용하여 FACS 세척 버퍼로 플레이트를 세척하십시오.각 세척은 라미나르 흐름에 의해 55 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 제거하여 우물에서 시약의 기하급수적 희석을 초래합니다. 표면 항원염색에, 먼저 1부단위의 안티CD-3, 안티CD-4, 안티CD-8 및 안티CD-69 항체를 FACS 세척 버퍼의 100단위 부피로 희석한다. 그런 다음 염색 항체 혼합물의 25 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다.마이크로 플레이트 궤도 셰이커를 사용하여 접시를 부드럽게 교반한 다음 접시를 얼음 위에 30 분 동안 둡니다. 세포를 고치려면 먼저 FACS 세척 버퍼 55마이크로리터로 플레이트를 세척하여 이전에 설명한 대로 9배의 세척 주기를 사용하십시오. 그런 다음 고정 불침투화 버퍼의 50 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.잘 섞어서 30분 동안 얼음 위에 접시를 배양합니다. 인큐베이션 후, 제공된 10X 스톡 의 25 밀리리터를 초순수 수의 225 밀리리터에 희석하여 1-X 파마를 준비하고 버퍼를 세척합니다. 플레이트 와셔를 1-X 버퍼로 프라임하고 이전에 설명한 대로 9배의 세척 주기를 사용하여 1-X 버퍼의 55 마이크로리터로 플레이트를 세척합니다.시작하려면, 1-X 파마의 2 밀리리터와 안티 카스파제 3 항체의 밀리리터 1밀리리터를 혼합하고 버퍼를 세척한다. 고정 된 세포에 혼합물의 우물 당 25 마이크로 리터를 추가합니다. 마이크로 플레이트 궤도 셰이커를 사용하여 접시를 부드럽게 교반합니다.접시를 얼음 위에 1시간 동안 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면 1-X 파마와 세척 버퍼로 워시 단계를 9번 반복합니다. 그런 다음 FACS 세척 버퍼 25 마이크로리터를 플레이트의 모든 우물에 추가합니다.솔루션을 혼합하기 위해 몇 번 위아래로 파이펫. 마지막으로 혼합 샘플을 마이크로티터 튜브로 옮기습니다. FACS 세척 버퍼로 튜브를 총 200 마이크로리터로 상향 하고 유동 세포 측정 분석을 진행합니다.반대로 CD-3, CD-28 자극에 이어, 카스파제-3 활성화및 TCR 다운규제의 증가는 처리되지 않은 및 DMSO 모의 처리 샘플 모두에서 관찰되었다. 또한, CD-69 발현의 증가는 자극된 두 샘플 모두에서 관찰되었다. 덱사메타손 처리된 견본은 독립적인 자멸 유도 효과 및 TCR 자극에 대하여 예상대로, CD-69 업 규제에 무관하게 caspase-3 활성화에 있는 증가를 보여주었습니다.T세포 활성화 현상의 선택적 손상은 caspase-3 활성화 및 CD-69 업 조절을 모두 억제하거나 CD-69 업 조절을 억제하는 상이한 억제제에 의해 나타났지만 caspase-3 활성화를 손상시키지 않았다. 또한 TCR 신호 경로의 관련 키나아제를 표적으로 하지 않은 억제제가 있었고, 따라서 CD-69 업규제 및 caspase-3 활성화를 모두 억제하지 않았다. 스타우로스포린의 화면 결과, 아포토시스 양성 제어, 예상대로 caspase-3 활성화의 높은 수준을 보여 주었다.그러나, 결과는 또한 CD-69 발현 의 단백질 키나아제 C 또는 유도된 자멸의 그것의 그것의 매개억제에 기인할 수 있는 CD-69 발현의 낮은 수준을 보여주었다. 상이한 분석 프로토콜의 비교는 활성 caspase-3, CD-69 및 TCR 염색음성 제어, 세포 사멸에 대한 양성 제어, 차량 제어 및 억제제 처리 샘플에 차이가 없음을 나타냈다. 사전 잠복 단계는 세포의 배양을 위한 소량 판의 사용을 용이하게 하기 위한 것입니다.표준 원심분리기 종속 프로토콜도 원고에 제공됩니다. 잠재적으로 흥미로운 억제제 또는 표적은 다른 세포 모형을 사용하여 또한 다른 종에서, pagopheral 마우스 림프구 또는 인간 적인 1 차 세포와 같은 다른 종에서 검증될 수 있습니다. 확인된 분자와 표적의 후속 특성화는 T 세포 생물학의 이해를 향상하고 면역 변조를 위한 가능한 표적에 확장하는 것을 도울 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...