Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
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Este trabajo fue financiado por becas del Consejo Nacional de investigación médica del Ministerio de salud de Singapur, NMRC CBRG15may017 y Singapur Ministerio de educación, 2014-T2-1-136 (a N.R.J.G.).

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El autor Chyan Ying Ke es un empleado de Curiox Biosystems, que produce la lavadora DA células y placas de células DA en este artículo.

La estrategia de investigación aquí propuesta evalúa la capacidad de los inhibidores de molécula pequeña para suprimir los efectos de la apoptosis en timocitos después del estímulo, además de más convencionales marcadores de activación CD69 upregulation de la célula de T y downregulation del TCR . También se pueden incluidos para permitir el análisis del anti-thymocyte diferentes subconjuntos32marcadores adicionales. Un aspecto interesante del análisis actual se encuentra en el hecho de que los inhibidores que impiden la señalización del TCR también humedezca la inducción de apoptosis, destacando además la distinción de los efectos de la TCR-independiente los inhibidores que tenga de inducir muerte celular. Además, un análisis basado en la citometría de flujo permite el uso de múltiples lecturas como marcadores de activación distintas, que podían informar los efectos de los inhibidores en diferentes ramas individuales de la señalización del TCR. En el caso presentado aquí, había inhibidores que mostró una inhibición diferencial de activación de la caspasa-3 y upregulation de CD69. Porque algunos compuestos pueden afectar las funciones de limpieza como la síntesis de proteínas o tráfico vesicular, no es de extrañar observar efectos en la regulación al alza de de novo sintetizado marcadores (por ejemplo, CD69) pero no en postraduccional modificaciones (por ejemplo, la activación proteolítica de caspasa-3).
Como el análisis presentado aquí mide la apoptosis como una lectura, es imprescindible que los latentes efectos tóxicos de los inhibidores de no oscurecer los resultados. Por ejemplo, en la pantalla, que no diluir estaurosporina más allá de 1 nM, a pesar de aún ser tóxicos a las células a esa concentración. Resultados representativos están de acuerdo con ser un inhibidor de la cinasa promiscuo y un inductor de apoptosis33estaurosporina. Sin una dilución suficiente de los compuestos probados a concentraciones no tóxicas, es posible pasar por alto posibles golpes.
La estrategia de investigación detallada aquí sería difícil de aplicar a los seres humanos debido a las complicaciones asociadas con la obtención de un número suficiente de timocitos para detección de alto rendimiento. Sin embargo, es posible obtener muestras de timo humano de biopsias cardíacas pediátrica34,35 o de fetos36,37. Sin embargo, como TCR señalización de caminos y las secuencias de aminoácidos de las proteínas de señalización en gran parte se conservan entre ratones y humanos, el análisis del anti-thymocyte proporciona una estrategia de cribado preliminar útil, y cualquier resultados obtenidos con este ensayo usando el ratón timocitos se pueden, entonces, verificar en linfocitos humanos primarios.
Una limitación del protocolo dependiente de la centrifugación convencional se refiere a la posibilidad de pérdida de la célula, que puede ser atribuida a la naturaleza varias fases del proceso, que implica medidas como la permeabilización celular y centrifugación. Cada centrifugación y resuspensión paso inevitablemente resulta en la pérdida de células. Mientras que esas pérdidas no pueden ser críticas para los estudios que involucran a un número limitado de muestras, pueden plantear problemas cuando se aplica en la detección de un mayor rendimiento, en particular como ensayo formato avanza la de 96 a 384 - a 1536-bien. Una forma de eludir este problema es mediante el uso de sensores permeable a la célula caspase fluorescente38 que permiten la detección de la activación de caspasas, evitando las complicaciones de la permeabilización celular y múltiples lavados5. Por otra parte, también es posible para reducir al mínimo pérdida de la célula empleando un método independiente de la centrifugación de las células se lavan por flujo laminar. Con una placa automatizada de lavado estación junto con la placa sin muros, las células se lavan por flujo laminar sin el uso de una centrífuga. La exponencial dilución de los reactivos permite el lavado exhaustivo y eficiente de células en menos de 3 minutos, lo que representa una dilución equivalente a dos rondas de lavado centrífugo. Sin tensiones externas debido a la centrifugación, las células son más viables y se reducen al mínimo las pérdidas de la célula.
También exploramos la posibilidad de utilizar la placa automatizada estación de lavado después de cultivo de los timocitos en U 96 pozos de fondo las placas y, también, el cultivo de células en las placas de pared menos compatibles con la placa automatizada estación de lavado. El cultivo de células en las placas de pared menos permitió la eliminación de todos los pasos de centrifugación y reduce al mínimo pérdida de la célula mediante la eliminación de la necesidad de una transferencia de la muestra a través de las placas. En general, los tres diferentes protocolos son comparables en eficacia de la estimulación y la coloración. La estación de lavado automatizado proporciona el beneficio de la automatización, la velocidad y eficiencia, lo que facilita el análisis de un mayor rendimiento. Además, con la automatización creciente, los pasos de lavado pueden realizarse más rápidamente, y hay una mayor consistencia entre los experimentos o experimentadores. Sin embargo, la estación de lavado tiene ciertos inconvenientes: grandes volúmenes de tampones de lavado se requieren para lavadora cebado (150 mL por cambio de tampón, de los cuales 50 mL se utiliza para lavarse); cuidado es necesario al manejar la placa para evitar cualquier contaminación de los pozos debido a la limitada repartir entre los pocillos de la placa de pequeño volumen; buffer residual de 25 μL en los pozos después de lavado requiere el uso de reactivos en un más alto que la concentración de 1 x. Para abordar las cuestiones de volumen residual y capacidad limitada de la placa, puede añadirse un accesorio para expandir el volumen de incubación de 70 μl a 150 μL, facilitar la adopción de protocolos convencionales. Mientras que los sistemas de manejo de placa automatizada están disponibles actualmente, tienen una huella significativa en comparación con el sistema de lavado laminar, que es una pequeña unidad de ~ 1 pie cúbico (~0.028 m3). Por otra parte, la integración de la centrifugación en placa automatizada de sistemas de manejo es un reto, limitando su uso en lavado de células. No hay ninguna otra célula de centrífuga independiente lavado instrumentos disponibles, por lo que sabemos.
La estrategia de proyección presentada aquí es capaz de identificar moléculas pequeñas y sus quinasas objetivo pretendido, que afectan la señalización del TCR y la activación del T-cell. La biblioteca utilizada aquí comprende principalmente moléculas pequeñas inhibidores de quinasas y fue capaz de generar un número potencialmente interesantes hits. El protocolo puede fácilmente aplicarse también a las bibliotecas de inhibidor de otras clases de enzima o a otros tipos de moléculas pequeñas, así como a bibliotecas de otros compuestos (por ejemplo, varias macromoléculas). El protocolo también puede utilizarse para detectar otros tipos de células, como linfocitos T periféricos o las células inmortalizadas, incluyendo aquellas expresan TCR transgénico o llevar sistemas de reportero. Identificación y caracterización de nuevos mediadores de células T de señalización puede mejorar nuestro conocimiento de la vía de señalización y también ayudar en el desarrollo de la terapia dirigida en enfermedades inmunitarias13,14,15, 16. en total, este estudio añade a la gama de opciones disponibles para la detección de mediadores de señalización a través de proyección de alto rendimiento análisis de T-cell.

Las células T son un linaje de linfocitos que desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la inmunidad adaptativa. Expresan el TCR, que les permite reconocer sus ligandos, complejos consisten en una molécula compleja de la histocompatibilidad (MHC) con un péptido encuadernado, que se encuentran en la superficie del antígeno que presenta las células (APCs). La activación del TCR de señalización a través de la interacción TCR/MHC es crucial para la activación del T-cell y desarrollo1.
En el desarrollo del T-cell, derivadas de médula ósea de células madre hematopoyéticas (HSCs) migran al timo, donde sufren diferenciación y pasar por las etapas del T-cell lineage progresión2. Los timocitos doble positivo (DP), expresar el CD4 y CD8 correceptores, comprometen con uno mismo-péptido/MHC de la APC. Timocitos con una moderada afinidad por sus ligandos de la uno mismo-péptido/MHC maduran para convertirse en los timocitos (SP) CD4 o CD8 positivo solo, un proceso denominado como selección positiva. Por el contrario, los timocitos que reciben excesiva estimulación del TCR a través de las uno mismo-peptide/MHCs experimentan apoptosis vía selección negativa3,4. Este proceso de la apoptosis inducida por estimulación, caspase-dependiente puede ser mímico en vitro por estimulación de los timocitos, por ejemplo con los granos recubiertos de anticuerpos anti-CD3/285. Las células T maduras que pasan el proceso de selección son activadas por ligandos no-self-péptido/MHC de la APC en la periferia. Uno mismo-peptide/MHCs son todavía relevantes para las células T periféricas, en el contexto de tónico para la supervivencia y proliferación homeostática, la diferenciación de las células T auxiliares y la mejora de las respuestas de células T a no-uno mismo-peptide/MHCs a través coagonism6,7,8,9. Enlace de TCR de alta afinidad para el ligando péptido/MHC activa varias vías de señalización corriente abajo, que incluyen muchas moléculas de señalización formando un complejo TCR señalización red10. Las vías de señalización del TCR se han estudiado durante varias décadas, y todavía el descubrimiento de nuevos mediadores de la vía no da señales de disminuir11,12. La modulación de vías de señalización del TCR tiene relevancia clínica y puede potenciar las respuestas de células T para aplicaciones inmunoterapia o la inhibición de las respuestas de células T para el control de la autoinmunidad13. Estrategias para la modulación de las respuestas de células T dependen principalmente de la interrupción de cinasa o fosfatasa actividad14,15,16.
Se describe una aplicación de un análisis basado en la citometría de flujo para la detección de pequeños compuestos químicos por su capacidad modular la señalización del TCR y de la activación de células T17. El ensayo se basa en el fenómeno de la activación de la vía de apoptosis cuando se exponen a fuertes señales TCR de los timocitos. El ensayo es suficientemente sensible para identificar cambios en la fuerza del estímulo; incubación de timocitos que expresan TCR transgénico con tetrámeros de péptido/MHC con el aumento de afinidad dio lugar a un aumento correspondiente en caspasa activación utilizado como una medida de la respuesta apoptótica del5. Para la pantalla, utiliza una biblioteca de inhibidores de la cinasa y evaluaron su capacidad para modular la respuesta del anti-thymocyte fuertes señales del TCR.
Se han descrito varias estrategias basado en la citometría de flujo o basadas en fluorescencia-reportero para el cribado de alto rendimiento de una variedad de fenotipos de activación periférica en diferentes subconjuntos de células T. Tales estrategias incluyen el uso de reporteros fluorescentes genéticos para determinar el momento y la magnitud de la activación de células T18, el uso de degranulación como una lectura de citotóxico t-célula actividad19,20y el análisis de la fosforilación de diversas proteínas implicadas en la señalización21celular.
El análisis de la proyección presentado aquí es capaz de identificar con éxito compuestos que inhiben la canónicas moléculas de señalización de la vía, así como potenciales, nuevos compuestos con efectos inhibitorios sobre la señalización del TCR TCR. Por ejemplo, consideran inhibidores de GSK3β y Hsp90 nuevos compuestos que afectan a las respuestas de células T17. El ensayo es capaz de distinguir los inhibidores que interfieren con la transducción de la señal, debido a una reducción en la respuesta apoptótica de los efectos de la TCR-independiente de los inhibidores sobre la toxicidad celular. Además de la inducción de la apoptosis, también medimos el upregulation de CD69 y downregulation del TCR como marcadores de la activación. Como TCR señalización redes son complejas, el uso de múltiples lecturas puede aumentar las posibilidades de descubrir moléculas con efectos específicos sobre una sola vía. Aquí, presentamos el uso de un protocolo independiente de la centrifugación como una alternativa de alto rendimiento en el protocolo original durante la tinción de las células en la preparación para el análisis de citometría de flujo. El ensayo descrito en el presente trabajo utiliza una pequeña biblioteca compuesta de inhibidores de la cinasa pero, en principio, puede ser utilizado para la detección de rendimiento superior. La biblioteca de elección también puede incorporar una variedad de inhibidores o de otras moléculas.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

El receptor de células T (TCR) señalización vía comprende una multitud de mediadores que transmiten señales sobre la activación del TCR. Diferentes estrategias han sido propuestos y aplicado para la identificación de nuevos mediadores de la señalización del TCR, que mejoraría la comprensión de los procesos T-cell, incluyendo activación y selección tímica. Se describe un ensayo de cribado que permita la identificación de moléculas que influyen en la TCR señalización basado en la activación del desarrollo de los timocitos. Señales de fuerte TCR provocan timocitos en desarrollo activar la maquinaria apoptótica en un proceso conocido como selección negativa. A través de la aplicación de inhibidores de la cinasa, los objetivos que afectan la señalización del TCR son capaces de anular el proceso de selección negativa. El método detallado en este documento puede utilizarse para identificar inhibidores de quinasas canónicas con papeles establecidos en las vías de señalización del TCR y también inhibidores de quinasas nuevo aún por establecerse en las vías de señalización del TCR. Aquí la estrategia de investigación se puede aplicar a pantallas de mayor rendimiento para la identificación de nuevas dianas druggable en la señalización del TCR.

El enfoque para el análisis de la investigación se resume en la figura 1A. Los inhibidores de la cinasa primero fueron defendidos por sus efectos latentes sobre viabilidad de timocitos. Como control positivo para apoptosis, dexametasona fue utilizada como un agente proapoptóticas. La compuerta para la población de células vivas se determinó con base en los controles negativos no tratados y los controles positivos tratados con dexametasona (figura 1B). Los inhibidores se probaron en 10 μm en timocitos, y se midió el porcentaje de células viables después de incubar durante 18 h. Una ventana de 20% de muerte celular fue elegida tales que los compuestos que indujo una mayor al 20% pérdida de células en la puerta de la célula viva, en comparación con las muestras tratadas con DMSO, se probaron en concentraciones más bajas (figura 1B). Parcelas representativas FACS tratados con inhibidor de las muestras seleccionadas se muestran para ilustrar el análisis de viabilidad. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), un inhibidor de PI3K22, no aumentar considerablemente la muerte celular en 10 μm, y el inhibidor fue utilizado en 10 μm para los ensayos posteriores. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), un inhibidor dual de PI3Kα/mTOR23, inducida por altos niveles de muerte celular en 10 μm y 1 μm pero no a 0.1 μm y 0,1 μm se determinó la concentración adecuada para su aplicación en ensayos posteriores. Estaurosporina (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), un inhibidor de la cinasa C de proteína pan con una capacidad establecida para inducir apoptosis24, indujo muerte celular importante en todas las concentraciones probadas, incluso a 0.1 μm. Fue utilizado en los ensayos posteriores en 0.1 μm como control positivo adicional.
Las concentraciones finales de los inhibidores se seleccionaron con base en las concentraciones más altas en donde ellos no amplifican muerte celular por más de 20% de las muestras tratadas con DMSO. Con las concentraciones finales de los inhibidores determinados, un plato común de inhibidores se preparó tal que todos los inhibidores fueron 500 veces la concentración cuando se aplica a las células. Figura 1 ilustra el diseño de la placa de la placa común, con las concentraciones finales de los inhibidores. En el protocolo alternativo de incubación las células directamente en placas de pequeño volumen para el ensayo de lavado de flujo laminar, el uso de pequeños volúmenes requería una mayor dilución de los inhibidores de la. Para asegurarse de que el contenido de DMSO de las culturas después de adición de inhibidor no sería demasiado alto para las células, los inhibidores fueron aún más diluidos en RPMI completo, por un factor de dilución de 5, que estaban en 100 veces la concentración prevista cuando se aplica a la células.
Los inhibidores, diluidos a concentraciones no tóxicas, fueron utilizados en el ensayo para TCR-estimulación-induced apoptosis en timocitos5,17. La estimulación se realizó con anti-CD3/CD28 granos durante 18 h, y posteriormente se tiñeron las células para la activación de la caspasa-3 en el CD4+ y CD8+ DP población de timocitos (figura 2). Se observaron un aumento en la activación de caspasa-3 y expresión de CD69 y también un downregulation del TCR, en el anti-CD3/CD28-estimulados y las tratados con DMSO y mofa de anti-CD3/28-estimulados muestras, en comparación con las muestras nonstimulated. Las muestras tratadas con dexametasona mostraron un aumento en la activación de caspasa-3 independiente de upregulation de CD69, que se espera el efecto de inducción de apoptosis independiente de la estimulación del TCR.
Figura 3A resume los resultados de la biblioteca de investigación análisis de inhibidores de los. Activación de la caspasa-3 y CD69 pueden utilizarse para identificar inhibidores potenciales de interés debido a la supresión de la expresión. Como era de esperar, inhibidores de mediadores canónicas de la señalización del TCR demostraron para arriba como positivos resultados en las pantallas. Estos inhibidores, que exhiben diferentes grados de potencia inhibitoria, incluyen inhibidores de amplio espectro que atacan múltiples cinasas y, también, más inhibidores específicos. Algunos inhibidores fueron capaces de suprimir la activación de caspasa-3 y upregulation de CD69 (figura 3B, fila superior, paneles de la izquierda). Un tal inhibidor es bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), que inhibe todas isoformas de cinasa C de proteína, además de kinase de proteína A y PDK125,26,27. Otro inhibidor de esta categoría es CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), un inhibidor de la propuesta de IKK228.
Había compuestos que inhibición upregulation de CD69 pero no afectar a la activación de caspasa-3 (figura 3B, fila superior, derecha paneles). CAY10626, un inhibidor de PI3Kα y mTOR23y U-0126 (2, 3-bis [amino [(2-aminophenyl) tio] metileno]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), un inhibidor de la MEK29, fueron algunos de los inhibidores identificados. Los resultados muestran que diferentes inhibidores dirigidos a diferentes quinasas de ramas específicas de la vía de señalización del TCR, especialmente aquellos dirigidos a las quinasas de la última etapa, pueden resultar en el deterioro selectivo de los fenómenos de activación del T-cell.
También fueron los inhibidores que no suprimió upregulation de CD69 y activación de caspasa-3 (figura 3B, fila inferior, paneles de la izquierda). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - hidroxi-ácido benzenepropanoic, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , ester 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl; CAS 33069-62-4), un disruptor de microtubule dynamics30y necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), un inhibidor de la cinasa de RIP131, son dos inhibidores identificados en esta categoría. En tales casos donde upregulation de CD69 y activación de caspasa-3 no fueron deterioradas, esto puede debido a los inhibidores no apuntando a una quinasa relevante del TCR vía de señalización.
Como se mencionó anteriormente, staurosporina fue utilizado en las pantallas, en una concentración que todavía indujo apoptosis en los timocitos. Como era de esperar, la muestra tratada con staurosporina mostraron altos niveles de activación de la caspasa-3 (figura 3B, fila inferior, la columna de la derecha). Los niveles bajos de expresión de CD69 pueden atribuirse a la estaurosporina mediada por la inhibición de PKC, como bisindolylmaleimide II, otro inhibidor de la PKC de pan, también suprime la expresión de CD69. Alternativamente, staurosporina indujo apoptosis en las células antes de que fueran capaces de alza la expresión de CD69.
Para aumentar el rendimiento y la automatización del Protocolo, se prepararon protocolos paralelos que implicó el uso de una placa automatizada de lavado sistema mediante flujo laminar. Dos protocolos separados usando este dispositivo de lavado automático de la placa fueron probado y Comparado con el método convencional de cultivo de células en placas de 96 pocillos y tinción de las células en un protocolo dependiente de la centrifugación. Un método consistía en cultivar las células en placas de 96 pocillos, según el procedimiento estándar, y luego, transferir las células a las placas compatibles con la arandela de placa automatizada para tinción (figura 4, las muestras de lavado DA). El otro método consistía en cultivar las células directamente en las placa-arandela-compatible con placas y continuando con el protocolo de tinción en la misma placa (figura 4, las muestras DA cultura). Los protocolos de centrifugación-independiente no da muchas diferencias perceptibles en caspasa-3 activa, CD69 y TCRβ tinción a través de las diferentes muestras analizadas, en comparación con el protocolo dependiente de la centrifugación convencional (figura 4). Diferencias en la intensidad de la tinción pueden atribuirse al uso de anticuerpos en concentraciones ligeramente diferentes durante los pasos de tinción.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figura 1 : Viabilidad de timocitos después del tratamiento con inhibidores de la. (A) esquema Experimental de los pasos más importantes en el análisis de la proyección. Hay tres métodos propuestos para la estimulación y la coloración de los timocitos en el ensayo de activación, es decir, (1) el cultivo de los timocitos en placas de 96 pocillos estándar, seguidos por la coloración mediante un protocolo basado en la centrifugación convencional, (2) el cultivo de los timocitos en placas de 96 pocillos estándar, seguidos de tinción utilizando un protocolo de lavado independiente de la centrifugación y (3) el cultivo de los timocitos en placas de pequeño volumen, seguido por la coloración de las placas mismas utilizando un Protocolo de lavado independiente de la centrifugación. (B) compuerta estrategias utilizadas en los ensayos de viabilidad. La puerta de la vivo de la célula se deriva del forward scatter (FSC) y diagramas scatter (SSC) de lado, como se describió anteriormente17. Inhibidores que se consideran demasiado tóxicos en la concentración probada fueron objeto de más análisis de viabilidad en concentraciones menores de 10 veces. Se presentan muestras representativas tratados con inhibidor. Nota el control común (tratados con DMSO [DMSO]) utilizado para 1 μm y 0,1 μm muestras. (C) diseño de placa de los inhibidores de la diluida. Una representación esquemática de las placas de inhibidores diluidos en DMSO a una concentración de 500 x la concentración final deseada. Cada uno representa así un único inhibidor; los pozos de gris están vacíos. Las concentraciones que se muestran son la concentración final cuando se agrega a los cultivos celulares, es decir, 10 μm (rojo oscuro) (fucsia) 1 μm y 0,1 μm (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figura 2 : Diseño de placa de la prueba de activación del anti-thymocyte. (Top) Columnas 1 y 12 son reservados para los controles, mientras que las columnas 2 a 11 son tratados con inhibidor de muestras (beige). El control negativo (nonstimulated [NS]; gris) ocupa pozos A1 a D1, y el control positivo para muerte celular (tratados con dexametasona [DEX]; púrpura) ocupa pozos E1 H1. Las columnas 2 a 12 contienen timocitos estimulados con anti-CD3/CD28 granos. El control positivo para la activación de timocitos (muestras estimuladas [α-CD3/CD28]; verde) ocupa pozos A12 a D12 y el control del vehículo (estimulado y tratados con DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]; rojo) ocupa pozos E12 a H12. (Parte inferior) Flow cytometry parcelas activa caspase-3 (ActCasp3), CD69 y TCRβ tinción de timocitos cerrados dentro de la puerta de doble-positivo (DP). Parcelas representativas de los diferentes controles se muestran. NS = nonstimulated; DEX = muestras tratadas con dexametasona; Α-CD3/CD28 + DMSO = las muestras estimuladas con granos de CD3/CD28-revestido y tratados con DMSO; Α-CD3/CD28 = muestras estimuladas con CD3/CD28-cubierto de granos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figura 3 : Proyección de la biblioteca de inhibidor de la activación del anti-thymocyte. (A) resume datos de la prueba de activación. Estos son los resultados de un experimento representativo mostrando los valores normalizados de las células y expresión de CD69 seleccionados inhibidores de caspasa-3 activa. Normalización se realizó comparando el porcentaje de células en la activa caspase-3 positivo o CD69 positivo cancela el valor del control tratados con DMSO, que se establece en un valor relativo de 0 en el gráfico. (B) seleccionado FACS parcelas. Parcelas de citometría de flujo de inhibidores que suprimieron la activación de caspasa-3 y upregulation de CD69 (arriba izquierda), había suprimido sólo upregulation de CD69 (arriba a la derecha), o no tuvo efecto sobre la activación de caspasa-3 y upregulation de CD69 (inferior izquierda). Parcelas de la muestra tratada con staurosporina se muestran para ilustrar los efectos de la utilización de un inhibidor en concentraciones tóxicas (abajo a la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figura 4 : Comparación de los protocolos de ensayo diferentes. Flujo cytometry parcelas activa caspase-3 (ActCasp3), CD69, y TCRβ tinción de los timocitos DP después de los tres diferentes protocolos de ensayo. Se prueban cuatro condiciones diferentes, a saber, el control negativo (nonstimulated [NS]), el control positivo para muerte celular (tratados con dexametasona [DEX]), el control del vehículo (estimulado y tratados con DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) y tratados con un inhibidor de la muestra (estimulado y PIK-75-tratado [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Convencional = el cultivo de los timocitos en placas de 96 pocillos estándar y la coloración con un protocolo basado en la centrifugación convencional; Lavado de DA = el cultivo de los timocitos en placas de 96 pocillos estándar y manchando con un flujo laminar lavado protocolo; DA cultura = cultivo de timocitos en placas de pequeño volumen y coloración de las placas mismas usando un protocolo de lavado de flujo laminar.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Este papel utiliza un ensayo basado en la citometría de flujo para las bibliotecas de la pantalla de inhibidores químicos para la identificación de los inhibidores y los objetivos que influyen en la del receptor de células T de señalización. Los métodos descritos aquí pueden ampliarse también para proyecciones de alto rendimiento.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Nuestro ensayo de alto rendimiento se suma a los métodos disponibles para la identificación de moléculas pequeñas y sus objetivos que modulan la señalización TCR y la activación de células T. Nuestro ensayo tiene un aspecto autocorridente a través de la filtración de compuestos tóxicos y la identificación de inhibidores de la señalización TCR y la apoptosis inducida por la estimulación. La identificación de mediadores de la señalización TCR puede ayudar en el desarrollo de la terapia para enfermedades inmunitarias.Proporcionamos un fuerte estímulo para los timocitos derivados de ratones TCR-policlonal. Es posible utilizar ratones transgénicos TCR y estimularlos con otros tetrámeros de ligando péptidos para una estimulación más débil. Este ensayo implica el uso de pequeños volúmenes y de placas de pequeño volumen para el cultivo de las células.Esto requiere un manejo cuidadoso de las placas y su contenido. Hay muchos compuestos en la biblioteca de inhibidores de la quinasa que se consideran peligrosos. Por motivos de seguridad, trate todos los compuestos como igualmente peligrosos y siga las precauciones de seguridad recomendadas por el proveedor.Para comenzar el tratamiento de los timocitos con inhibidores de la quinasa, utilice una pipeta multicanal para añadir 40 microlitros por pozo de timocitos a una placa de pequeño volumen. Pon el plato en hielo. A continuación, pipetear una parte de los inhibidores de la quinasa, DMSO y dexametasona, y cuatro partes del medio RPMI completo en una placa de 96 pozos.Designar ocho pozos de la placa de pequeño volumen a los controles no tratados, cuatro pozos a controles positivos tratados con dexametasona para la muerte celular mediante la adición de la dexametasona diluida a la concentración de cinco micromolares, y cuatro pozos a los controles tratados con vehículos, mediante la adición de 0,5 microlitros de la DMSO diluida. A continuación, a partir de los pozos correspondientes de la placa inhibidora, añadir 0,5 microlitros de cada inhibidor diluido a la placa de 96 pozos. Para comenzar la estimulación de los timocitos, primero asegúrese de que las perlas anti-CD-3 y CD-28 estén suspendidas uniformemente.A continuación, lave un mililitro de las cuentas con dos mililitros del tampón PBS. Coloque el tubo en un soporte magnético para separar las perlas del sobrenadante y aspirar la solución. A continuación, vuelva a suspender las perlas en un mililitro del medio RPMI completo.Agregue 10 microlitros por pozo de la suspensión del cordón a cada muestra tratada con inhibidores, las cuatro muestras tratadas con DMSO y cuatro de las ocho muestras no tratadas. Agregue 10 microlitros de la RPMI completa a los cuatro pozos no tratados restantes. Utilice un agitador orbital de microplaca para agitar suavemente la placa.A continuación, incubar los timocitos en 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 17 a 20 horas, o durante la noche. En primer lugar, una arandela automática de placas de flujo laminar, primero con 150 mililitros de solución Tween de etanol, luego con agua desionizada complementada con 1%Tween 20, y finalmente, con tampón de lavado FACS. Al final de la incubación con el sistema de lavado de placas, lave la placa con la tampón de lavado FACS utilizando un ciclo de lavado nueve veces.Cada lavado añade y elimina 55 microlitros de tampón de lavado por flujo laminar, lo que resulta en una dilución exponencial de los reactivos en los pozos. Para manchar los antígenos superficiales, primero diluya un volumen unitario de anticuerpos anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 y anti-CD-69 en volúmenes de 100 unidades del tampón de lavado FACS. Luego vuelva a suspender las células en 25 microlitros de la mezcla de anticuerpos de tinción.Utilice un agitador orbital de microplaca para agitar suavemente la placa y luego deje la placa sobre hielo durante 30 minutos. Para fijar las células, primero lave la placa con 55 microlitros de tampón de lavado FACS utilizando un ciclo de lavado nueve veces como se describió anteriormente. A continuación, agregue 50 microlitros del búfer de fijación-impermeablización a cada pozo.Mezclar bien e incubar la placa sobre hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, preparar una perm de una X y un tampón de lavado diluyendo 25 mililitros del stock 10X proporcionado en 225 mililitros de agua Ultrapura. Enaprecia la arandela de placas con un tampón de X y lave la placa con 55 microlitros del tampón one-X utilizando un ciclo de lavado de nueve veces como se describió anteriormente.Para comenzar, mezcle un mililitro del anticuerpo anti-caspasa 3 con dos mililitros de la perm de uno X y el tampón de lavado. Añadir 25 microlitros por pozo de la mezcla a las células fijas. Utilice un agitador orbital de microplaca para agitar suavemente la placa.Deje el plato sobre hielo durante una hora. Al final de la incubación, repita el paso de lavado nueve veces con la perm de uno-X y el tampón de lavado. A continuación, agregue 25 microlitros del tampón de lavado FACS a todos los pozos de la placa.Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar la solución. Por último, transfiera las muestras mezcladas a tubos de microtíter. Remate los tubos con el tampón de lavado FACS a un volumen total de 200 microlitros, y proceda al análisis de citometría de flujo.Tras la estimulación anti-CD-3, CD-28, se observó un aumento en la activación de la caspasa-3 y la regulación de la regulación del TCR tanto en las muestras no tratadas como en las muestras tratadas con simulacros DMSO. Además, se observó un aumento de la expresión de CD-69 en ambas muestras estimuladas. Las muestras tratadas con dexametasona mostraron un aumento en la activación de la caspasa-3 independiente de la regulación ascendente de CD-69, como se esperaba para el efecto inductor independiente de la apoptosis y la estimulación de TCR.El deterioro selectivo de los fenómenos de activación de células T fue mostrado por diferentes inhibidores que suprimieron tanto la activación de la caspasa-3 como la actualización de CD-69, o inhibieron la actualización de CD-69, pero no afectaron la activación de la caspasa-3. También hubo inhibidores que no apuntaban a una quinasa relevante de la vía de señalización TCR, y por lo tanto no suprimieron tanto la regulación ascendente CD-69 como la activación de la caspasa-3. El resultado de la pantalla de la estaurosporina, el control apoptosis-positivo, mostró altos niveles de activación de la caspasa-3, como se esperaba.Sin embargo, el resultado también mostró bajos niveles de expresión de CD-69 que se pueden atribuir a su inhibición mediada de la proteína quinasa C o a su apoptosis inducida antes de la expresión cd-69. La comparación de diferentes protocolos de ensayo no mostró diferencias en la tinción activa de caspasa-3, CD-69 y TCR del control negativo, el control positivo de la muerte celular, el control del vehículo y una muestra tratada con inhibidores. Las etapas de pre-incubación están destinadas a facilitar el uso de la placa de pequeño volumen para el cultivo de las células.El protocolo estándar dependiente de la centrífuga también se proporciona en el manuscrito. Los inhibidores o objetivos potencialmente interesantes pueden ser validados usando diferentes tipos de células y también en diferentes especies, como linfocitos de ratón pagoféricos o células primarias humanas. La caracterización posterior de las moléculas identificadas y los objetivos puede ayudar a mejorar la comprensión de la biología de las células T y ampliar los posibles objetivos de la inmunomodulación.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Investigación

Inmunología e Infección

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...