Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Singapore helsedepartementets National Medical Research Council, NMRC CBRG15may017 og Singapore departementet for utdanning, 2014-T2-1-136 (til N.R.J.G.).

I denne studien, ble 6 - til 8-uke-gamle mannlige og kvinnelige C57Bl/6 mus brukt. Mus ble avlet i dyr anlegget ved National University of Singapore (Singapore). National University of Singapore institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC) godkjent alle dyr eksperimentering.
1. forberedelse av Thymocyte suspensjon
<ol><li>Euthanize mus i en CO2 kammer.</li>
	<li>Utføre fremgangsmåten i vev-kultur hette å unngå enhver kontaminering av i cellekulturer. Sikrer musa carcass til disseksjon bord, med pins, og spray musen med 70% etanol.</li>
	<li>Bruke et par saks, lage en loddrett snitt på ventral side, fra magen mot kjeven. Gjøre flere snitt langs hver av bakbena. Strekk huden for å avdekke ribbe buret og feste det.</li>
	<li>Kutt membranen og begge sider av ribbe buret fra den bakre enden med en saks. Løft ribbe buret og feste det til utsett thymus. Separat bindevev knyttet til thymus og ekstra thymus med en buet tang.</li>
	<li>Plass Brisselen i et godt av en 6-vel plate inneholder 5 mL av komplett RPMI medier. Merk: Vurdere å legge 10% kull-strippet fosterets bovin serum (FBS) til media for å forbedre thymocyte levedyktigheten hvis en lang ventetid er ventet mellom dissection og stimulering analysen.</li>
	<li>Forsiktig mash thymus, med den butte enden av en sprøyte, og cellene passere en 70 µM celle sil. Alternativt, for å samle thymocytes i en sunnere tilstand, vurdere å bruke to par tang å presse thymus og samle thymocytes at flyten av thymic epitel.</li>
	<li>Gå til celle teller, bruker en hemocytometer eller en automatisert celle teller instrument.</li>
</ol>2. Serine Kinase hemmere til Nontoxic konsentrasjoner
Merk: Denne delen fokuserer på å forberede hemmere for bruk i T-celle aktiveringsskjermene. Hemmere brukes på høye konsentrasjoner kan forårsake celledød, som er en presentasjon av T-celle aktiveringsskjermene. Serien av fortynninger av hemmere mål å bestemme endelige konsentrasjonen av de personlige hemmere som ikke bør få apoptose uavhengig av TCR stimulering. Biblioteket av kinase hemmere brukt i denne studien ble kjøpt fra en ekstern leverandør. Listen over hemmere er inkludert i Tabellen for materiale.
<ol><li>
Utarbeidelse av plater kinase hemmere i lave konsentrasjoner
	<ol>
<li>For å forberede en tallerken med hemmere på 1 mM, legge til 10 µL av hemmere 90 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) for alle hemmere. Merk: Hemmere fra små molekyl biblioteket brukt i denne studien kommer i en lager konsentrasjon av 10 mM. Hvis hemmere i en pellet form, fremgangsmåten anbefalte rekonstituering fra leverandører. Hvis hemmere ikke finnes på 10 mM, forberede hemmer platene i alternative riktig konsentrasjoner i stedet, og Forbered separat føljetong fortynninger av hemmere med en egnet fortynningsfaktoren. Advarsel: I tilfeller av giftige hemmere, følg produsentens instruksjoner for sikker håndtering og avhending.</li>
		<li>For å forberede en tallerken med hemmere på 0,1 mM, legge til 10 µL av hemmere fra platen av 1 mM hemmere 90 µL av DMSO.</li>
		<li>For å forberede en tallerken med hemmere på 0,01 mM, legge til 10 µL av hemmere fra platen av 0,1 mM hemmere 90 µL av DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandling av thymocytes med kinase hemmere
	<ol>
<li>Klargjør en thymocyte suspensjon som angitt i del 1.</li>
		<li>Fortynne thymocytes i fullstendig RPMI å få en thymocyte suspensjon av 5 x 106 celler/mL.</li>
		<li>Legge til 200 µL av thymocyte suspensjon i alle brønnene av en 96-brønns plate, ved hjelp av en flerkanals pipette.</li>
		<li>I hver brønn, legge 2 µL av hemmere fra tilsvarende godt av platen som inneholder 1 mM hemmere (siste konsentrasjonen av hemmere er 10 µM).</li>
		<li>I samme plate, Forbered fire brønner ubehandlet kontroller, fire brønner 5 µM deksametason-behandlet positiv kontroller og fire brønner kjøretøy-behandlet negative kontroller, ved å legge til 2 µL av DMSO.</li>
		<li>Inkuber thymocytes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller over natten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fastsettelse av egnet konsentrasjoner av personlige hemmere
	<ol>
<li>Spinn platen av thymocytes på 300 x g og 4 ° C, 5 min. Resuspend cellene i 250 µL av FACS vaskebuffer.</li>
		<li>Kjør en flyt cytometric analyse av prøvene og analysere resultatene med flyt cytometri analyseprogram.</li>
		<li>Angi prosenten av live cellene basert på FSC-SSC gating. Gating strategien er vist i figur 1B.</li>
		<li>Beregne gjennomsnittlig prosentandelen av live cellene basert på DMSO-behandlet kontrollene, som blir normalisert på 100%. Angi en vilkårlig vindu av akseptabel celledød (e.g.,20%). Hemmere som resulterte i prosent av levende celler under dette vinduet (i.e., under 80% av DMSO-behandlet kontrollene) er å bli testet igjen i lave konsentrasjoner.</li>
		<li>For hemmere som ikke bestod levedyktighet kriteriene i trinn 2.3.4, gjentar du trinnene fra trinn 2.2.1 - 2.3.4, men bruke platen av hemmere på 0,1 mM for trinn 2.2.4 i stedet for platen inneholder 1 mM-hemmere. Siste konsentrasjonen av hemmere her er 1 µM.</li>
		<li>For det hemmere som fortsatt produsere høye nivåer av celledød på 1 µM, teste hemmere 0,1 µM. Gjenta trinn 2.2.1 - 2.3.4, men bruke platen av hemmere 0,01 mM i trinn 2.2.4. Siste konsentrasjonen av hemmere her er 0,1 µM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Forberedelse av en lager tallerken kinase hemmere
	<ol>
<li>For hemmere som skal brukes ved 10 µM, legge til 10 µL av 10 mM hemmere 10 µL av DMSO.</li>
		<li>For hemmere brukes på 1 µM, legge til 1 µL av 10 mM hemmere 19 µL av DMSO.</li>
		<li>For hemmere brukes på 0,1 µM, legge til 1 µL av 10 mM hemmere 199 µL av DMSO (figur 1 c). Merk: Forberedt lager platen av hemmere er 500 x konsentrasjonen av den tiltenkte siste konsentrasjonen når lagt til av thymocyte suspensjon. Lager platen av hemmere kan tilberedes i PCR strimler eller i 96-brønnen plater.</li>
		<li>Lager platen av kinase hemmere kan brukes på thymocytes for screening i en vanlig sentrifugering-avhengige system (del 3, se figur 1A, fremgangsmåte 1 og 2) eller i et alternativt sentrifugering uavhengig system (seksjon 4, se Figur 1A, metode 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kinase Inhibitor biblioteket Screening (vanlig sentrifuge-baserte analysen)
<ol><li>
Behandling av thymocytes med kinase hemmere
	<ol>
<li>Klargjør en thymocyte suspensjon som angitt i del 1.</li>
		<li>Fortynne thymocytes i fullstendig RPMI å få en thymocyte suspensjon av 5 x 106 celler/mL.</li>
		<li>Legge til 200 µL av thymocytes hver brønn av en 96-brønns plate, ved hjelp av en flerkanals pipette. Plass platen på isen.</li>
		<li>Legg til 0,5 µL av hemmere av 96-brønns platen fra tilsvarende brønnene av hemmer lager plate forberedt i delen 2.4.</li>
		<li>Forbered åtte brønner ubehandlet kontroller. Forberede fire brønner kjøretøy-behandlet kontroller ved å legge til 0,5 µL av DMSO. Forberede fire brønner 5 µM deksametason-behandlet kontroller (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulering av thymocytes bruker anti-CD3/CD28 perler
	<ol>
<li>1 mL av perler og vaskes perler med 2 mL PBS. Separate perler med en magnetisk stå og Sug opp løsningen. Resuspend perler i 5 mL av fullstendig RPMI. Merk: Forholdet mellom perler celler er 1 til 2,5. Justere perler å ta, avhengig av antall brønner å stimulere og antall thymocytes brukes.</li>
		<li>Legge til 50 µL av perler i hvert inhibitor-behandlet utvalg, fire DMSO-behandlet prøvene og fire av de åtte ubehandlede prøvene. Legge til 50 µL av komplett RPMI gjenværende fire ubehandlet brønnene. Figur 2 viser det generelle oppsettet av platen.</li>
		<li>Bland innholdet av benytter en flerkanals pipette.</li>
		<li>Inkuber thymocytes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller over natten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Farging av overflaten antigener
	<ol>
<li>Forbered et antistoff flekker blanding som inneholder anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD69 antistoffer. Fortynne antistoffer i FACS vaskebuffer (PBS med 0,5% bovin serum albumin [BSA]) i forholdet 1:200 (v/v). Merk: Vurdere optimalisere antistoff titers brukes til farging, stedet for å bruke faste antistoff fortynninger, å minimere variasjon i flekker over forskjellige eksperimenter og å forbedre signal-til-støy-forhold.</li>
		<li>Spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.</li>
		<li>Bla platen for å forkaste løsningen.</li>
		<li>På dette punktet, protokollen kan følge vanlig sentrifuge-avhengige protokollen (fortsette å gå 3.3.5, se figur 1A, metoden 1) eller alternativ sentrifugering uavhengig protokollen (fortsette å gå 4.4.4, se figur 1A, metoden 2).</li>
		<li>Resuspend cellene i 75 µL av flekker antistoff blandingen i trinn 3.3.1.</li>
		<li>Bland eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge dem på is 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fiksering av celler
	<ol>
<li>Vask brønner med 200 µL av FACS vaskebuffer og spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.</li>
		<li>Bla platen for å forkaste løsningen.</li>
		<li>Legge til fiksering/permeabilization buffer (kommer med aktiv caspase-3 apoptose kit, samme med 10 x perm/vaskebuffer nevnt i trinn 3.5.1 og anti-caspase-3 antistoffer i trinn 3.5.2) på 200 µL per brønn.</li>
		<li>Ruge på is 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intracellulær flekker for aktive caspase 3
	<ol>
<li>Forberede 1 x perm/vaskebuffer fortynne 5 mL 10 x perm/vaskebuffer i 45 mL ultrapure vann.</li>
		<li>Forberede intracellulær aktive caspase flekken ved å legge til 1,3 mL av anti-caspase-3 antistoff 6,5 mL 1 x perm/vaskebuffer. Antistoff perm/vaske bufferen er 1:5.</li>
		<li>Spinn platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min. bla platen forkaste løsningen. Vaske platen med 200 µL av 1 x perm/vaskebuffer.</li>
		<li>Gjenta trinn 3.5.3.</li>
		<li>Spinn platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min. bla platen forkaste løsningen. Legge til 75 µL av intracellulær caspase flekk i trinn 3.5.2 alle brønner.</li>
		<li>Bland eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge på is 1t.</li>
		<li>Vask prøvene med 200 µL av 1 x perm/vaskebuffer og spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.</li>
		<li>Bla platen for å forkaste løsningen. Vaske platen med 200 µL av 1 x perm/vaskebuffer. Spinne platen på 300 x g og 4 ° C, 5 min.</li>
		<li>Bla platen for å forkaste løsningen og resuspend prøvene i 200 µL av FACS vaskebuffer.</li>
		<li>Kjør en flyt cytometric analyse av prøvene og analysere resultatene med FACS analyseprogram.</li>
		<li>Bruker en CD4 versus CD8 plot, gate på befolkningen i DP thymocytes med en positiv uttrykk av både CD4 og CD8 (figur 2, nederste halvdel). I DP thymocyte gate, Bestem prosentandelen av celler med aktivert caspase-3, med unstimulated prøven som negativ kontroll og deksametason som positive kontroll. For analyse av uttrykk for CD69 i DP thymocyte porten, bruke unstimulated prøven som kontrollen negative og stimulert prøven som positive kontrollen. Merk: Når gating på DP thymocytes, bekrefte at befolkningen i DP thymocytes Portes riktig for individuelle prøver. Stimulert celler downregulate overflate coreceptors og utilsiktede utelukkelse av hendelser kan oppstå hvis en stram DP gate brukes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. kinase Inhibitor biblioteket Screening (sentrifuge-uavhengig analysen)
<ol><li>
Behandling av thymocytes med kinase hemmere
	<ol>
<li>Klargjør en thymocyte suspensjon som angitt i del 1.</li>
		<li>Fortynne thymocytes i fullstendig RPMI å få en thymocyte suspensjon av 25 x 106 celler/mL.</li>
		<li>Legge til 40 µL av thymocytes hver brønn av en små volumer plate, ved hjelp av en flerkanals pipette. Plass platen på isen.</li>
		<li>Fortynne hemmere fra lager plate, DMSO og deksametason i fullstendig RPMI i fire deler av komplett RPMI forholdet til en del av hemmer/DMSO/deksametason (fortynningsfaktoren 5). Merk: Som volumene i denne små volumer platen er 5 ganger mindre enn i konvensjonelle metoden, hemmere og kontroll reagensene er utvannet femdoblet før du legger dem til thymocytes i platen.</li>
		<li>Legge til 0,5 µL av hemmere av 96-brønns platen fra tilsvarende brønnene av hemmer plate i trinn 4.1.4.</li>
		<li>Forbered åtte brønner ubehandlet kontroller. Forberede fire brønner kjøretøy-behandlet kontroller ved å legge til 0,5 µL av DMSO forberedt i trinn 4.1.4. Forberede fire brønner 5 µM deksametason-behandlet kontroller, bruker utvannet deksametason forberedt i trinn 4.1.4 (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulering av thymocytes bruker anti-CD3/CD28 perler
	<ol>
<li>Kontroller at perlene er jevnt resuspended. 1 mL av perler og vaskes dem med 2 mL PBS. Separate perler med en magnetisk stå og Sug opp løsningen. Resuspend perler i 1 mL av fullstendig RPMI. Merk: Forholdet mellom perler celler er 1 til 2,5. Justere perler, avhengig av antall brønner å stimulere og antall thymocytes brukes.</li>
		<li>Legge til 10 µL av perle suspensjon hver inhibitor-behandlet prøve, fire DMSO-behandlet prøvene og fire av de åtte ubehandlede prøvene. Legge til 10 µL av komplett RPMI gjenværende fire ubehandlet brønnene. Figur 2 viser oppsettet generelle plate. NOTE Det siste bindet av brønnene er 50 µL, som er den maksimale kapasiteten av brønnene. Det er viktig å være forsiktig og holde platene oppreist, å unngå kryss-og søl.</li>
		<li>Hvis du vil blande, agitere platen ved hjelp av en microplate orbital shaker. Alternativt, bland innholdet av benytter en flerkanals pipette.</li>
		<li>Inkuber thymocytes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller over natten) med en anti-fordampning lokk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oppsett av platen vaskemaskinen Merk: Instruksjonene for å sette opp platen vaskemaskinen leveres av produsenten. Punktene er nevnt kort nedenfor. Omtrent er 150 mL løsning nødvendig for hvert grunning trinn.<ol>
<li>Prime vaskesystemet med 70% etanol som inneholder 1% mellom 20.</li>
		<li>Prime vaskesystemet med deionisert vann som inneholder 1% mellom 20.</li>
		<li>Prime vaskesystemet med FACS vaskebuffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Farging av overflaten antigener
	<ol>
<li>Forbered et antistoff flekker blanding som inneholder anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD69 antistoffer. Fortynne antistoffer i FACS vaskebuffer i forholdet 1: 100 (v/v).</li>
		<li>Vaske platen 9 x, bruker 55 µL av FACS vaskebuffer per vask, bruker den automatiserte laminær strømning vaske system. Merk: På slutten av vasker, vil det være 25 µL av gjenværende volum i hver brønn.</li>
		<li>Resuspend cellene i 25 µL av flekker antistoff blandingen i trinn 4.4.1.</li>
		<li>Hvis utvalgene overføres fra en 96-brønns plate (fra trinn 3.3.4), resuspend cellene i 50 µL av antistoff blandingen i trinn 3.3.1 og overføre prøvene av små volumer platen. Dette trinnet tilsvarer metode nummer 2, som vist i figur 1A.</li>
		<li>Agitere platen med en microplate orbital shaker for å blande, blande eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge på is 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fiksering av celler
	<ol>
<li>Vaske platen 9 x, bruker 55 µL av FACS vaskebuffer per vask, bruker den automatiserte laminær strømning vaske system.</li>
		<li>Legge til fiksering/permeabilization buffer (kommer med aktiv caspase-3 apoptose kit, samme med 10 x perm/vaskebuffer nevnt i trinn 4.6.1 og anti-caspase-3 antistoffer i trinn 4.6.2) på 50 µL per brønn.</li>
		<li>Ruge på is 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intracellulær flekker for aktive caspase 3
	<ol>
<li>Forberede 1 x perm/vaskebuffer fortynne 25 mL 10 x perm/vaskebuffer i 225 mL ultrapure vann.</li>
		<li>Forberede intracellulær aktive caspase flekken ved å legge til 1 mL av anti-caspase-3 antistoff 2 mL 1 x perm/vaskebuffer. Antistoff perm/vaske bufferen er 1:2.</li>
		<li>Prime vaskesystemet med 1 x perm/vaskebuffer.</li>
		<li>Vaske platen 9 x med 1 x perm/vaskebuffer, på 55 µL for hver vask.</li>
		<li>Legg til 25 µL intracellulær caspase flekken i trinn 4.6.2 alle brønner.</li>
		<li>Agitere platen med en microplate orbital shaker for å blande, blande eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge på is 1t.</li>
		<li>Vaske platen 9 x med 1 x perm/vaskebuffer, på 55 µL for hver vask.</li>
		<li>Legg til 25 µL av FACS vaskebuffer alle brønnene.</li>
		<li>Overføre prøvene å være ferdig innen rør etter tilstrekkelig blande via pipettering.</li>
		<li>Legge til en annen 50 µL av FACS vaskebuffer tom brønnene og gjentar trinn 4.6.9.</li>
		<li>Gjenta 4.6.9 og 4.6.10 2 x til 200 µL av prøvene er samlet i være ferdig innen rørene. Merk: Hensikten med fremgangsmåtene i trinn 4.6.10 og 4.6.11 er å sikre en maks gjenoppretting av cellene fra små volumer platen. Hvis cellen tallene er ikke et problem, etter trinn 4.6.10, rør bare fylle opp den være ferdig innen til 200 µL med FACS vaskebuffer.</li>
		<li>Kjør en flyt cytometric analyse av prøvene og analysere resultatene med en FACS analyseprogram, som steg 3.5.11. Caspase-3 aktivisering og CD69 uttrykk er analysert i porten som inneholder CD4+CD8+DP thymocytes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development.">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li><li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers.">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).</li><li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&amp;#34;self&amp;#34;+in+T-cell+activation.">A role for &amp;#34;self&amp;#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li><li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation.">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li><li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC.">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling.">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development.">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling.">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development.">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li><li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+human+autoimmunity:+current+practice+and+future+prospects.">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li><li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity.">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li><li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate.">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li><li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li><li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation.">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).</li><li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules.">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants.">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li><li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis.">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li><li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry.">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li><li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase,+2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+(LY294002).">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors.">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li><li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine,+K-252+and+UCN-01:+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases.">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li><li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2,3-Bisarylmaleimides.">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li><li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1.">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li><li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A.">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li><li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel compounds. , (2003).</li><li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase.">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li><li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway.">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors.">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).</li><li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts.">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li><li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+neonatal+thymus:+evidence+for+a+transient+thymic+involution.">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li><li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus.">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li><li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and/or+IFN-gamma-producing+CD4++and+CD8++T+cells.">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li><li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+ADMET.">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li></ol>

Forfatteren Chyan Ying Ke er ansatt i Curiox Biosystems, som produserer DA celle vaskemaskin og DA-celle platene brukes i denne artikkelen.

Screening strategien foreslått her vurderer muligheten for små molekyl hemmere å undertrykke den apoptotisk effekten i thymocytes etter stimulering, i tillegg til mer konvensjonelle markører T-celle aktivering-CD69 oppregulering og TCR downregulation . Ekstra markører kan også bli inkludert aktivere analyse av ulike thymocyte delsett32. Et interessant aspekt til gjeldende analysen ligger i det faktum at hemmere som hindrer TCR signalering ville også dempe induksjon av apoptose, ytterligere utheving æren av TCR-uavhengig effekter hemmere kan ha på indusere celledød. Videre tillater en flyt-cytometri-baserte analysen bruk av flere readouts som tydelig aktivisering markører, som kunne rapportere virkningene av hemmere om personlige greiner TCR signalnettverk. I tilfellet her, var det hemmere som viste en differensiell hemming av caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering. Fordi noen forbindelser kan påvirke husarbeid funksjoner som proteinsyntese eller vesicula handel, er det ikke overraskende å observere effekter på oppregulering av de novo syntetisert markører (f.eks CD69) men ikke på posttranslational endringer (f.eks proteolytisk aktivering av caspase-3).
Som analysen presentert her måler apoptose som en presentasjon, er det viktig at de latente toksiske effektene av hemmere ikke skjule resultatene. For eksempel skjermen vi ikke utvanne staurosporine utover 1 nM, til tross for det fortsatt er giftig for cellene på at konsentrasjonen. Representant resultatene er enig med staurosporine å være en promiskuøse kinase inhibitor og en induser apoptose33. Uten en tilstrekkelig fortynning av forbindelser testet til nontoxic konsentrasjoner, er det mulig å overse mulige treff.
Screening strategien finnesher ville være vanskelig å bruke mennesker på grunn av komplikasjoner knyttet til å skaffe tilstrekkelig antall thymocytes for høy gjennomstrømming screening. Det er imidlertid mulig å få menneskelige thymus prøver fra pediatric cardiac biopsier34,35 eller fostre36,37. Likevel, som TCR signalnettverk trasé og amino acid sekvenser signalnettverk proteiner er i stor grad konservert mellom mus og mennesker, thymocyte analysen gir en nyttig foreløpige screening strategi, og noen resultater oppnådd med denne analysen ved hjelp av musen thymocytes kan deretter bekreftes i primære menneskelige lymfocytter.
En begrensning av vanlig sentrifugering-avhengige protokollen gjelder utsiktene til celle tap, som kan tilskrives må natur prosessen, som omfatter trinn som cellen permeabilization og sentrifugering. Hver sentrifugering og rørets trinn uunngåelig resulterer i tap av celler. Mens slike tap ikke kan være kritisk for studier som involverer noen eksempler, medføre det problemer når den brukes i høyere gjennomstrømming screening, spesielt som analysen format utvikler seg fra 96 til 384 - til 1536-brønnen. En måte å omgå dette problemet er gjennom bruk av celle-permeable fluorescerende caspase sensorer38 at påvisning av caspase aktivisering og unngå komplikasjoner av cellen permeabilization og flere vasker5. Alternativt, ansette en uavhengig av sentrifugering metode for vaske celler av laminær strømning er også mulig for å minimere tap av cellen. Med en automatisert plate vaske stasjon i forbindelse med en vegg-mindre plate, er celler vasket av laminær strømning uten bruk av en sentrifuge. Eksponentiell fortynning av reagenser tillater det grundig og effektiv skylling av celler i mindre enn 3 minutter, som representerer en tilsvarende fortynning to runder med sentrifugal vask. Uten eksterne stress på grunn av sentrifugering, cellene mer levedyktig og celle tap er minimert.
Vi utforsket også bruke automatiserte plate vaske stasjon etter dyrking thymocytes i 96-brønnen U bunn plater og også dyrking av celler i veggen mindre plater kompatible med automatiserte plate vaske stasjon. Dyrking av celler i veggen mindre platene aktivert eliminering av alle sentrifugering skritt og minimert celle tap ved å eliminere behovet for eksempel overføring over plater. Vanligvis er tre ulike protokollene sammenlignbare både stimulering effektivitet og flekker. Automatisert vask stasjonen gir fordelen med automatisering, hastighet og effektivitet, som gjør det lettere for høyere gjennomstrømming analyse. Videre med økt automatisering, vask fremgangsmåten kan utføres raskere, og det er en større konsistens mellom eksperimenter eller forskere. Men vask stasjonen har visse ulemper: store mengder vaske buffere kreves for skive grunning (150 mL per endringen, som 50 mL brukes for vask); ekstra forsiktighet er nødvendig når du håndterer platen for å unngå noen krysskontaminering av brønnene på grunn av begrenset partisjonering mellom brønnene av små volumer plate; gjenværende buffer på 25 µL i brønnene etter vask nødvendiggjør bruk av reagenser forberedt høyere enn 1 x konsentrasjonen. For å løse problemene med residualvolum og begrenset kapasitet på platen, kan ekstrautstyr utvide inkubasjon volumet fra 70 µL 150 µL legges, og tilrettelegging for bruk av konvensjonelle protokoller. Mens automatiserte plate håndteringssystemer er tilgjengelig, har de en viktig innflytelse i forhold til laminær vaskesystemet, som er en liten enhet for ~ 1 kubikk fot (~0.028 m3). Videre er integrering av sentrifugering i automatiserte plate håndteringssystemer utfordrende, begrense deres bruk i cellen vask. Det finnes ingen annen sentrifuge-uavhengig celle vaske instrumenter tilgjengelig, så vidt vi vet.
Screening strategien presenteres her er kjøpedyktig identifisere små molekyler og deres påståtte målet kinaser, som påvirker TCR signalisering og T-celle aktivering. Biblioteket her omfatter hovedsakelig små molekyl hemmere av kinaser og kunne generere en rekke muligheter interessant treff. Protokollen kan også brukes gjerne til hemmer biblioteker til andre enzym klasser eller andre typer små molekyler og biblioteker av andre stoffer (f.eks, ulike makromolekyler). Protokollen kan også brukes til skjermen andre celletyper, for eksempel perifere T-lymfocytter eller udødeliggjort celler, inkludert de uttrykker transgene TCRs eller bærer reporter systemer. Identifisere og karakterisere nye meglere av T-celle signalisering kan forbedre vår kunnskap om signalveien og også hjelp i utviklingen av målrettet terapi i immune sykdommer13,14,15, 16., denne studien legger utvalg av tilgjengelige alternativer for påvisning av meglere av T-celle signalnettverk via høy gjennomstrømming screening analyser.

T-celler er en avstamning av lymfocytter spiller en sentral rolle i vedlikehold av adaptiv immunitet. De uttrykke TCR, slik at de kan anerkjenne deres ligander, komplekser som består av et store histocompatibility kompleks molekyl (MHC) med et bundet peptid, som finnes på overflater av antigen presentere celler (APCs). Følge av TCR signalveien gjennom TCR/MHC samspillet er avgjørende for T-celle aktivering og utvikling1.
I T-celle development overføre bein margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller (HSCs) mot thymus, der de gjennomgå differensiering og gå gjennom stadier av T celle avstamning progresjon2. Dobbel-positive (DP) thymocytes, uttrykke både CD4 og CD8 coreceptors, engasjere seg med selv-peptid/MHC på APCs. Thymocytes med en moderat affinitet til deres selv-peptid/MHC ligander moden til å bli enkelt-positive (SP) CD4 eller CD8 thymocytes, en prosess kalt som positiv valg. Derimot gjennomgår thymocytes mottar overdreven TCR stimulering gjennom selv-peptid/MHCs apoptose via negativ utvalg3,4. Denne prosessen med stimulering-indusert, caspase-avhengige apoptose kan være etterlignet i vitro ved å stimulere thymocytes, for eksempel med anti-CD3/28 antistoff perler5. Modne T-celler som passerer utvelgelsesprosessen er aktivert av ikke-selv-peptid/MHC ligander fra APCs i periferien. Self-peptid/MHCs er fortsatt relevant for eksterne T-celler, i sammenheng med tonic Signaliser for overlevelse og homøostatisk spredning, differensiering av hjelper T-celler og styrking av T-celle svar til ikke-selv-peptid/MHCs gjennom coagonism6,7,8,9. Høy affinitet TCR binding til peptid/MHC ligand aktiverer flere nedstrøms signalveier, som involverer mange signalnettverk molekyler utgjør en kompleks TCR signalering nettverk10. TCR signalveier har vært studert i flere tiår, og ennå oppdagelsen av nye meglere av veien viser ingen tegn til avta11,12. Modulering av TCR signalveier har klinisk relevans og kan omfatte potentiating T-celle svar for immunterapeutisk programmer eller hemming av T-celle svar for kontroll av autoimmunitet13. Strategier for modulering av T-celle svar avhenger hovedsakelig avbrudd i kinase eller fosfatase aktivitet14,15,16.
Vi beskriver en anvendelse av en flyt-cytometri-baserte analysen for screening av små kjemiske forbindelser til å modulere TCR signalisering og T-celle aktivering17til. Analysen er avhengig av fenomenet thymocytes aktivere apoptose veien når de utsettes for sterke TCR signaler. Analysen er tilstrekkelig sensitive til å identifisere endringer i stimulering styrke; rugende thymocytes uttrykke transgene TCR med peptid/MHC tetramers med økende affinitet resulterte i en tilsvarende økning i caspase aktivisering-brukt som et mål av apoptotisk svar5. For skjermen, vi brukte et bibliotek av kinase hemmere og vurdert deres evne til å modulere thymocyte svaret å sterk TCR signaler.
Flere flyt-cytometri-basert eller fluorescens-reporter-baserte strategier har blitt beskrevet for høy gjennomstrømming screening av et utvalg av perifer aktivisering fenotyper i ulike T-celle delsett. Slike strategiene omfatter bruk av genetisk fluorescerende journalister å vurdere timing og omfanget av T-celle aktivering18, bruk av omfatter degranulering som en presentasjon av cytotoksiske T-celle aktivitet19,20, og analyse av den fosforylering av ulike proteiner involvert i mobilnettet signalering21.
Screening analysen presenteres her er vellykket identifisere forbindelser som hemmer kanoniske molekyler av TCR signalering veien, så vel som potensielle, romanen forbindelser med hemmende effekt på TCR signalering. For eksempel identifisert vi hemmere av GSK3β og Hsp90 som nye forbindelser påvirker T-celle svar17. Analysen er kjøpedyktig skille hemmere som forstyrrer signaltransduksjon, på grunn av en reduksjon i apoptotisk svaret, fra TCR-uavhengig virkningene av hemmere på mobilnettet toksisitet. I tillegg til induksjon av apoptose måle vi også CD69 oppregulering og TCR downregulation som markører for aktivisering. Som TCR signalering nettverk er komplisert, kan bruken av flere readouts øke sjansene for å oppdage molekyler med spesifikke effekter på en enkelt bane. Her introduserer vi også bruk av en uavhengig av sentrifugering protokoll som en høy gjennomstrømming alternativ til de originale protokollen under fargingen cellene i forberedelse til flyt cytometric analysen. Analysen beskrevet i dette dokumentet bruker en liten sammensatt bibliotek med kinase hemmere, men i prinsippet kan det brukes for høyere gjennomstrømming screening. Biblioteket av valg kan også inkludere en rekke hemmere eller andre molekyler.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

T-celle reseptor (TCR) signalering pathway består av en rekke meglere som overfører signaler ved aktivering av TCR. Forskjellige strategier har vært foreslått og implementert for identifisering av nye meglere TCR signalnettverk, som ville forbedre forståelsen av T-celle prosesser, inkludert aktivering og thymic utvalg. Vi beskriver en screening analysen som gjør identifisering av molekyler som påvirker TCR signalering basert på aktivering av utvikle thymocytes. Sterk TCR signaler føre utvikle thymocytes aktivere apoptotisk maskiner i en prosess kjent som negative utvalg. Gjennom anvendelse av kinase hemmere er de med mål som påvirker TCR signalering kan overstyre prosessen med negative utvalg. Metoden beskrevet i dette dokumentet kan brukes til å identifisere hemmere av kanoniske kinaser med etablerte roller i TCR signalveier og hemmere av nye kinaser ennå å bli etablert i TCR signalveier. Screening strategien her kan brukes til skjermer for høyere gjennomstrømming for identifikasjon av romanen druggable mål i TCR signalering.

Tilnærming til screening analysen summeres i figur 1A. Kinase hemmere ble først vist for deres latente effekter på thymocyte levedyktighet. Som en positiv kontroll for apoptose, ble deksametason brukt som en proapoptotic agent. Gating for levende celle befolkningen var bestemt basert på ubehandlet negative kontrollene og deksametason-behandlet positiv kontrollene (figur 1B). Hemmere ble først testet på 10 µM på thymocytes, og prosentandelen av levedyktige cellers ble målt etter rugende 18 h. En 20%-vinduet for celledød ble valgt slik at forbindelsene som forårsaket en større enn 20% tap av celler i levende celle porten, sammenlignet med DMSO-behandlet utvalgene, ble testet i lave konsentrasjoner (figur 1B). Representant FACS tomter valgte inhibitor-behandlet prøver vises å illustrere levedyktighet analysen. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), en PI3K hemmer22, ikke sterkt økte celledød på 10 µM og inhibitor ble brukt på 10 µM for de påfølgende analyser. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), en dobbel hemmer PI3Kα/mTOR23, indusert høye nivåer av celledød 10 µM og på 1 µM men ikke på 0,1 µM og 0,1 µM ble identifisert som passer konsentrasjonen for programmet i nedstrøms analyser. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), en pan-protein kinase C hemmer med en etablerte evne til å indusere apoptose24, indusert betydelig celledød i alle konsentrasjoner testet, selv på 0,1 µM. Det ble brukt i påfølgende analyser på 0,1 µM som en mer positiv kontroll.
Siste konsentrasjonen av hemmere ble valgt basert på de høyeste konsentrasjonene der de ikke forsterke celledød med mer enn 20% av DMSO-behandlet prøvene. Med de siste konsentrasjonene av hemmere bestemt, var en lager tallerken med hemmere forberedt slik at alle hemmere var 500 ganger konsentrasjonen når brukt på cellene. Figur 1 c illustrerer plate oppsettet av lager plate, med de siste konsentrasjonene av hemmere. I alternativ protokollen for rugende cellene direkte i små volumer platene for laminær strømning vaske analysen, nødvendiggjort bruk av små volumer en ytterligere fortynning av hemmere. For å sikre at DMSO innholdet av kulturer etter hemmer tillegg ikke ville være for høyt for cellene, hemmere ble ytterligere fortynnet i fullstendig RPMI, webserverantallet fortynning av 5, slik at de var 100 ganger tiltenkte konsentrasjonen når på den celler.
De hemmere, utvannet til nontoxic konsentrasjoner ble brukt i analysen for TCR-stimulering-indusert apoptose i thymocytes5,17. Stimulering ble gjennomført med anti-CD3/CD28 perler på 18 h, og cellene var senere farget for caspase-3 aktivisering i CD4+ og CD8+ DP thymocyte befolkningen (figur 2). En økning i caspase-3 aktivisering og CD69 uttrykk, og også en TCR downregulation, ble observert i både den anti-CD3/CD28-stimulert og DMSO uekte-behandlet anti-CD3/28-stimulert prøvene, sammenlignet med de nonstimulated prøvene. Deksametason-behandlet prøvene viste en økning i caspase-3 aktivisering uavhengig av CD69 oppregulering, som forventes av apoptose-inducing effekten er uavhengig av TCR stimulering.
Figur 3A oppsummerer resultatene av biblioteket screening analysen for valgte hemmere. Både caspase-3 aktivisering og CD69 kan brukes til å identifisere potensielle hemmere av interesse på grunn av undertrykkelse av uttrykk. Som forventet, dukket hemmere av kanoniske meglere TCR signalnettverk opp som positive treff på skjermbildene. Slike hemmere, utstilte varierende hemmende styrke, inkludert bredspektret hemmere at målet flere kinaser og, mer spesifikt hemmere. Noen hemmere kunne undertrykke både caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering (figur 3B, øverste rad, venstre panel). En slik hemmer er bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), som hemmer alle protein kinase C isoformene, i tillegg til protein kinase A og PDK125,26,27. En annen hemmer i denne kategorien er CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), en foreslått hemmer IKK228.
Det var forbindelser som hemmet CD69 oppregulering men ikke svekke caspase-3 Aktivisering (figur 3B, øverste rad, rett paneler). CAY10626, en inhibitor av PI3Kα og mTOR23, og U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) deg selv thio] methylene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), en MEK hemmer29, var noen av de identifiserte hemmere. Resultatene viser at ulike hemmere målretting ulike kinaser fra forgreninger av TCR signalveien, særlig de målretting sent kinaser, kan resultere i selektiv svekkelse av T-celle aktivering fenomener.
Det var også hemmere som ikke undertrykke både CD69 oppregulering og caspase-3 Aktivisering (figur 3B, nederste, venstre panel). Paklitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - hydroxy-benzenepropanoic syre, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), en disruptor microtubule dynamics30og necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), en inhibitor av RIP1 kinase31, er to hemmere kjennemerke for å være i denne kategorien. I slike tilfeller der CD69 oppregulering og caspase-3 aktivisering ikke var svekket, dette kan være på grunn av hemmere ikke rettet mot en relevant kinase for TCR signalveien.
Som nevnt tidligere, ble staurosporine brukt i skjermbildene, i en konsentrasjon som fortsatt indusert apoptose i thymocytes. Som forventet, viste staurosporine-behandlet prøven høye nivåer av caspase-3 Aktivisering (figur 3B, nederste, høyre kolonne). De lave nivåene av CD69 uttrykk kan tilskrives staurosporine-mediert hemming av PKC, som bisindolylmaleimide II, en pan-PKC inhibitor, undertrykkes også uttrykk for CD69. Eventuelt indusert staurosporine apoptose i cellene før de kunne upregulate CD69 uttrykket.
For å øke gjennomstrømming og automatisering av protokollen, ble parallelle protokoller som omfattet bruk av en automatisert plate vaske system via laminær strømning utarbeidet. To separate protokoller med automatiserte plate vask enheten var trialed og sammenlignet med konvensjonelle metoden for dyrking celler i 96-brønnen plater og flekker cellene i en sentrifugering-avhengige protokoll. En metode involvert dyrking cellene i 96-brønnen plater, etter standard prosedyre og deretter overføre cellene til plater forenlig med automatiserte plate skive den flekker trinn (Figur 4, DA-vask eksempler). Den andre metoden involvert dyrking cellene direkte i plate-skive-kompatible platene og fortsetter med fargeprotokoll på samme plate (Figur 4, DA-kultur eksempler). Sentrifugering uavhengig protokollene gir ikke mange oppfattes forskjeller i active caspase-3, CD69 eller TCRβ flekker over forskjellige prøvene testet, sammenlignet med vanlig sentrifugering-avhengige protokollen (Figur 4). Forskjeller i flekker intensiteten kan tilskrives bruke antistoffer i litt ulike konsentrasjoner under farging trinnene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figur 1 : Thymocyte levedyktighet etter behandling med hemmere. (A) eksperimentelle oversikt over hovedtrinnene i screening analysen. Det finnes tre foreslåtte metoder for stimulering og flekker av thymocytes brukes i aktivisering analysen, nemlig (1) dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater, etterfulgt av flekker ved hjelp av en vanlig sentrifugering-basert protokoll, (2) dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater, etterfulgt av flekker med en sentrifugering uavhengig vask protokoll og (3) dyrking av thymocytes i små volumer plater, etterfulgt av farging i samme platene med en sentrifugering uavhengig vask protokollen. (B) Gating strategier som brukes i levedyktighet analyser. Levende celle porten ble avledet fra frem scatter (FSC) og siden xy (SSC) tomter, som beskrevet tidligere17. Hemmere som ble ansett for å være for giftige på testet konsentrasjonen var underlagt ytterligere levedyktighet analyser i 10 ganger lave konsentrasjoner. Representative inhibitor-behandlet utvalg vises. Merk den felles kontrollen (DMSO-behandlet [DMSO]) på 1 µM og 0,1 µM prøver. (C) Plate utformingen av utvannet hemmere. En skjematisk fremstilling av plater hemmere utvannet i DMSO til en konsentrasjon av 500 x tiltenkte siste konsentrasjonen. Hver representerer godt en unik hemmer; grå brønnene er tomme. Konsentrasjonen vist er den endelige konsentrasjonen når lagt til cellekulturer, nemlig 10 µM (mørk rød), 1 µM (fuchsia) og 0,1 µM (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figur 2 : Plate utformingen av thymocyte aktivisering analysen. (Øverst) Kolonner 1 og 12 er reservert for kontroller, mens kolonnene 2 til 11 inhibitor-behandlet prøver (beige). Negativ kontrollen (nonstimulated [NS], grå) fyller brønner A1 til D1 og positiv kontrollen for celledød (dexamethasone-behandlet [DEX], lilla) fyller brønner E1 til H1. Kolonnene 2 til 12 inneholder thymocytes stimulert med anti-CD3/CD28 perler. Positiv kontrollen for thymocyte Aktivisering (stimulert prøver [α-CD3/CD28], grønn) fyller brønner A12 D12 og kontrollen kjøretøy (stimulert og DMSO-behandlet [α-CD3/CD28 + DMSO], rød) inntar brønner E12 til H12. (Nederst) Flow cytometri tomter i aktive caspase-3 (ActCasp3), CD69, og TCRβ flekker av thymocytes gated i dobbel-positive (DP) porten. Representant tomter ulike kontrollene vises. NS = nonstimulated; DEX = deksametason-behandlet prøver; Α-CD3/CD28 + DMSO = utvalg stimulert med CD3/CD28-belagt perler og behandlet med DMSO; Α-CD3/CD28 = utvalg stimulert med CD3/CD28-belagt perler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figur 3 : Screening av hemmer biblioteket på thymocyte aktivisering. (A) sammendragsdata for aktivisering analysen. Dette er resultatet av en representant eksperiment vise de normaliserte verdiene av celler med aktivert caspase-3 og CD69 uttrykk for valgte hemmere. Normalisering ble gjort ved å sammenligne prosentandelen av celler i aktiv-caspase-3-positiv eller CD69-positive gate verdi av DMSO-behandlet kontrollen, som er satt til relative verdien 0 i diagrammet. (B) valgt FACS tomter. Flow cytometri tomter hemmere som undertrykt både caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering (øverst til venstre), undertrykt bare CD69 oppregulering (øverst til høyre), eller hadde ingen effekt på caspase-3 aktivisering og CD69 oppregulering (nederst til venstre). Tomter på staurosporine-behandlet utvalget vises å illustrere effekten av å bruke en hemmer i giftig konsentrasjoner (nederst til høyre). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figur 4 : Sammenligning av forskjellige analysen protokoller. Flow cytometri tomter i aktive caspase-3 (ActCasp3), CD69, og TCRβ flekker av DP thymocytes etter tre forskjellige analysen protokoller. Fire ulike forhold er testet, nemlig kontrollen negative (nonstimulated [NS]), positiv kontrollen for celledød (dexamethasone-behandlet [DEX]), kjøretøy kontroll (stimulert og DMSO-behandlet [α-CD3/CD28 + DMSO]), og en inhibitor-behandlet eksempel (stimulert og PIK-75-behandlet [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Konvensjonelle = dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater og flekker med en vanlig sentrifugering-basert protokoll; DA-vask = dyrking av thymocytes i standard 96-brønns plater og flekker med en laminær strømning vaske protokoll; DA-kultur = dyrking av thymocytes i små volumer plater og farging i samme platene med en laminær strømning vaske protokollen.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Dette dokumentet bruker en flyt-cytometri-baserte analysen til skjermen biblioteker av kjemiske hemmere for identifisering av hemmere og sine mål som påvirker T-celle reseptor signalering. Metodene som er beskrevet her kan også utvides for høy gjennomstrømming screenings.

Identifikasjon av meglere på T-celle reseptor signalering via Screening av kjemiske Inhibitor biblioteker

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Vår analyse med høy gjennomstrømming legger til de tilgjengelige metodene for identifisering av små molekyler og deres mål som modulerer TCR-signalering og T-celleaktivering. Vår analyse har et selv korrigerende aspekt gjennom filtrering av giftige forbindelser og identifisere hemmere av TCR-signalering og stimuleringsindusert apoptose. Identifisering av meklere av TCR-signalering kan hjelpe til med utviklingen av terapi for immunsykdommer.Vi ga en sterk stimulans for thymocytes avledet fra TCR-polyklonale mus. Det er mulig å bruke TCR-transgene mus og stimulere dem med andre peptid ligand tetramers for svakere stimulering. Denne analysen innebærer bruk av små volumer og av små volumplater for dyrking av cellene.Dette krever nøye håndtering av platene og innholdet. Det er mange forbindelser i biblioteket av kinasehemmere som anses som farlige. For sikkerhetshensyn, behandle alle forbindelser som like farlige, og følg leverandørens anbefalte sikkerhetsforanstaltninger.For å starte behandlingen av tymocytter med kinasehemmere, bruk en flerkanals pipette for å legge til 40 mikroliter per brønn av tymocytter til en liten volumplate. Sett platen på is. Deretter pipette en del av kinase hemmere, DMSO, og deksametason, og fire deler av hele RPMI media i en 96-brønns plate.Utpeke åtte brønner av den lille volumplaten til ubehandlede kontroller, fire brønner til deksametasonbehandlet positive kontroller for celledød ved å legge til fortynnet deksametason ved fem mikromoskonsentrasjon, og fire brønner til kjøretøybehandlede kontroller, ved å legge til 0,5 mikroliter av fortynnet DMSO. Deretter, fra de tilsvarende brønnene på inhibitorplaten, tilsett 0,5 mikroliter av hver fortynnede hemmer til 96-brønnplaten. For å begynne thymocyte stimulering, først sørg for at anti-CD-3 og CD-28 perler er jevnt re-suspendert.Deretter vasker du en milliliter av perlene med to milliliter av PBS-bufferen. Sett røret på et magnetisk stativ for å skille perler fra supernatant og aspirere løsningen. Deretter re-suspendere perlene i en milliliter av hele RPMI medium.Tilsett 10 mikroliter per brønn av perlesuspensjonen til hver hemmerbehandlede prøve, de fire DMSO-behandlede prøvene og fire av de åtte ubehandlede prøvene. Tilsett 10 mikroliter av hele RPMI til de resterende fire ubehandlede brønnene. Bruk en mikroplate orbital shaker for å forsiktig røre platen.Deretter inkuberer du tymocytter i 37 grader Celsius og 5% karbondioksidmiljø i 17 til 20 timer, eller over natten. Prime en automatisert laminær strømningsplate vaskemaskin, først med 150 milliliter etanol Tween løsning, deretter med deionisert vann supplert med 1% Tween 20, og til slutt, med FACS vaskebuffer. På slutten av inkubasjonen ved hjelp av platevaskesystemet, vask platen med FACS vaskebuffer ved hjelp av en ni ganger vaskesyklus.Hver vask legger til og fjerner 55 mikroliter vaskebuffer ved laminær strømning, noe som resulterer i en eksponentiell fortynning av reagensene i brønnene. For å flekke overflateantigener, må du først fortynne ett enhetsvolum av anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 og anti-CD-69-antistoffer i 100-enhetsvolumer av FACS-vaskebufferen. Deretter re-suspendere cellene i 25 mikroliter av flekkantistoffblandingen.Bruk en mikroplate orbital shaker til å forsiktig røre platen, og la deretter platen stå på is i 30 minutter. For å fikse cellene, vask først platen med 55 mikroliter FACS vaskebuffer ved hjelp av ni ganger vaskesyklus som beskrevet før. Tilsett deretter 50 mikroliter av fikserings-impermeabliseringsbufferen til hver brønn.Bland godt og inkuber platen på is i 30 minutter. Etter inkubasjonen, forberede en one-X perm og vaske buffer ved å fortynne 25 milliliter av den medfølgende 10X lager i 225 milliliter Ultrapure vann. Prime plateskiven med en-X buffer og vask platen med 55 mikroliter av en-X buffer ved hjelp av en ni ganger vaskesyklus som beskrevet før.Til å begynne med, bland en milliliter av anti-caspase 3-antistoffet med to milliliter av en-X perm og vaskebuffer. Tilsett 25 mikroliter per brønn av blandingen til de faste cellene. Bruk en mikroplate orbital shaker for å forsiktig røre platen.La platen stå på is i en time. På slutten av inkubasjonen gjentar du vasketrinnet ni ganger med en-X perm og vaskebufferen. Tilsett deretter 25 mikroliter av FACS-vaskebufferen til alle brønner på platen.Pipetten opp og ned et par ganger for å blande løsningen. Til slutt overfører du de blandede prøvene til mikrotiterrør. På topp opp rørene med FACS vaskebufferen til et totalt volum på 200 mikroliter, og fortsett til strømningscytometrianalysen.Etter anti-CD-3 ble CD-28 stimulering, en økning i caspase-3-aktivering og TCR-nedregulering observert i både de ubehandlede og DMSO mock-behandlede prøvene. Også en økning i CD-69 uttrykk ble observert i begge stimulerte prøver. Deksametasonbehandlede prøver viste en økning i caspase-3 aktivering uavhengig av CD-69 upregulation, som forventet for den uavhengige apoptose-induserende effekten og TCR stimulering.Selektiv svekkelse av T-celleaktiveringsfenomener ble vist av forskjellige hemmere som enten undertrykte både caspase-3-aktivering og CD-69 up-regulation, eller hemmet CD-69 up-regulering, men ikke svekke caspase-3 aktivering. Det var også hemmere som ikke rettet mot en relevant kinase av TCR-signalveien, og derfor ikke undertrykke både CD-69 upregulation og caspase-3 aktivering. Skjermresultatet av staurosporin, apoptose-positiv kontroll, viste høye nivåer av caspase-3 aktivering, som forventet.Resultatet viste imidlertid også lave nivåer av CD-69-uttrykk som kan tilskrives enten sin medierte hemming av proteinkinase C eller dets induserte apoptose før CD-69-uttrykk. Sammenligning av ulike analyseprotokoller viste ingen forskjeller i aktiv caspase-3, CD-69 og TCR farging av den negative kontrollen, den positive kontrollen for celledød, kjøretøykontroll og en hemmerbehandlet prøve. Pre-inkubasjonsstadiene er ment å lette bruken av den lille volumplaten for dyrking av cellene.Standard sentrifugeavhengig protokoll er også gitt i manuskriptet. Potensielt interessante hemmere eller mål kan valideres ved hjelp av forskjellige celletyper og også i forskjellige arter, for eksempel pagopheral mus lymfocytter eller menneskelige primære celler. Etterfølgende karakterisering av de identifiserte molekylene og målene kan bidra til å forbedre forståelsen av T-cellebiologi og utvide mulige mål for immunmodulering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live Imaging av T-celle signalisering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Samtidig Kvantifisering av T-Cell Receptor Eksisjon Circles (TRECs) og K-Slette rekombinasjon Eksisjon Circles (KRECs) ved Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Differensiering i T cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduksjon av stamceller i benmarg for å generere T-celle reseptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

En Platform of Anti-biofilm Analyser Passer til Exploration of Natural Sammensatte biblioteker

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Ved hjelp av røntgenkrystallografi, biofysikk og funksjonelle analyser fastslår mekanismer som styrer T-celle reseptor Anerkjennelse av kreft antigener

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infeksjoner som Screening verktøy for identifikasjon av Viral Immunomodulators og vert Antiviral faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...