Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
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Este trabalho foi apoiado por concessões do Conselho Nacional de pesquisa médica do Ministério da saúde a Singapura, NMRC CBRG15may017 e o Ministério da educação, 2014 de Singapura-T2-1-136 (para N.R.J.G.).

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O autor Chyan Ying Ke é um empregado de Curiox Biosystems, que produz a célula DA lavadora e placas DA célula usadas neste artigo.

A estratégia de rastreio aqui proposta avalia a capacidade dos inibidores da pequeno-molécula para suprimir os efeitos de apoptose em timócitos após estimulação, além de marcadores mais convencionais do upregulation de CD69-ativação de células T e TCR downregulation . Marcadores adicionais também podem ser incluídos para permitir a análise de timócitos diferentes subconjuntos32. Um aspecto interessante do ensaio atual reside no fato de que inibidores que impedem a TCR sinalização também poderia umedecer a indução da apoptose, destacando ainda mais a distinção de efeitos de TCR-independente, que os inibidores podem ter na indução de morte celular. Além disso, um ensaio de citometria de fluxo-base permite a utilização de múltiplas leituras como marcadores de ativação distintas, o que poderiam relatar os efeitos dos inibidores em ramos individuais separados de TCR sinalização. No caso apresentado aqui, havia inibidores que mostraram uma diferencial inibição da ativação de caspase-3 e upregulation de CD69. Porque alguns compostos podem afetar funções de limpeza tais como a síntese de proteínas ou tráfico vesicular, não é surpresa observar efeitos sobre o upregulation de marcadores de novo sintetizado (por exemplo, CD69) mas não no posttranslational modificações (por exemplo, a ativação proteolítica de caspase-3).
Como o ensaio apresentado aqui mede apoptose como uma leitura, é imperativo que os efeitos tóxicos latentes dos inibidores não obscurecem os resultados. Por exemplo, na tela, não diluir staurosporine além de 1 nM, apesar de ainda ser tóxico para as células àquela concentração. Os resultados representativos estão de acordo com staurosporine, sendo um inibidor de quinase promíscuo e um indutor de apoptose33. Sem uma suficiente diluição dos compostos testados para concentrações não tóxica, é possível ignorar potenciais hits.
A estratégia de triagem detalhada aqui seria difícil aplicar aos seres humanos devido as complicações associadas à obtenção de um número suficiente de timócitos para seleção da elevado-produção. No entanto, é possível obter amostras do Timo humano de biópsias cardíacas pediátricas34,35 ou de fetos36,37. Apesar de tudo, como TCR sinalização de caminhos e as sequências de aminoácidos de proteínas de sinalização em grande parte são conservadas entre os ratos e os seres humanos, o ensaio de timócitos fornece uma estratégia útil triagem preliminar, e quaisquer resultados obtidos com este ensaio usando o mouse timócitos podem, então, ser verificados em linfócitos humanos primários.
Uma limitação do protocolo dependente de centrifugação convencional refere-se à perspectiva de perda de célula, que pode ser atribuída à natureza várias etapas do processo, que envolve etapas como a permeabilização de célula e centrifugação. Cada centrifugação e ressuspensão passo inevitavelmente resultam na perda de células. Enquanto tais perdas não podem ser críticas para estudos que envolvem um número limitado de amostras, isso poderia causar problemas quando aplicado no rastreio de uma taxa de transferência, em particular no decorrer do ensaio formato de 96 - a 384 - de 1536-bem. Uma maneira de contornar este problema é através do uso de célula-permeável caspase fluorescente sensores38 que permitem a detecção de ativação de caspase, evitando as complicações de permeabilização celular e múltiplas lavagens5. Alternativamente, empregar um método independente de centrifugação de células de lavagem por fluxo laminar também é possível para minimizar a perda de células. Com uma placa automatizada estação em conjunto com uma placa de parede-menos de lavagem, as células são lavadas pelo fluxo laminar sem o uso de uma centrífuga. A exponencial diluição dos reagentes permite a lavagem completa e eficiente de células em menos de 3 min, o que representa uma diluição equivalente a duas rodadas de lavagem centrífuga. Sem agressões externas devido a centrifugação, as células são mais viáveis e perdas de célula são minimizadas.
Exploramos também a possibilidade de utilizar a placa automatizada estação de lavagem após cultivo os timócitos em 96 poços de fundo U placas e, também, o cultivo de células diretamente na parede sem placas compatíveis com a placa automatizada estação de lavagem. O cultivo de células nas placas de parede-menos habilitado a eliminação de todas as etapas de centrifugação e minimizou a perda de células, eliminando a necessidade de uma transferência de amostra através de placas. Geralmente, os três diferentes protocolos são comparáveis em eficiência de estimulação e coloração. A estação de lavagem automatizada oferece o benefício de automação, velocidade e eficiência, o que torna mais fácil para a análise de uma taxa de transferência. Além disso, com a crescente automação, as etapas de lavagem podem ser realizadas mais rapidamente, e há uma maior coerência entre as experiências ou experimentadores. No entanto, a estação de lavagem tem certas desvantagens: grandes volumes de lavagem buffers são necessários para arruela escorva (150 mL por alteração de reserva, dos quais 50 mL é usado para lavar); cuidado extra é necessária ao manusear a placa para evitar qualquer contaminação dos poços devido ao particionamento limitada entre os poços da placa de pequeno volume; buffer de residual de 25 µ l dos poços após lavagem exige a utilização de reagentes preparados no maior do que a concentração de 1 x. Para resolver os problemas de volume residual e capacidade de volume limitado da placa, um acessório para expandir o volume de incubação de 70 µ l a 150 µ l pode ser adicionado, facilitando a adopção de protocolos convencionais. Enquanto placa automatizado de sistemas de tratamento estão disponíveis atualmente, eles têm uma pegada significativa em comparação com o sistema de lavagem laminar, que é uma pequena unidade de ~ 1 pé cúbico (~0.028 m3). Além disso, a integração de centrifugação em placa automatizada, sistemas de tratamento é um desafio, limitando a sua utilização na lavagem da célula. Não há atualmente nenhuma outra célula independente de centrífuga lavar instrumentos disponíveis, tanto quanto sabemos.
A estratégia de seleção apresentada aqui é capaz de identificar moléculas pequenas e suas quinases suposta alvo, que afetam a TCR sinalização e ativação de células T. A biblioteca usada aqui é composto principalmente de pequenas-molécula inibidores de quinases e foi capaz de gerar um número de potencialmente interessantes sucessos. O protocolo também pode ser aplicado facilmente bibliotecas de inibidor de outras classes de enzimas ou de outros tipos de pequenas moléculas, bem como bibliotecas de outros compostos (por exemplo, várias macromoléculas). O protocolo também pode ser usado para outros tipos de células, tais como periféricos linfócitos T ou células imortalizadas, incluindo aqueles expressando TCRs transgénicos ou carregando sistemas repórter da tela. Identificar e caracterizar novos mediadores de células T sinalização pode melhorar nosso conhecimento sobre a via de sinalização e também ajuda no desenvolvimento da terapia-alvo em doenças imunes13,14,15, 16. ao todo, este estudo acrescenta à gama de opções disponíveis para a detecção de mediadores de células T sinalização através de rastreio com throughput alto ensaios.

As células T são de uma linhagem de linfócitos que desempenham um papel crucial na manutenção da imunidade adaptativa. Eles expressam o TCR, que lhes permite reconhecer seus ligantes, complexos consistindo de uma molécula de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) com um peptídeo ligado, que são encontradas nas superfícies das apresentadoras células (APCs). O acionamento do TCR sinalização via através da interação de TCR/MHC é crucial para a ativação de células T e desenvolvimento1.
No desenvolvimento de células T, osso medula-derivado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) migram para o timo, onde sofrem diferenciação e passar pelas etapas de linhagem de células T progressão2. Timócitos (DP) de duplo-positivo, expressando o CD4 e CD8 coreceptors, envolver-se com autopeptídeo / MHC sobre as APCs. Timócitos com uma moderada afinidade com seus ligantes autopeptídeo / MHC amadurecem para se tornar timócitos (SP) CD4 ou CD8 de single-positivo, um processo denominado como selecção positiva. Por outro lado, timócitos que recebem estimulação excessiva de TCR através do autopeptídeo / MHCs sofrem apoptose através de seleção negativa3,4. Esse processo de apoptose induzida por estimulação, caspase dependente pode ser imitado em vitro , estimulando os timócitos, por exemplo, com grânulos de revestido de anticorpo anti-CD3/285. Células T maduras que passa o processo de seleção são ativadas por ligantes não-autopeptídeo / MHC de APCs na periferia. Autopeptídeo / MHCs ainda são relevantes para as células T periféricas, no contexto da tônica para a sobrevivência e proliferação homeostática, a diferenciação de células T de auxiliar e o reforço de respostas de células T para não-autopeptídeo / MHCs através de sinalização coagonism6,7,8,9. Vinculação de TCR de alta afinidade para o ligante de peptídeo/MHC ativa várias vias de sinalização a jusante, que envolvem muitas moléculas de sinalização, formando um complexo TCR sinalização rede10. As vias de sinalização de TCR têm sido estudadas por várias décadas, e ainda a descoberta de novos mediadores da via não mostra sinais de diminuir11,12. A modulação de vias de sinalização TCR tem relevância clínica e pode envolver potenciando respostas de células T para aplicações imunoterapia ou a inibição de respostas de células T para o controle de auto-imunidade13. Estratégias para a modulação de respostas de células T dependem, principalmente, o rompimento da quinase ou fosfatase atividade14,15,16.
Descrevemos um pedido de um ensaio de fluxo cytometry-baseado para o rastreio de pequenos compostos químicos de sua capacidade de modular a TCR sinalização e ativação de células T17. O ensaio baseia-se sobre o fenômeno de timócitos ativando a via de apoptose quando exposto a fortes sinais TCR. O ensaio é suficientemente sensível para identificar as alterações da força de estimulação; Incubar timócitos expressando TCR transgênico com tetrâmeros de peptídeo/MHC com o aumento da afinidade resultou em um aumento correspondente na caspase ativação-usado como uma medida da resposta apoptotic5. Para a tela, usamos uma biblioteca de inibidores da quinase e avaliar sua capacidade de modular a resposta de timócitos para sinais fortes de TCR.
Várias estratégias de fluxo cytometry-baseado ou fluorescência-repórter têm sido descritas para o rastreio da elevado-produção de uma variedade de fenótipos de ativação periférica em vários subconjuntos de células T. Tais estratégias incluem a utilização de genéticas repórteres fluorescentes para avaliar o momento e a magnitude da ativação de células T18, o uso de degranulação como uma leitura de células T citotóxicas atividade19,20e a análise do fosforilação de várias proteínas envolvidas na sinalização21de celular.
O ensaio de triagem aqui apresentado é capaz de identificar com sucesso compostos que inibem a moléculas canônicas da TCR sinalização de via, bem como potenciais, novos compostos com efeitos inibitórios na TCR sinalização. Por exemplo, identificamos inibidores da GSK3β e Hsp90 como novos compostos que afetam respostas de células T17. O ensaio é capaz de distinguir os inibidores que interferem com a transdução de sinal, devido a uma redução na resposta apoptótica, dos efeitos TCR-independente dos inibidores na toxicidade celular. Além da indução da apoptose, também medimos o upregulation de CD69 e TCR downregulation como marcadores de ativação. Como TCR sinalização redes são complexas, o uso de várias leituras pode aumentar as chances de descobrir moléculas com efeitos específicos em um único caminho. Aqui, apresentamos também a utilização de um protocolo de centrifugação independente como uma alternativa de alto rendimento para o protocolo original durante a coloração das células em preparação para a análise do fluxo cytometric. O ensaio descrito neste artigo usa uma pequena biblioteca composta de inibidores da quinase, mas, em princípio, pode ser usada para rastreio de taxa de transferência maior. A biblioteca de escolha também pode incorporar uma variedade de outras moléculas ou inibidores.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

O receptor de células T (TCR) sinalizando o caminho é composto por uma infinidade de mediadores que transmitem sinais após a ativação da TCR. Diferentes estratégias têm sido propostas e implementadas para a identificação de novos mediadores de TCR sinalização, que melhoraria a compreensão dos processos de células T, incluindo a ativação e a seleção do timo. Descrevemos um ensaio de triagem que permite a identificação de moléculas que influenciam a TCR sinalização baseado na ativação do desenvolvimento de timócitos. Sinais de forte TCR causam timócitos em desenvolvimento ativar a maquinaria de apoptose em um processo conhecido como seleção negativa. Através da aplicação de inibidores da quinase, aqueles com alvos que afetam TCR sinalização são capazes de substituir o processo de seleção negativa. O método detalhado neste artigo pode ser usado para identificar inibidores de quinases canônicos com funções estabelecidas nas vias de sinalização do TCR e também inibidores de quinases novos ainda a estabelecer-se em vias de sinalização do TCR. A estratégia de rastreio aqui pode ser aplicada aos ecrãs de maior rendimento para a identificação de novos alvos druggable na TCR sinalização.

A abordagem para o ensaio de triagem está resumida na figura 1A. Os inibidores da quinase primeiro foram selecionados por seus efeitos latentes na viabilidade de timócitos. Como um controle positivo de apoptosis, dexametasona foi usada como um agente proapoptotic. O canal para a população de células vivas... foi determinado com base nos controlos negativos e os controles positivos tratados com dexametasona (figura 1B). Primeiro, os inibidores foram testados em 10 µM em timócitos, e a percentagem de células viáveis foi medida após incubação por 18 h. Uma janela de 20% para a morte celular foi escolhida tal que os compostos que induziu uma maior do que 20% perda de células no portão de células vivas, em comparação com as amostras de DMSO-tratados, foram testados em concentrações inferiores (figura 1B). Parcelas de FACS representativas das amostras selecionadas tratados com inibidor são mostradas para ilustrar o ensaio da viabilidade. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), um inibidor de PI3K22, não aumentar grandemente a morte celular em 10 µM e o inibidor foi usado em 10 µM para os ensaios subsequentes. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), um duplo inibidor da PI3Kα/mTOR23, induzido por altos níveis de morte celular em 10 µM e 1 µM mas não com 0.1 µM e 0.1 µM foi determinada como sendo a concentração adequada para aplicação em ensaios a jusante. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), um inibidor de quinase C panproteína com uma capacidade estabelecida de induzir apoptose24, induzido por morte celular significativa em todas as concentrações testadas, mesmo em 0.1 µM. Foi usado como um controle positivo adicional em ensaios subsequentes em 0.1 µM.
As concentrações finais dos inibidores foram selecionadas com base em maiores concentrações em que não amplificam morte celular por mais de 20% das amostras tratadas DMSO. Com as concentrações finais dos inibidores determinados, uma placa de estoque dos inibidores foi preparada tal que todos os inibidores foram 500 vezes a concentração, quando aplicado às células. A Figura 1 ilustra o layout da placa da placa de estoque, com as concentrações finais dos inibidores. No protocolo alternativo de incubação das células diretamente nas placas de pequeno volume para o fluxo laminar do ensaio de lavagem, o uso de pequenos volumes necessitou uma diluição adicional dos inibidores. Para garantir que o conteúdo de DMSO das culturas após adição do inibidor não seria demasiado elevada para as células, os inibidores foram ainda mais diluídos em RPMI completa, por um fator de diluição de 5, tais que eram 100 vezes a concentração pretendido quando aplicado para a células.
Os inibidores, diluídos-se a concentrações não tóxica, foram utilizados no ensaio de TCR estimulação-induzida apoptose em timócitos5,17. A estimulação foi efectuada com anti-CD3/CD28 grânulos para 18 h, e as células foram posteriormente coradas para ativação de caspase-3 no CD4+ e CD8+ DP população timócitos (Figura 2). Aumento da ativação de caspase-3 e expressão CD69 e também uma downregulation TCR, observaram-se na anti-CD3/CD28-estimulada e as amostras anti-CD3/28-estimulada DMSO-simulação-tratada, em comparação com as amostras nonstimulated. As amostras tratadas dexametasona mostraram um aumento na ativação de caspase-3 independente de CD69 upregulation, que se espera do efeito de indução de apoptose sendo independente da estimulação de TCR.
Figura 3A resume os resultados da biblioteca de ensaio para selecionado inibidores de triagem. Tanto a ativação de caspase-3 e CD69 podem ser usado para identificar potenciais inibidores de interesse devido a supressão da expressão. Como esperado, inibidores de mediadores canônicos de TCR sinalização apareceram como positivo bate nas telas. Tais inibidores, que exibiram diversos graus de potência inibitória, incluíam inibidores de largo espectro que se destinam a quinases múltiplas e, também, mais inibidores específicos. Alguns inibidores foram capazes de suprimir tanto a ativação de caspase-3 e upregulation de CD69 (Figura 3B, linha superior, painéis à esquerda). Um tal inibidor é bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), que inibe a todos de proteína quinase C isoformas, além de proteína da e PDK125,26,27. Outro inibidor nesta categoria é CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), um inibidor da proposta de IKK228.
Foram compostos que inibiu upregulation de CD69 mas não prejudicar a ativação de caspase-3 (Figura 3B, linha superior, painéis certo). CAY10626, um inibidor da PI3Kα e mTOR23e U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] metileno]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), um inibidor MEK29, foram alguns dos inibidores identificados. Os resultados mostram que diferentes inibidores como alvo diferentes quinases de ramos específicos da via de sinalização do TCR, especialmente os alvos quinases do tarde-estágio, podem ocasionar a deficiência seletiva de fenômenos de ativação de células T.
Havia também inibidores que não suprimir tanto upregulation de CD69 e ativação de caspase-3 (Figura 3B, linha inferior, painéis à esquerda). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - particular - hidroxi-ácido benzenepropanoic, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl éster; CAS 33069-62-4), um disruptor do microtubule dinâmica30e necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), um inibidor de quinase de RIP131, são dois inibidores identificados para estar nesta categoria. Nesses casos onde a upregulation de CD69 e ativação de caspase-3 não eram deficientes, isto pode ser devido os inibidores não visando a uma quinase relevante da TCR sinalização via.
Como mencionado anteriormente, o staurosporine foi usado nas telas, numa concentração que ainda induziu apoptose em timócitos os. Como esperado, a amostra tratada com staurosporine mostrou altos níveis de ativação de caspase-3 (Figura 3B, linha inferior, coluna da direita). Os baixos níveis de expressão CD69 podem ser atribuídos para a inibição mediada por staurosporine da PKC, como bisindolylmaleimide II, outro inibidor de pan-PKC, também suprimida a expressão de CD69. Alternativamente, staurosporine induzida apoptose nas células antes que eles foram capazes de upregulate a expressão CD69.
Para aumentar a produtividade e automação do protocolo, foram elaborados protocolos paralelos que envolveram o uso de uma placa automatizado sistema através do fluxo laminar de lavagem. Dois protocolos separados usando este dispositivo de lavagem de placa automatizado foram julgado e em comparação com o método convencional de cultivo de células em placas de 96 poços e manchando as células em um protocolo de centrifugação-dependente. Um método envolveu o cultivo das células em placas de 96 poços, conforme procedimento padrão, e em seguida, transferir as células para placas compatíveis com a máquina de lavar prato automatizado para a coloração passos (Figura 4, as amostras DA lavagem). O outro método envolveu cultivo as células diretamente nas placas de chapa-máquina de lavar-compatível e continuando com o protocolo de coloração no mesmo prato (Figura 4, as amostras DA cultura). Os protocolos de centrifugação independente não dão muitas diferenças perceptíveis em ativo caspase-3, CD69, ou TCRβ coloração através de diferentes amostras testadas, em comparação com o protocolo dependente de centrifugação convencional (Figura 4). Diferenças na intensidade da coloração podem ser atribuídas ao uso de anticorpos em concentrações ligeiramente diferentes durante as etapas de coloração.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figura 1 : Viabilidade de timócitos após o tratamento com inibidores da. (A) Experimental contorno das etapas principais no ensaio de triagem. Existem três métodos propostos para a estimulação e a coloração dos timócitos utilizados no ensaio de ativação, ou seja, (1) o cultivo de timócitos em padrão placas de 96 poços, seguidos de coloração usando um protocolo de baseado em centrifugação convencional, (2) a cultivo de timócitos em padrão placas de 96 poços, seguidos de coloração usando um protocolo independente de centrifugação lavagem e (3) o cultivo de timócitos em placas de pequeno volume, seguido de coloração nas placas de mesmo usando um Protocolo de lavagem independente de centrifugação. (B) Gating estratégias utilizadas em ensaios de viabilidade. O portão de célula viva foi derivado da dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) plota, como descrito anteriormente,17. Inibidores que foram considerados muito tóxico para as concentrações testadas foram sujeitos a ensaios de viabilidade mais 10 vezes concentrações inferiores. Amostras representativas de inibidor-tratados são mostradas. Note o controle comum (DMSO-tratados [DMSO]) usado para a 1 µM e 0,1 µM de amostras. (C) layout de placa de inibidores diluídos. Uma representação esquemática das placas de inibidores diluídos em DMSO a uma concentração de 500 x concentração final pretendida. Cada um representa bem um único inibidor; os cinzas poços estão vazios. As concentrações mostradas são a concentração final quando adicionado para as culturas de células, ou seja 10 µM (vermelho escuro), 1 µM (fúcsia) e 0.1 µM (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figura 2 : Layout de placa de ensaio de ativação de timócitos. (Topo) Colunas 1 e 12 são reservadas para controles, enquanto as colunas 2 a 11 são tratados com inibidor de amostras (bege). O controlo negativo (nonstimulated [NS]; cinzento) ocupa poços de A1 a D1, e o controle positivo para morte celular (tratada com dexametasona [DEX]; roxo) ocupa poços E1 para H1. Colunas de 2 a 12 contêm timócitos estimulada com anti-CD3/CD28 grânulos. O controle positivo para ativação de timócitos (amostras estimuladas [α-CD3/CD28]; verde) ocupa poços A12 D12, e o controle do veículo (estimulada e tratada com DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]; vermelho) ocupa poços E12 para H12. (Parte inferior) Fluxo cytometry parcelas do ativo caspase-3 (ActCasp3), CD69 e TCRβ coloração de timócitos condomínio fechados dentro do portão (DP) de duplo-positivo. Parcelas representativas dos diferentes controles são mostradas. NS = nonstimulated; DEX = tratados com dexametasona amostras; Α-CD3/CD28 + DMSO = amostras estimuladas com grânulos CD3/CD28-revestido e tratado com DMSO; Α-CD3/CD28 = amostras estimuladas com grânulos CD3/CD28-revestido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figura 3 : Seleção da biblioteca inibidor na ativação de timócitos. (A) resumiu os dados do ensaio da ativação. Estes são os resultados de um experimento representativo, mostrando os valores normalizados de células com registrados caspase-3 e expressão CD69 para inibidores selecionados. Normalização foi feita comparando a percentagem de células no ativo-caspase-3-positivo ou portão de CD69-positivo para o valor do Controlarar de DMSO-tratados, que é definido como um valor relativo de 0 no gráfico. (B) selecionado FACS parcelas. Parcelas de citometria de fluxo de inibidores que oprimiu tanto a ativação de caspase-3 e upregulation de CD69 (canto superior esquerdo), suprimida apenas upregulation de CD69 (superior direito), ou não teve efeito sobre a ativação de caspase-3 e upregulation de CD69 (inferior esquerdo). Parcelas da amostra tratada com staurosporine são mostradas para ilustrar os efeitos do uso de um inibidor em concentrações tóxicas (canto inferior direito). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figura 4 : Comparação entre os protocolos de ensaio diferente. Flow cytometry parcelas do ativo caspase-3 (ActCasp3), CD69, e TCRβ coloração de timócitos DP seguindo os três diferentes protocolos de ensaios. Quatro condições diferentes são testadas, ou seja, o controle negativo (nonstimulated [NS]), o controle positivo para morte celular (tratada com dexametasona [DEX]), o controle do veículo (estimulada e tratada com DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) e tratados com um inibidor da amostra (estimulada e PIK-75-tratados [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Convencional = o cultivo de timócitos em placas de 96 poços padrão e coloração com um protocolo de baseado em centrifugação convencional; DA lavagem = o cultivo de timócitos em placas de 96 poços padrão e coloração usando um fluxo laminar lavagem protocolo; DA cultura = o cultivo de timócitos em placas de pequeno volume e coloração nas placas de mesmo usando um fluxo laminar protocolo de lavagem.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Nosso ensaio de alta produtividade adiciona aos métodos disponíveis para a identificação de pequenas moléculas e seus alvos que modulam a sinalização TCR e a ativação de células T. Nosso ensaio tem um aspecto auto-corretivo através da filtragem de compostos tóxicos e identificação de inibidores de sinalização TCR e apoptose induzida por estimulação. A identificação de mediadores da sinalização TCR pode auxiliar na evolução da terapia para doenças imunológicas.Fornecemos um forte estímulo para os timócitos derivados de ratos TCR-policlonais. É possível usar camundongos TCR transgênicos e estimulá-los com outros tetramers de ligantes de peptídeos para estimulação mais fraca. Este ensaio envolve o uso de pequenos volumes e de placas de pequeno volume para a colheita das células.Isso requer um manuseio cuidadoso das placas e do seu conteúdo. Há muitos compostos na biblioteca de inibidores da quinase que são considerados perigosos. Para considerações de segurança, trate todos os compostos como igualmente perigosos e siga as precauções de segurança recomendadas pelo fornecedor.Para iniciar o tratamento de timócitos com inibidores de quinase, use uma pipeta multicanal para adicionar 40 microliters por poço de timócitos a uma placa de pequeno volume. Coloque o prato no gelo. Em seguida, pipeta uma parte dos inibidores da quinase, DMSO e dexametasona, e quatro partes da mídia RPMI completa em uma placa de 96 poços.Designe oito poços da placa de pequeno volume para controles não tratados, quatro poços para controles positivos tratados com dexametasona para morte celular adicionando a dexametasona diluída na concentração de cinco micromolares, e quatro poços aos controles tratados com veículos, adicionando 0,5 microlitres do DMSO diluído. Em seguida, dos poços correspondentes da placa inibidora, adicione 0,5 microliters de cada inibidor diluído à placa de 96 poços. Para começar a estimulação de timócitos, primeiro certifique-se de que as contas anti-CD-3 e CD-28 sejam uniformemente re-suspensas.Em seguida, lave um mililitro das contas com dois mililitros do buffer PBS. Coloque o tubo em um suporte magnético para separar contas do supernascida e aspirar a solução. Em seguida, suspenda novamente as contas em um mililitro do meio RPMI completo.Adicione 10 microliters por poço da suspensão de contas a cada amostra tratada pelo inibidor, as quatro amostras tratadas com DMSO e quatro das oito amostras não tratadas. Adicione 10 microliters do RPMI completo aos quatro poços não tratados restantes. Use um agitador orbital de microplacar para agitar suavemente a placa.Em seguida, incubar os timócitos em ambiente de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 17 a 20 horas, ou durante a noite. Prime uma lavadora automática de placas de fluxo laminar, primeiro com 150 mililitros de solução Tween de etanol, depois com água deionizada suplementada com 1%Tween 20, e finalmente, com tampão de lavagem FACS. No final da incubação usando o sistema de arruela de placa, lave a placa com tampão de lavagem FACS usando um ciclo de lavagem de nove vezes.Cada lavagem adiciona e remove 55 microliters de tampão de lavagem por fluxo laminar, resultando em uma diluição exponencial dos reagentes nos poços. Para colorir antígenos superficiais, primeiro dilua um volume unitário de anticorpos anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 e anticorpos anti-CD-69 em volumes de 100 unidades do buffer de lavagem FACS. Em seguida, suspenda novamente as células em 25 microliters da mistura de anticorpos de coloração.Use um agitador orbital de microplacar para agitar suavemente a placa e, em seguida, deixe a placa no gelo por 30 minutos. Para fixar as células, primeiro lave a placa com 55 microliters de tampão de lavagem FACS usando ciclo de lavagem de nove vezes como descrito anteriormente. Em seguida, adicione 50 microliters do buffer de fixação-impermeablização a cada poço.Misture bem e incubar a placa no gelo por 30 minutos. Após a incubação, prepare um perm de um X e lave tampão diluindo 25 mililitros do estoque fornecido de 10X em 225 mililitros de água Ultrapure. Prime a lavadora de placa com tampão de um X e lave a placa com 55 microliters do buffer one-X usando um ciclo de lavagem de nove vezes como descrito anteriormente.Para começar, misture um mililitro do anticorpo anti-caspase 3 com dois mililitros do perm de um X e tampão de lavagem. Adicione 25 microliter por poço da mistura às células fixas. Use um agitador orbital de microplacar para agitar suavemente a placa.Deixe a placa no gelo por uma hora. No final da incubação, repita o passo de lavagem nove vezes com o perm one-X e o tampão de lavagem. Em seguida, adicione 25 microliters do tampão de lavagem FACS a todos os poços da placa.Pipeta para cima e para baixo algumas vezes para misturar a solução. Finalmente, transfira as amostras mistas em tubos de microtiter. Cubra os tubos com o tampão de lavagem FACS a um volume total de 200 microliters e prossiga para a análise da citometria de fluxo.Após a estimulação anti-CD-3, o CD-28, um aumento na ativação caspase-3 e a baixa regulação do TCR foram observados tanto nas amostras não tratadas quanto nas amostras tratadas por simulação do DMSO. Além disso, observou-se aumento da expressão CD-69 em ambas as amostras estimuladas. As amostras tratadas com dexametasona mostraram um aumento na ativação caspase-3 independente da regulação do CD-69, como esperado para o efeito independente indutor de apoptose e a estimulação tcr.O comprometimento seletivo dos fenômenos de ativação de células T foi demonstrado por diferentes inibidores que suprimiram tanto a ativação caspase-3 quanto a regulação do CD-69, ou inibiram a regulação do CD-69, mas não prejudicaram a ativação do caspase-3. Houve também inibidores que não visavam uma quinase relevante da via de sinalização TCR e, portanto, não suprimiam tanto a regulação do CD-69 quanto a ativação do caspase-3. O resultado da tela da staurosporina, o controle positivo da apoptose, mostrou altos níveis de ativação caspase-3, como esperado.No entanto, o resultado também mostrou baixos níveis de expressão CD-69 que podem ser atribuídos à sua inibição mediada da proteína quinase C ou sua apoptose induzida antes da expressão CD-69. A comparação de diferentes protocolos de ensaio não mostrou diferenças nas manchas ativas de caspase-3, CD-69 e TCR do controle negativo, o controle positivo para morte celular, o controle do veículo e uma amostra tratada com inibidores. Os estágios de pré-incubação destinam-se a facilitar o uso da placa de pequeno volume para a cultura das células.O protocolo padrão dependente da centrífuga também é fornecido no manuscrito. Inibidores ou alvos potencialmente interessantes podem ser validados usando diferentes tipos de células e também em diferentes espécies, como linfócitos de camundongos pagopherais ou células primárias humanas. A caracterização subsequente das moléculas identificadas e dos alvos pode ajudar a melhorar a compreensão da biologia das células T e expandir-se sobre possíveis alvos para a imunomodulação.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Imunologia e Infecção

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

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Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

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