Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Эта работа была поддержана от грантов от министерства здравоохранения Сингапура Национальный медицинский исследовательский совет, NMRC CBRG15may017 и Сингапуре Министерство просвещения, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.).

<ol>
	<li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development.">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li><li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers.">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).</li><li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&amp;#34;self&amp;#34;+in+T-cell+activation.">A role for &amp;#34;self&amp;#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li><li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation.">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li><li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC.">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling.">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development.">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling.">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development.">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li><li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+human+autoimmunity:+current+practice+and+future+prospects.">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li><li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity.">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li><li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate.">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li><li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li><li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation.">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).</li><li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules.">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants.">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li><li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis.">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li><li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry.">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li><li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase,+2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+(LY294002).">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors.">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li><li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine,+K-252+and+UCN-01:+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases.">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li><li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2,3-Bisarylmaleimides.">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li><li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1.">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li><li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A.">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li><li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel compounds. , (2003).</li><li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase.">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li><li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway.">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors.">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).</li><li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts.">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li><li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+neonatal+thymus:+evidence+for+a+transient+thymic+involution.">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li><li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus.">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li><li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and/or+IFN-gamma-producing+CD4++and+CD8++T+cells.">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li><li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+ADMET.">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li></ol>

Автор Chyan ин Ke является сотрудником Curiox Biosystems, который производит DA-клеточной шайбу и DA-клеточной пластин, используемых в этой статье.

Стратегия отбора предлагаемых здесь оценивается способность малых молекул ингибиторов для подавления apoptotic в тимоцитов после стимуляции, помимо обычных маркеров upregulation активации CD69 Т-клеток и TCR Даунрегуляция . Дополнительные маркеры также могут быть включены для включения анализа различных тимоцитов подмножеств32. Интересным аспектом текущего анализа заключается в том, что ингибиторы, которые препятствуют TCR сигнализации бы также ослабить индукции апоптоза, далее подчеркивая различие TCR-независимые эффекты ингибиторов может иметь на вызывающие гибель клеток. Кроме того на основе потока цитометрии пробирного позволяет использовать несколько показаний как собственный активации маркеры, которые могут сообщить эффекты ингибиторов на отдельных отдельных отраслей TCR сигнализации. В случае, представленные здесь были ингибиторов, которые показали дифференциального ингибирование активацию caspase-3 и CD69 upregulation. Потому что некоторые соединения могут повлиять на хозяйственные функции, такие как синтез белка или везикулярного людьми, это не удивительно наблюдать эффекты на upregulation de novo синтезированных маркеров (например, CD69), но не на Посттрансляционная изменения (например, протеолитических активацию caspase-3).
Как assay представленные здесь меры апоптоз как индикация, крайне важно, что скрытые токсические эффекты ингибиторов не заслонять результаты. Например, на экране, мы сделали не разбавить staurosporine за 1 Нм, несмотря на его по-прежнему токсичны для клеток при этом концентрации. Представитель результаты согласуются с staurosporine, неразборчивый киназы ингибитора и индуктором апоптоз33. Без достаточной разбавления протестированы на нетоксичные концентрации соединений можно упустить потенциальных хитов.
Стратегия отбора, подробно здесь будет трудно применять к людям из-за осложнений, связанных с получением достаточного количества тимоцитов для высокопроизводительного скрининга. Однако можно получить образцы человеческого тимуса от педиатрической сердечной биопсий34,35 или36,плодов37. Тем не менее, как TCR сигнальные пути и аминокислотных последовательностей сигнализации белки основном сохраняются между мышей и людей пробирного тимоцитов обеспечивает полезный предварительный скрининг стратегию, и любые результаты, полученные с этот assay, с помощью мыши тимоцитов может затем, проверена в первичной лимфоцитах человека.
Одним из ограничений обычного центрифугирования зависимых протокола относится к Перспектива потери клеток, которые можно отнести к многоступенчатый характер процесса, который включает такие шаги, как клетки permeabilization и центрифугирования. Каждый центрифугирования и ресуспендирования шаг неизбежно приводит к гибели клеток. Хотя такие потери не могут быть критически важное значение для исследований с участием ограниченного числа проб, он может породить проблемы при применении скрининг более высокой пропускной способности, в частности, по ходу пробирного формат из 96 - до 384-1536-хорошо. Одним из способов обхода этой проблемы является использование клеток проницаемой флуоресцентные caspase датчики38 , включите обнаружение активацию caspase избегая осложнений клеток permeabilization и нескольких стирок5. Кроме того используя метод центрифугирования независимые обмыв ламинарные клетки также возможна для минимизации ячейка потерь. С автоматизированной пластиной промывочной станции в сочетании с табличкой стены менее клетки омываются ламинарного потока без использования центрифуг. Экспоненциальная разбавления реагентов позволяет для тщательной и эффективной промывки клеток в менее чем 3 мин, которая представляет собой эквивалент разбавления до двух раундов центробежные стирки. Без внешних напряжений вследствие центрифугирования клетки более жизнеспособны и клеток потери сведены к минимуму.
Мы также изучили возможность использования автоматизированных пластины, промывочная станция после культивирования тимоцитов в 96-Ну U-нижней пластины и, Кроме того, культивирование клеток прямо в стену менее пластины совместим с автоматизированной пластины, промывочная станция. Культивирования клеток в стене менее пластины включен ликвидации всех шагов центрифугирования и свести к минимуму потери клеток, устраняя необходимость передачи образца через пластины. Как правило три различные протоколы являются сопоставимыми в эффективность стимуляции и пятнать. Станция автоматической мойки обеспечивает преимущество автоматизации, скорость и эффективность, что делает его легче для анализа более высокой пропускной способности. Кроме того с большей автоматизации, Стиральная шаги может осуществляться быстрее, и есть большей согласованности между экспериментов или экспериментаторов. Однако, станция мойки имеет определенные недостатки: большими объемами отмывающего буфера требуются для грунтования шайбу (150 мл в буфер изменения, из которых 50 мл используется для стирки); осторожность необходима при обработке пластину избежать любого загрязнения скважин из-за ограниченного перегородки между скважинами малообъемной плиты; остаточные буфер 25 мкл в скважинах после стирки требует использования реагентов, подготовленных на более высоком чем 1 x концентрации. Для решения проблемы остаточного объема и ограниченный объем плиты, могут быть добавлены аксессуар расширить объем инкубации из 70 мкл до 150 мкл, содействия принятию обычных протоколов. Хотя в настоящее время имеются системы обработки автоматизированной пластины, они имеют значительный след, по сравнению с ламинарным мыть системы, которая представляет собой небольшое устройство ~ 1 кубический фут (~0.028 м3). Кроме того интеграция центрифугирования в автоматизированных систем обработки пластина сложной, ограничивая их использования в ячейке стиральная. Есть в настоящее время нет центрифуги независимые ячейки, мытья инструментов, насколько мы знаем.
Стратегия отбора, представленные здесь может определить малых молекул и их предполагаемой целевой киназы, которые влияют на TCR сигнализации и активация Т-клеток. Библиотека, используемая здесь состоит главным образом малых молекул ингибиторов киназ и был в состоянии генерировать ряд потенциально интересные ответы. Протокол можно также легко применять ингибитор библиотек из других классов ферментов или других типов малых молекул, а также библиотеки других соединений (например, различные макромолекул). Протокол может также использоваться для других типов клеток, например периферической Т-лимфоцитов или увековечен клеток, включая те, выражая transgenic TCRs или ношение репортер систем. Выявления и классификации новых посредников Т-клеточной сигнализации может улучшить наши знания о сигнальный путь, а также помощь в разработке целенаправленной терапии иммунных заболеваний13,14,15, 16. в целом, это исследование добавляет диапазон доступных вариантов Т-клеточных сигналов через высокопроизводительного скрининга анализов для выявления посредников.

Т-клетки являются линии лимфоцитов, которые играют ключевую роль в поддержании адаптивного иммунитета. Они выражают TCR, что позволяет им признавать их лиганды, комплексы, состоящие из сложных молекул гистосовместимости (MHC) с привязанного пептид, которые встречаются на поверхности антиген представляющих клеток (БТР). Срабатывание сигнализации путь через взаимодействие TCR/MHC TCR имеет решающее значение для активации Т-клеток и развитию1.
В развитие Т-клеток кость-костного мозга производные гемопоэтических стволовых клеток (СКК) перенести тимуса, где они подвергаются дифференциации и пройти через этапы Т-клеточной линии прогрессии2. Двухместный позитивные (DP) тимоцитов, выражая CD4 и CD8 coreceptors, взаимодействовать с self пептида/MHC на БТРах. Тимоцитов с умеренным сродством для их самостоятельной пептида/MHC лигандов Зрелые стать сингл позитивные (SP) CD4 и CD8 тимоцитов, процесс называют как позитивного выбора. И наоборот тимоцитов, которые получают чрезмерной стимуляции TCR через self пептида/MHCs проходят apoptosis через негативный выбор3,4. Этот процесс апоптоза стимуляции индуцированного, caspase зависимая может быть передразнил в пробирке , стимулируя тимоцитов, например с бисером антителами anti-CD3/285. Зрелых Т-клеток, которые прошли процесс отбора активируются non-self пептида/MHC лигандов с БТР на периферии. Self пептида/MHCs по-прежнему актуальны для периферической Т-клеток, в контексте тоник, сигнализации для выживания и гомеостатических распространения, дифференциация вспомогательные Т-клеток и повышение Т-клеток ответов на non-self пептида/MHCs через coagonism6,,78,9. Высокоспецифичные связывающие TCR с пептида/MHC лигандом активирует несколько ниже по течению сигнальные пути, которые включают много сигнальных молекул, формирование комплекса TCR сигнализации сети10. TCR сигнальных путей были изучены на протяжении нескольких десятилетий, и тем не менее открытие новых посредников пути показывает никаких признаков ослабления11,12. Модуляция TCR сигнальных путей имеет клиническое значение и может включать потенцирования Т-клеточный ответ для иммунотерапевтических приложений или ингибирование Т-клеточный ответ для управления аутоиммунитета13. Стратегии для модуляции Т-клеток ответов главным образом зависят от нарушения киназу или фосфатазы деятельности14,,1516.
Мы описываем приложения на основе потока цитометрии анализа для проверки малых химических соединений для их способность модулировать TCR сигнализации и Т-клеток активации17. Assay петли на явлении тимоцитов, активизируя путь апоптоза при воздействии сильные сигналы TCR. Assay достаточно чувствительным для выявления изменений в стимуляции силой; инкубации тимоцитов, выражая трансгенных TCR с пептида/MHC тетрамера с увеличением сродство привело к соответствующему увеличению caspase активации используется как мера реакции apoptotic5. Для экрана мы использовали библиотеку ингибитора киназы и оценивать их способность модулировать тимоцитов ответ на сильные сигналы TCR.
Были описаны несколько потока цитометрии основанные или флуоресценции репортер стратегии для высокопроизводительного скрининга ассортимент периферийных активации фенотипы в различных подмножеств Т-клеток. Такие стратегии включают в себя использование генетических флуоресцентные репортеров для оценки сроков и масштабов Т-клеток активации18, использование дегрануляции как индикация19,активность цитотоксических Т-клеток20и анализ фосфорилирование различных белков, участвующих в сотовых сигнализации21.
Assay скрининга, представленные здесь возможность успешно идентифицировать соединений, которые тормозят канонические молекул TCR, сигнальный путь, а также потенциал, Роман соединений с тормозящее действие на TCR сигнализации. Например мы определили ингибиторов GSK3β и Hsp90 как новых соединений, влияющих на Т-клеточные ответы17. Assay возможность различать ингибиторов, которые мешают трансдукции сигнала, вследствие сокращения в ответе apoptotic, TCR-независимые эффекты ингибиторов на сотовой токсичности. В дополнение к индукции апоптоза мы также измерить CD69 upregulation и TCR Даунрегуляция как маркеры активации. Как TCR сигнализации есть сложных сетей использование нескольких показаний может увеличить шансы обнаружения молекул с конкретными последствиями на один путь. Здесь мы также внедрить использование центрифугирования независимый протокол как альтернатива высокой пропускной способностью для первоначального протокола во время окрашивания клеток в рамках подготовки анализа гранулярных потока. Assay, описанные в этой статье использует небольшую библиотеку составных ингибиторов протеинкиназы, но, в принципе, он может использоваться для более высокой пропускной способности скрининга. Библиотека выбора также может включать различные ингибиторы или других молекул.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

Т-клеточных рецепторов (TCR) сигнальный путь состоит из множества посредников, которые передают сигналы после активации TCR. Различные стратегии были предложены и осуществлены для идентификации новых посредников TCR сигнализации, которые способствовали бы улучшению понимания процессов Т-клеток, включая активацию и тимуса выбор. Мы описываем скрининг assay, который позволяет идентифицировать молекул, которые влияют TCR сигналов, основанный на активации развивающихся тимоцитов. TCR сильные сигналы вызывают развивающихся тимоцитов активировать механизм апоптоза в процесс, известный как негативный выбор. Путем применения ингибитора киназы те с целями, которые влияют на сигнализацию TCR способны переопределить процесс негативного отбора. Метод, подробно изложены в настоящем документе может использоваться для идентификации ингибиторы канонических киназ с установленными ролями в TCR сигнальных путей, а также ингибиторы новых киназ еще должен быть создан в сигнальных путей TCR. Стратегия отбора здесь может применяться к экранам более высокую пропускную способность для идентификации Роман druggable целей в TCR сигнализации.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Этот документ использует на основе потока цитометрии пробирного экране библиотеки химических ингибиторов для идентификации ингибиторы и их целевых показателей, которые влияют на Т-клеточный рецептор сигнализации. Методы, описанные здесь также могут быть расширены для фильмов высокой пропускной способности.

Идентификация посредников Т-клеточных рецепторов сигналов через скрининг химического ингибитор библиотек

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Наш высокой пропускной способностью анализ добавляет к доступным методам для идентификации малых молекул и их целей, которые модулируют TCR сигнализации и активации Т-клеток. Наш анализ имеет самовоспределяющийся аспект путем фильтрации токсичных соединений и выявления ингибиторов TCR сигнализации и стимуляции индуцированного апоптоза. Выявление посредников сигнализации TCR может помочь в развитии терапии иммунных заболеваний.Мы предоставили сильный стимул для тимоцитов, полученных из TCR-поликлональных мышей. Можно использовать TCR-трансгенных мышей и стимулировать их с другими пептидными тетрамерами лиганда для более слабой стимуляции. Этот анализ включает в себя использование небольших объемов и малотомных пластин для культивирования клеток.Это требует тщательной обработки пластин и их содержимого. Есть много соединений в библиотеке ингибиторы киназы, которые считаются опасными. Что касается безопасности, относитесь ко всем соединениям как к одинаково опасным и следуйте рекомендуемых поставщиком мерам предосторожности.Чтобы начать лечение тимоцитов ингибиторами киназы, используйте многоканарновую пипету, чтобы добавить 40 микролитров на колодец тимоцитов в малотомерную пластину. Поставь тарелку на лед. Затем пипетка одной части ингибиторов киназы, DMSO и дексаметазона, и четыре части полного RPMI средств массовой информации в 96-хорошо пластины.Назначить восемь скважин малообнамеренной пластины для необработанного контроля, четыре скважины для дексаметазона обработанных положительный контроль за гибелью клеток, добавив разбавленный дексаметазон в пятимимолярной концентрации, и четыре скважины для транспортных средств, обработанных контроля, добавив 0,5 микролитров разбавленной DMSO. Далее, из соответствующих скважин ингибиторной пластины, добавьте 0,5 микролитров каждого разбавленного ингибитора к пластине 96 скважин. Чтобы начать стимуляцию тимоцитов, сначала убедитесь, что анти-CD-3 и CD-28 шарики равномерно повторно приостановлено.Затем вымойте один миллилитр бисера двумя миллилитров буфера PBS. Положите трубку на магнитный стенд, чтобы отделить бисер от супернатанта и аспирировать раствор. Затем повторно приостанавливать бисер в один миллилитр полной среды RPMI.Добавьте 10 микролитров на колодец суспензии шарика к каждому образцу, обработанному ингибитором, четырем обработанным DMSO образцам и четырем из восьми необработанных образцов. Добавьте 10 микролитров полного RPMI к оставшимся четырем необработанным скважинам. Используйте орбитальный шейкер с микроплюей, чтобы аккуратно агитировать пластину.Затем инкубировать тимоциты в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа окружающей среды в течение 17 до 20 часов, или на ночь. Премьер автоматизированной шайбы пластины ламинарного потока, сначала с 150 миллилитров этанола Tween раствор, затем с деионизированной водой, дополненной 1%Tween 20, и, наконец, с facS мыть буфера. В конце инкубации с помощью системы шайбы пластины, мыть пластину с FACS мыть буфер с помощью девятикратного цикла стирки.Каждая стирка добавляет и удаляет 55 микролитров буфера мытья ламинарным потоком, что приводит к экспоненциальному разбавлению реагентов в скважинах. Чтобы окрашивать поверхностные антигены, сначала разбавляют один объем блока анти-CD-3, анти-CD-4, анти-CD-8 и анти-CD-69 антител в 100-единицных томах буфера промывки FACS. Затем повторно приостановить клетки в 25 микролитров окрашивания антител смеси.Используйте орбитальный шейкер из микропластиров, чтобы аккуратно агитировать пластину, а затем оставить пластину на льду на 30 минут. Чтобы исправить клетки, сначала мыть пластину с 55 микролитров facS мыть буфер с помощью девяти раз цикл стирки, как описано ранее. Затем добавьте 50 микролитров буфера фиксации-империаблизации к каждой колодец.Хорошо перемешать и инкубировать пластину на льду в течение 30 минут. После инкубации подготовьте буфер one-X perm и вымойте буфер, разбавляя 25 миллилитров предоставленного 10X запаса в 225 миллилитров ultrapure воды. Премьер пластины шайбу с одним-X буфера и мыть пластину с 55 микролитров одного-X буфера с помощью девяти раз цикл стирки, как описано ранее.Для начала смешайте один миллилитр антитела против каспазы 3 с двумя миллилитров одного-X пермяка и вымойте буфер. Добавьте 25 микролитров на колодец смеси в фиксированные клетки. Используйте орбитальный шейкер с микроплюей, чтобы аккуратно агитировать пластину.Оставьте тарелку на льду на час. В конце инкубации повторите шаг стирки девять раз с помощью одной завивки и вымойте буфер. Затем добавьте 25 микролитров буфера промывки FACS ко всем колодцам пластины.Pipette вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать раствор. Наконец, перенесите смешанные образцы в микротитровые трубки. Пополнить трубки буфером промывки FACS до общего объема 200 микролитров и приступить к анализу цитометрии потока.После анти-CD-3, CD-28 стимуляции, увеличение активации каспазы-3 и TCR downregulation наблюдались как в необработанных и DMSO макет обработанных образцов. Кроме того, в обоих стимулируемых образцах наблюдалось увеличение экспрессии CD-69. Образцы, обработанные дексаметазоном, показали увеличение активации каспазы-3 независимо от регулирования CD-69, как и ожидалось для независимого эффекта, вызывающего апоптоз, и стимуляции TCR.Селективное нарушение явлений активации Т-клеток было показано различными ингибиторами, которые либо подавляли как активацию каспазы-3, так и до регуляции CD-69, либо препятствовали регулирования CD-69, но не ухудшали активацию каспаса-3. Были также ингибиторы, которые не нацелены на соответствующую киназу пути сигнализации TCR, и поэтому не подавляли как регуляцию CD-69, так и активацию каспаса-3. Результат экрана стауроспорина, апоптоз-положительный контроль, показал высокий уровень активации каспазы-3, как и ожидалось.Тем не менее, результат также показал низкий уровень экспрессии CD-69, которые могут быть отнесены либо к его опосредованное ингибирование белка киназы C или его индуцированного апоптоза до CD-69 выражение. Сравнение различных протоколов анализа не показало различий в активной каспассе-3, CD-69 и окрашивание TCR отрицательного контроля, положительного контроля за гибелью клеток, управления транспортным средством и образца, обработанного ингибиторами. Стадии предварительной инкубации предназначены для облегчения использования малотомной пластины для культивирования клеток.В рукописи также представлен стандартный протокол, зависящий от центрифуг. Потенциально интересные ингибиторы или цели могут быть проверены с использованием различных типов клеток, а также у различных видов, таких как пагоферные лимфоциты мыши или первичные клетки человека. Последующая характеристика выявленных молекул и целевых показателей может помочь улучшить понимание биологии Т-клеток и расширить возможные целевые показатели иммуномодуляции.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Мыши с Предустановленные Т Особенности клеточного рецептора Против Toxoplasma гондий, Полученные через SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

В режиме реального времени Живая съемка Т-клеточного сигнального комплекса Формирование

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Одновременное количественное определение Т-клеточного рецептора иссечение Круги (TRECs) и K-Удаление рекомбинация Вырезание кругов (KRECs) по ПЦР в реальном времени

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Ретровирусное Трансдукция костного мозга клеток-предшественников для генерации Т-клеточного рецептора Retrogenic Мыши

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Платформа анти-биопленки Assays Подходят к исследованию природных библиотек Compound

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

С помощью рентгеновской кристаллографии, биофизики и функциональными пробами, чтобы определить механизмы управляющих Т-клеточного рецептора распознавания рака антигенам

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...