Name: identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från Singapore hälsoministeriets nationella medicinska forskningsrådet, NMRC CBRG15may017 och den Singapore ministeriet för utbildning, 2014-T2-1-136 (till N.R.J.G.).

6 - 8 vecka-gamla manliga och kvinnliga C57Bl/6 möss användes i denna studie. Mössen var uppvuxna i djuranläggningen vid National University of Singapore (Singapore). National University of Singapore institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) godkände alla djurförsök.
1. beredning av Thymocyte Suspension
<ol><li>Euthanize mössen i en CO2 kammare.</li>
	<li>Utför följande steg i vävnadsodling huva att undvika kontaminering av cellkulturer. Säkra mus kadaver dissekering styrelsen, använda pins, och spraya musen med 70% etanol.</li>
	<li>Använda ett par sax, göra ett vertikalt snitt på ventrala sida, start från buken mot käken. Göra ytterligare snitt längs varje av bakbenen. Sträck ut huden för att exponera bröstkorgen och fästa den.</li>
	<li>Skär membranet och båda sidor av bröstkorgen från den bakre änden med en sax. Lyft bröstkorgen och fästa den ner till exponera tymus. Separat bindväv bifogas bräss och extrahera bräss använder ett par böjda pincetten.</li>
	<li>Placera bräss i en väl 6-well platta innehållande 5 mL komplett RPMI media. Överväg att lägga till 10% träkol-skrapat fetalt bovint serum (FBS) i media för att förbättra thymocyte lönsamhet om en lång väntetid förväntas mellan dissektion och stimulering analysen.</li>
	<li>Försiktigt mosa tymus, med den trubbiga änden av en spruta, och passera cellerna genom en sil med 70 µM i cellen. Alternativt, samla in tymocyter i friskare skick, överväga att använda två par pincett att pressa bräss och samla tymocyter det flöden av thymic epitel.</li>
	<li>Gå vidare till cell räkna, med en hemocytometer eller en automatiserad cell räknar instrumentet.</li>
</ol>2. titrering av kinashämmare giftfritt koncentrationer
Obs: Detta avsnitt fokuserar på att förbereda hämmare för användning i T-cells aktivering skärmarna. -Hämmare som används vid höga koncentrationer kan orsaka celldöd, vilket är en avläsning av T-cells aktivering skärmarna. Serien av spädningar av hämmare syftar till att fastställa den slutliga koncentrationen av de enskilda hämmare som inte bör inducerar apoptos oberoende av TCR stimulering. Biblioteket av kinashämmare som används i denna studie köptes från en extern leverantör. Listan över hämmare ingår i Tabell för material.
<ol><li>
Beredning av plattor av kinashämmare vid lägre koncentrationer
	<ol>
<li>För att förbereda en tallrik hämmare på 1 mM, tillsätt 10 µL av hämmare till 90 µL av dimetyl sulfoxid (DMSO) för alla-hämmare. Obs: Hämmare från småmolekylär biblioteket som används i denna studie kommer ett lager koncentration av 10 mM. Om hämmare i pellets form, följ Rekommenderad beredning stegen från leverantörer. Om hämmare inte tillhandahålls på 10 mM, förbereda hämmare plattorna vid alternativa lämpliga koncentrationer istället och förbereda separat seriespädningar av hämmare med en lämplig utspädningsfaktor. Varning: I fall av giftiga hämmare, följ tillverkarens instruktioner för säker hantering och kassering.</li>
		<li>För att förbereda en tallrik hämmare på 0,1 mM, Lägg till 10 µL av hämmare från plattan av 1 mM-hämmare till 90 µL av DMSO.</li>
		<li>För att förbereda en tallrik hämmare på 0,01 mM, Lägg till 10 µL av hämmare från plattan av 0,1 mM-hämmare till 90 µL av DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandling av tymocyter med kinashämmare
	<ol>
<li>Förbereda en thymocyte suspension enligt avsnitt 1.</li>
		<li>Späd tymocyter i komplett RPMI att erhålla en thymocyte suspension 5 x 106 celler/ml.</li>
		<li>Tillsätt 200 µL thymocyte suspension till alla brunnar i en plattan med 96 brunnar, med hjälp av en flerkanalspipett.</li>
		<li>I varje brunn, tillsätt 2 µL av hämmare från motsvarande väl av plattan innehåller 1 mM-hämmare (hämmare slutliga koncentration är 10 µM).</li>
		<li>I samma platta, förbereda fyra brunnar i obehandlade kontroller, fyra brunnar av 5 µM dexametasonbehandlade positiva kontroller och fyra brunnar i fordonet-behandlade negativa kontroller, genom att lägga till 2 µL av DMSO.</li>
		<li>Inkubera i tymocyter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 17-20 h (eller över natten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestämning av lämplig koncentration av enskilda hämmare
	<ol>
<li>Snurra plätera av tymocyter vid 300 x g och 4 ° C, för 5 min. resuspendera cellerna i 250 µL FACS tvättbuffert.</li>
		<li>Kör en flöde flödescytometrisk analys av proverna och analysera resultaten med en flöde flödescytometri analysprogram.</li>
		<li>Bestämma procentandelen av levande celler baserat på FSC-SSC gating. Usenets strategin visas i figur 1B.</li>
		<li>Beräkna procentandelen av levande celler baserat på DMSO-behandlade kontrollerna, som är normaliserade till 100% i genomsnitt. Ställ in en godtycklig fönster godtagbar celldöd (e.g.,20%). Hämmare som resulterade i en procentandel av levande celler nedanför fönstret (dvs., under 80% av DMSO-behandlade kontrollerna) kommer att testas igen vid lägre koncentrationer.</li>
		<li>För de hämmare som inte klarade lönsamhetskriterierna i steg 2.3.4, upprepa steg från trappan 2.2.1 - 2.3.4, men använda plattan-hämmare på 0,1 mM steg 2.2.4 i stället för plattan innehåller de 1 mM-hämmare. Den slutliga koncentrationen av-hämmare som används här är 1 µM.</li>
		<li>För de hämmare som fortfarande producera höga nivåer av celldöd vid 1 µM, testa hämmare på 0.1 µM. Upprepa steg 2.2.1 - 2.3.4, men använda plattan-hämmare på 0,01 mM i steg 2.2.4. Den slutliga koncentrationen av-hämmare som används här är 0.1 µM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Förberedelse av ett lager platta av kinashämmare
	<ol>
<li>För-hämmare ska användas vid 10 µM, Lägg till 10 µL 10 mM-hämmare till 10 µL av DMSO.</li>
		<li>För-hämmare ska användas vid 1 µM, tillsätt 1 µL 10 mM-hämmare i 19 µL av DMSO.</li>
		<li>För-hämmare ska användas vid 0.1 µM, lägga till 1 µL 10 mM-hämmare i 199 µL av DMSO (figur 1 c). Obs: Beredda stock plätera av hämmare är 500 x koncentrationen av avsedda slutliga koncentration när läggas till de thymocyte suspensioner. Beståndet plätera av hämmare kan förberedas PCR remsor eller i 96 brunnar.</li>
		<li>Beståndet plätera av kinashämmare kan tillämpas på tymocyter för screening i ett konventionellt centrifugering-beroende system (avsnitt 3; se figur 1A, metoderna 1 och 2) eller i ett alternativt centrifugering-oberoende system (avsnitt 4; se Figur 1A, metod 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kinase Inhibitor bibliotek Screening (konventionella centrifug-baserad analys)
<ol><li>
Behandling av tymocyter med kinashämmare
	<ol>
<li>Förbereda en thymocyte suspension enligt avsnitt 1.</li>
		<li>Späd tymocyter i komplett RPMI att erhålla en thymocyte suspension 5 x 106 celler/ml.</li>
		<li>Tillsätt 200 µL av tymocyter till varje brunn en plattan med 96 brunnar, med hjälp av en flerkanalspipett. Placera plattan på is.</li>
		<li>Lägg till 0,5 µL av hämmare till plattan med 96 brunnar från motsvarande brunnarna lager Skyltens hämmare beredd i avsnitt 2.4.</li>
		<li>Förbered åtta brunnar i obehandlade kontroller. Förbereda fyra brunnar i fordonet-behandlade kontrollerna genom att lägga till 0,5 µL av DMSO. Förbereda fyra brunnar av 5 µM dexametasonbehandlade kontroller (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulering av tymocyter använder anti-CD3/CD28 pärlor
	<ol>
<li>Ta 1 mL av pärlor och tvätta pärlorna med 2 mL PBS. Separera pärlorna med hjälp av en magnetisk stå och aspirera lösningen. Återsuspendera pärlorna i 5 mL komplett RPMI. Obs: Förhållandet mellan pärlor till celler är 1 till 2,5. Justera mängden pärlor att ta, beroende på antalet brunnar att stimulera och antalet tymocyter används.</li>
		<li>Tillsätt 50 µL pärlor i varje hämmare-behandlade prov, de fyra DMSO-behandlade proverna och fyra av de åtta obehandlad proverna. Tillsätt 50 µL komplett RPMI i de återstående fyra obehandlade brunnarna. Figur 2 visar den allmänna layouten för plattan.</li>
		<li>Blanda innehållet i brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett.</li>
		<li>Inkubera i tymocyter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 17-20 h (eller över natten).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färgning av ytantigener
	<ol>
<li>Förbereda en antikropp färgning blandning som innehåller anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 och anti-CD69 antikroppar. Späd antikroppar i FACS tvättbuffert (PBS kompletteras med 0,5% bovint serumalbumin [BSA]) i förhållandet 1: 200 (v/v). Överväg att optimera antikroppsnivåerna var används för färgningen, istället för att använda fasta antikropp utspädningar, att minimera variationen i färgning över olika experiment och att förbättra signal-brus-förhållandet.</li>
		<li>Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min.</li>
		<li>Svep på plattan för att kassera lösningen.</li>
		<li>Vid denna punkt, protokollet kan följa protokollet konventionella centrifug-beroende (gå vidare till steg 3.3.5; Se figur 1A, metod 1) eller alternativa centrifugering-oberoende protokollet (gå vidare till steg 4.4.4; se figur 1A, metod (2).</li>
		<li>Att resuspendera cellerna i 75 µL färgning antikropp blandningen bereddes i steg 3.3.1.</li>
		<li>Blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera dem på is i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixering av celler
	<ol>
<li>Tvätta brunnarna med 200 µL FACS tvättbuffert och snurra plattan på 300 x g - och 4 ° C, för 5 min.</li>
		<li>Svep på plattan för att kassera lösningen.</li>
		<li>Lägg till fixering/permeabilisering buffert (kommer med aktiv kaspas-3 apoptos kit; samma med 10 x perm/tvättbuffert nämns i steg 3.5.1 och anti-kaspas-3 antikroppen i steg 3.5.2) på 200 µL per brunn.</li>
		<li>Inkubera i isen i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intracellulära färgning för aktiva kaspas 3
	<ol>
<li>Laga 1 x perm/tvättbuffert genom att späda ut 5 mL 10 x perm/tvättbuffert i 45 mL ultrarent vatten.</li>
		<li>Förbereda intracellulära aktiva kaspas fläcken genom att lägga till 1,3 mL anti-kaspas-3 antikropp 6,5 mL 1 x perm/tvättbuffert. Förhållandet av antikropp till perm/tvätt buffert är 1:5.</li>
		<li>Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Flick plattan att kassera lösningen. Tvätta plattan med 200 µL 1 x perm/tvättbuffert.</li>
		<li>Upprepa steg 3.5.3.</li>
		<li>Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min. Flick plattan att kassera lösningen. Tillsätt 75 µL av intracellulära kaspas fläcken bereddes i steg 3.5.2 i alla brunnar.</li>
		<li>Blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera på is för 1 h.</li>
		<li>Tvätta av prov med 200 µL 1 x perm/tvättbuffert och snurra plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min.</li>
		<li>Svep på plattan för att kassera lösningen. Tvätta plattan med 200 µL 1 x perm/tvättbuffert. Snurra på plattan på 300 x g och 4 ° C, för 5 min.</li>
		<li>Svep på plattan för att kasta lösningen och återsuspendera proverna i 200 µL FACS tvättbuffert.</li>
		<li>Kör en flöde flödescytometrisk analys av proverna och analysera resultaten med en FACS analysprogram.</li>
		<li>Använder en CD4 och CD8 tomt, gate på DP tymocyter befolkning med ett positivt uttryck för både CD4 och CD8 (figur 2, nedre halvan). Inom DP thymocyte porten, bestämma procentandelen av celler med aktiverade kaspas-3, med ostimulerade provet som negativ kontroll och dexametason som positiv kontroll. För analys av uttryck för CD69 i utfärda utegångsförbud för DP-thymocyte, använda ostimulerade provet som den negativa kontrollen och stimulerad provet som positiv kontroll. Obs: När gating på de DP tymocyter, kontrollera att befolkningen i DP tymocyter är gated korrekt för enskilda prover. Stimuleras cellerna downregulate ytan coreceptors och en oavsiktlig uteslutande av händelser kan uppstå om en tight DP-porten används.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. kinase Inhibitor bibliotek Screening (centrifug-oberoende analys)
<ol><li>
Behandling av tymocyter med kinashämmare
	<ol>
<li>Förbereda en thymocyte suspension enligt avsnitt 1.</li>
		<li>Späd tymocyter i komplett RPMI att erhålla en thymocyte suspension 25 x 106 celler/ml.</li>
		<li>Tillsätt 40 µL av tymocyter till varje brunn små volymer platta, med hjälp av en flerkanalspipett. Placera plattan på is.</li>
		<li>Späd hämmare från lager platta, DMSO och dexametason i komplett RPMI i fyra delar av komplett RPMI förhållandet till en del av hämmare/DMSO/dexametason (utspädningsfaktor 5). Obs: Eftersom de volymer som används i denna små volymer platta 5 x mindre än i den konventionella metoden, hämmare och kontroll Reagenserna skall spädas ut fivefold innan de läggs till i tymocyter i plattan.</li>
		<li>Tillsätt 0,5 µL av hämmare till plattan med 96 brunnar från motsvarande brunnarna Skyltens hämmare bereddes i steg 4.1.4.</li>
		<li>Förbered åtta brunnar i obehandlade kontroller. Förbereda fyra brunnar i fordonet-behandlade kontrollerna genom att lägga till 0,5 µL av den DMSO som bereddes i steg 4.1.4. Förbereda fyra brunnar av 5 µM dexametasonbehandlade kontroller, använda den utspädda dexametason som bereddes i steg 4.1.4 (figur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulering av tymocyter använder anti-CD3/CD28 pärlor
	<ol>
<li>Kontrollera att pärlorna är enhetligt resuspended. Ta 1 mL av pärlor och tvätta dem med 2 mL PBS. Separera pärlorna med hjälp av en magnetisk stå och aspirera lösningen. Återsuspendera pärlorna i 1 mL av komplett RPMI. Obs: Förhållandet mellan pärlor till celler är 1 till 2,5. Justera mängden pärlor, beroende på antalet brunnar att stimulera och antalet tymocyter används.</li>
		<li>Tillsätt 10 µL pärla suspension varje hämmare-behandlade prov, de fyra DMSO-behandlade proverna och fyra av de åtta obehandlad proverna. Tillsätt 10 µL av komplett RPMI till resterande fyra obehandlade brunnarna. Figur 2 visar layouten allmänna plattan. Obs: Sista volymen av brunnarna är 50 µL, som ligger inom den maximala kapaciteten av brunnarna. Det är viktigt att vara försiktig och hålla plattorna upprätt, att undvika cross-väl spill.</li>
		<li>För att blanda, skaka plattan orbital skakapparat mikroplattan. Du kan också blanda innehållet i brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett.</li>
		<li>Inkubera i tymocyter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 17-20 h (eller över natten) med anti avdunstning lock.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inställning av plattan brickan Obs: Instruktionerna för att ställa in plattan brickan tillhandahålls av tillverkaren. Stegen nämns i korthet nedan. För varje priming steg behövs ungefär 150 mL lösning.<ol>
<li>Prime Tvättsystemet med 70% etanol innehållande 1% Tween-20.</li>
		<li>Prime Tvättsystemet med avjoniserat vatten innehållande 1% Tween-20.</li>
		<li>Prime Tvättsystemet med FACS tvättbuffert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färgning av ytantigener
	<ol>
<li>Förbereda en antikropp färgning blandning som innehåller anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 och anti-CD69 antikroppar. Späd antikropparna i FACS tvättbuffert i förhållandet 1: 100 (v/v).</li>
		<li>Tvätta plattan 9 x, med 55 µL FACS tvättbuffert per tvätt, med hjälp av den automatiska laminärt flöde tvättsystem. Obs: I slutet av tvättarna, det blir 25 µL av resterande volym i varje brunn.</li>
		<li>Att resuspendera cellerna i 25 µL av färgning antikropp blandningen bereddes i steg 4.4.1.</li>
		<li>Om proverna överförs från en plattan med 96 brunnar (från steg 3.3.4), resuspendera cellerna i 50 µL av antikropp blandningen bereddes i steg 3.3.1 och överför proverna till små volymer plattan. Detta steg motsvarar metod nummer 2, som avbildas i figur 1A.</li>
		<li>Att blanda, skaka plattan med en mikroplattan orbital shaker eller blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera på is i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixering av celler
	<ol>
<li>Tvätta plattan 9 x, med 55 µL FACS tvättbuffert per tvätt, med hjälp av den automatiska laminärt flöde tvättsystem.</li>
		<li>Lägg till fixering/permeabilisering buffert (kommer med aktiv kaspas-3 apoptos kit; samma med 10 x perm/tvättbuffert nämns i steg 4.6.1 och anti-kaspas-3 antikroppen i steg 4.6.2) på 50 µL per brunn.</li>
		<li>Inkubera i isen i 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intracellulära färgning för aktiva kaspas 3
	<ol>
<li>Laga 1 x perm/tvättbuffert genom att späda ut 25 mL 10 x perm/tvättbuffert i 225 mL av ultrarent vatten.</li>
		<li>Förbereda intracellulära aktiva kaspas fläcken genom att tillsätta 1 mL anti-kaspas-3 antikropp i 2 mL 1 x perm/tvättbuffert. Förhållandet av antikropp till perm/tvätt buffert är 1:2.</li>
		<li>Prime Tvättsystemet med 1 x perm/tvättbuffert.</li>
		<li>Tvätta plattan 9 x med 1 x perm/tvättbuffert, på 55 µL för varje tvätt.</li>
		<li>Tillsätt 25 µL av intracellulära kaspas fläcken bereddes i steg 4.6.2 i alla brunnar.</li>
		<li>Att blanda, skaka plattan med en mikroplattan orbital shaker eller blanda proverna med hjälp av en flerkanalspipett och inkubera på is för 1 h.</li>
		<li>Tvätta plattan 9 x med 1 x perm/tvättbuffert, på 55 µL för varje tvätt.</li>
		<li>Tillsätt 25 µL FACS tvättbuffert i alla brunnar.</li>
		<li>Överföra proverna till mikrotiter rören efter adekvat blandning via pipettering.</li>
		<li>Lägga till en annan 50 µL FACS tvättbuffert i tomma brunnarna och upprepa steg 4.6.9.</li>
		<li>Upprepa steg 4.6.9 och 4.6.10 Hämta 2 x tills 200 µL av proverna samlas i mikrotiter rören. Obs: Syftet med de förfaranden som beskrivs i steg 4.6.10 Hämta och 4.6.11 är att säkerställa en maximal återhämtning av celler från små volymer plattan. Om cell nummer är inte ett problem, efter steg 4.6.10 Hämta, helt enkelt fylla i mikrotiter-rör till 200 µL med FACS tvättbuffert.</li>
		<li>Kör en flöde flödescytometrisk analys av proverna och analysera resultaten med en FACS analysprogram, enligt steg 3.5.11. Kaspas-3 aktivering och CD69 uttryck analyseras i utfärda utegångsförbud för som innehåller CD4+CD8+DP tymocyter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development.">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li><li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme.">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li><li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction.">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+T+cells.">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li><li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers.">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).</li><li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+&amp;#34;self&amp;#34;+in+T-cell+activation.">A role for &amp;#34;self&amp;#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li><li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation.">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li><li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC.">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling.">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development.">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling.">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development.">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li><li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+human+autoimmunity:+current+practice+and+future+prospects.">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li><li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity.">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li><li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate.">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li><li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li><li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation.">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).</li><li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules.">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants.">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li><li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis.">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li><li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry.">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li><li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase,+2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+(LY294002).">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors.">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li><li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staurosporine,+K-252+and+UCN-01:+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases.">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li><li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2,3-Bisarylmaleimides.">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li><li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1.">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li><li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A.">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li><li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel compounds. , (2003).</li><li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase.">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li><li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway.">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors.">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds.">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).</li><li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts.">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li><li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+neonatal+thymus:+evidence+for+a+transient+thymic+involution.">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li><li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus.">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li><li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and/or+IFN-gamma-producing+CD4++and+CD8++T+cells.">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li><li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+assays+for+ADMET.">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li></ol>

Författaren Chyan Ying Ke är anställd av Curiox Biosystems, som producerar DA-cell bricka och DA-cell plattor används i denna artikel.

Den screening strategi som föreslås här bedömer småmolekylär hämmare förmåga att undertrycka apoptotiska effekterna i tymocyter efter stimulering, förutom mer konventionella markörer av T-cells aktivering-CD69 uppreglering och TCR nedreglering . Ytterligare markörer kan också ingå att möjliggöra analys av olika thymocyte grupper32. En intressant aspekt av den aktuella analysen ligger i det faktum att hämmare som hindrar TCR signalering också skulle dämpa induktion av apoptos, ytterligare belysa skillnaden av TCR-oberoende effekter av hämmare kan ha på inducera celldöd. Dessutom tillåter en flow-flödescytometri-baserad analys användning av flera utläsningar som distinkta aktiveringen markörer, som kunde rapportera effekterna av hämmare om separata individuella grenar av TCR signalering. I det fallet presenteras här fanns hämmare som visade en differential inhibition av kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering. Eftersom vissa föreningar kan påverka städning funktioner såsom proteinsyntes eller vesikulär människohandel, är det inte förvånande att iaktta effekterna på uppreglering av de novo syntetiseras markörer (t.ex. CD69) men inte på posttranslationell ändringar (t.ex. proteolytisk aktivering av kaspas-3).
Som analysen presenteras här åtgärder apoptos som en avläsning, är det absolut nödvändigt att de latenta toxiska effekterna av de-hämmare inte skymmer resultaten. Till exempel i skärmen, vi inte späd staurosporine bortom 1 nM, trots att det fortfarande är giftigt för cellerna vid den koncentrationen. De representativa resultat är ense med staurosporine att vara en promiskuös Kinas-hämmare och inducerare av apoptos33. Utan en tillräcklig utspädning av de föreningar som testade till giftfritt koncentrationer, är det möjligt att bortse från potentiella hits.
Screening strategin beskrivs här skulle vara svårt att tillämpa på människor till följd av komplikationer i samband med att få tillräckligt antal tymocyter för high-throughput screening. Det är dock möjligt att få mänskliga bräss prover från pediatric cardiac biopsier34,35 eller från foster36,37. Dock som TCR signalering vägar och den amino syra sekvenser av signalering proteiner bevaras i stor utsträckning mellan möss och människor, thymocyte analysen ger en användbar preliminära screening strategi, och några resultat erhålls med denna analys som använder mus tymocyter kan, sedan verifieras i primära humana lymfocyter.
En begränsning av konventionella centrifugering-beroende protokollet avser utsikterna till cellförlust, som kan hänföras till den process som omfattar steg såsom cell permeabilisering och centrifugering utgångsämnet art. Varje centrifugering och resuspension steg oundvikligen resulterar i förlust av celler. Medan sådana förluster inte kan vara kritiska för studier med ett begränsat antal prover, kan det innebära problem när de tillämpas i högre genomströmning screening, i synnerhet som assay format fortskrider från 96 - till 384 - till 1536-väl. Ett sätt att kringgå detta problem är med hjälp av cell-permeable fluorescerande kaspas sensorer38 som möjliggör upptäckt av kaspas aktivering samtidigt undvika komplikationerna av cell permeabilisering och flera tvättar5. Alternativt, anställa en centrifugering-oberoende metod för att tvätta cellerna med laminärt flöde är också möjlig för att minimera cellförlust. Med en automatiserad plate tvätt station i samband med en vägg mindre tallrik, tvättas cellerna av laminärt flöde utan användning av en centrifug. Exponentiell utspädning av reagenser tillåter för en grundlig och effektiv sköljning av celler i mindre än 3 min, vilket representerar en motsvarande utspädning till två rundor av centrifugal tvätt. Utan yttre påfrestningar på grund av centrifugering, cellerna är mer livskraftig och cell förluster minimeras.
Vi undersöker också möjligheten att använda automatiserade plattan tvätt station efter odling av tymocyter i 96 brunnar U-botten pläterar och, även, odling av celler direkt i vägg-mindre plattor kompatibel med automatiserade plattan tvätt station. Odling av celler i väggen-mindre tallrikar aktiverat eliminering av alla centrifugering steg och minimerat cellförlust genom att eliminera behovet av en prov överföring över plattorna. Generellt är de tre olika protokoll är jämförbara i både stimulering effektivitet och färgning. Den automatisera tvätt stationen ger fördelen med automation, hastighet och effektivitet, vilket gör det lättare för högre genomströmning analys. Dessutom med ökad automatisering, tvätt stegen kan utföras snabbare, och det finns en större konsekvens mellan experiment eller praktiker. Tvätt stationen har dock vissa nackdelar: stora mängder tvätt buffertar krävs för bricka priming (150 mL per buffert förändring, varav 50 mL används för tvätt); extra omsorg behövs vid hantering av plattan att undvika eventuella korskontamination mellan brunnarna på grund av begränsad uppdelning mellan brunnarna av små volymer plattan; kvarvarande buffert av 25 µL i brunnarna efter tvätt nödvändiggör användning av reagenser beredd vid en högre än 1 x koncentration. För att lösa frågorna om residualvolym och begränsad volymkapacitet av plattan, kan ett tillbehör till expandera inkubation volymen från 70 µL till 150 µL läggas, att underlätta antagandet av konventionella protokoll. Medan automatiserad plattan hanteringssystem finns för närvarande, har de en betydande footprint jämfört med laminär Tvättsystemet, som är en liten enhet av ~ 1 kubikfot (~0.028 m3). Integrationen av centrifugering i automatiserade plattan hanteringssystem är dessutom utmanande, begränsa deras användning i cell tvätt. För närvarande finns det inga andra centrifug-oberoende cell tvätt instrument tillgängliga, såvitt vi vet.
Den screening strategi som presenteras här är kunna identifiera små molekyler och deras påstådda mål kinaser, som påverkar TCR signalering och T-cells aktivering. Biblioteket som används här omfattar främst småmolekylär hämmare av kinaser och kunde generera ett antal potentiellt intressanta träffar. Protokollet kan även appliceras lätt hämmare bibliotek av andra enzym klasser eller andra typer av små molekyler samt till bibliotek av andra föreningar (t.ex., olika makromolekyler). Protokollet kan också användas till skärmen andra celltyper, som perifera T-lymfocyter eller förevigade celler, inklusive de uttrycker transgena TCRs eller transporterar reporter system. Att identifiera och karaktärisera nya mediatorer av T-cell signalering kan förbättra vår kunskap om signalvägen och också stöd i utvecklingen av riktad terapi i immuna sjukdomar13,14,15, 16. i alla, denna studie lägger till utbudet av tillgängliga alternativ för detektion av mediatorer av T-cell signalering via high-throughput screening analyser.

T-celler är en utvecklingslinje av lymfocyter som spelar en central roll i upprätthållandet av adaptiv immunitet. De uttrycker TCR, vilket gör dem att känna igen deras ligander, komplex som består av en större histocompatibility komplex molekyl (MHC) med en bunden peptid, som återfinns på ytbehandlar av antigen-presenterande celler (APC). Utlösning av TCR signalering väg genom den TCR/MHC samverkan är avgörande för T-cells aktivering och utveckling1.
I T-cells utveckling migrera ben-märg-härrör hematopoetiska stamceller (Förenta) till tymus, där de genomgår differentiering och gå igenom stadier av T-cell lineage progression2. Dubbel-positiv (DP) tymocyter, uttrycker både CD4 och CD8 coreceptors, delta med self-peptid/MHC på trupptransportfordon. Tymocyter med en måttlig affinitet för deras själv-peptid/MHC ligander mogen för att bli singel-positiv (SP) CD4 eller CD8 tymocyter, en process som kallas positiva urval. Omvänt, tymocyter som får överdriven TCR stimulering genom de self-peptid/MHCs genomgå apoptos via negativa urval3,4. Denna process av stimulering-inducerad, kaspas-beroende apoptos kan vara härmade i vitro genom att stimulera tymocyter, till exempel med anti-CD3/28 antikroppsbelagda pärlor5. Mogna T-celler som klarar urvalsprocessen aktiveras av icke-jaget-peptid/MHC ligander från trupptransportfordon i periferin. Self-peptid/MHCs är fortfarande relevanta för perifera T-celler, i samband med tonic signalering för överlevnad och homeostatiska proliferation, differentiering av helper T-celler och förbättrande av T-cell svar på icke-själv-peptid/MHCs genom coagonism6,7,8,9. Hög affinitet TCR bindning till peptid/MHC liganden aktiverar flera nedströms signalvägar, som inbegriper många signalmolekyler som bildar en komplexa TCR signalering nätverk10. Signalvägar som TCR har studerats i flera decennier, och ändå upptäckten av nya mediatorer av väg visar inga tecken på att avta11,12. Moduleringen av TCR signalvägar har klinisk relevans och kan involvera potentierande T-cell svar för immunoterapeutisk program eller hämning av T-cell svar för kontroll av autoimmunitet13. Strategier för moduleringen av T-cell svar bero huvudsakligen på störningar av Kinas eller fosfatas aktivitet14,15,16.
Vi beskriver en ansökan av en flow-flödescytometri-baserad analys för screening av små kemiska föreningar för sin förmåga att modulera TCR signalering och T-cells aktivering17. Analysen handlar om fenomen av tymocyter aktivera apoptos vägen när de utsätts för starka TCR signaler. Analysen är tillräckligt känslig för att identifiera ändringar i stimulering styrka; ruvning tymocyter uttrycker transgena TCR med peptid/MHC tetramers med ökande affinitet resulterade i en motsvarande ökning av kaspas aktivering-används som ett mått på den apoptotiska svar5. För skärmen, vi använde ett bibliotek av kinashämmare och bedömt deras förmåga att modulera thymocyte svaret på starka TCR signaler.
Flera flöde-flödescytometri- eller fluorescens-reporter-baserade strategier har beskrivits för high-throughput screening av ett sortiment av perifera aktiveringen fenotyper i olika T-cell delmängder. Sådana strategier inkluderar användning av genetiska fluorescerande reportrar att bedöma tidpunkten och omfattningen av T-cells aktivering18, användning av degranulering som en avläsning av cytotoxiska T-cells aktivitet19,20, och analysen av den fosforylering av olika proteiner involverade i cellulär signalering21.
Den screening-test som presenteras här är kunna framgångsrikt identifiera substanser som hämmar kanoniska molekyler av TCR signalering utbildningsavsnitt, liksom potentiella, roman föreningar med hämmande effekt på TCR signalering. Exempelvis har vi identifierat hämmare av GSK3β och Hsp90 som nya föreningar som påverkar T-cell svar17. Analysen är kunna skilja de hämmare som störa signaltransduktion, på grund av en minskning i apoptotiska svaret från TCR-oberoende effekter av hämmare på cellulär toxicitet. Förutom induktion av apoptos mäta vi också CD69 uppreglering och TCR nedreglering som markörer för aktivering. Som TCR signalering nätverk är komplexa, kan användning av flera utläsningar öka chanserna att upptäcka molekyler med specifika effekter på en enskild väg. Här, införa vi också användning av ett centrifugering-oberoende protokoll som en hög genomströmning alternativ till den ursprungliga protokollet under färgningen av cellerna i förberedelse för flöde flödescytometrisk analys. Den analysmetod som beskrivs i detta dokument använder en liten förening bibliotek av kinashämmare men, i princip, den kan användas för högre genomströmning screening. Biblioteket i val kan också innehålla en mängd-hämmare eller andra molekyler.

identification of mediators of t-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries

T-cell receptorn (TCR) signaling pathway består av en mängd medlare som överför signaler vid aktivering av TCR. Olika strategier har föreslagit och genomförts för identifiering av nya mediatorer av TCR signalering, vilket skulle förbättra förståelsen av T-cell processer, inklusive aktivering och thymic urval. Vi beskriver ett screening-test som möjliggör identifiering av molekyler som påverkar TCR signalering baserat på aktivering av utveckla tymocyter. Stark TCR signaler orsaka utveckla tymocyter att aktivera apoptotiska maskiner i en process som kallas negativa urval. Genom tillämpning av kinashämmare kan de med mål som påverkar TCR signalering åsidosätta negativa urvalsprocessen. Den metod som beskrivs i detta dokument kan användas för att identifiera hämmare av kanoniska kinaser med etablerade roller i de TCR signalvägar och också hämmare av nya kinaser ännu skall fastställas i signalvägar som TCR. Screening strategin här kan tillämpas på skärmar av högre genomströmning för identifiering av Roman druggable mål i TCR signalering.

Metoden att screening analysen sammanfattas i figur 1A. Kinashämmare screenades först för sin latenta effekter på thymocyte lönsamhet. Som positiv kontroll för apoptos användes dexametason som proapoptotiska agent. Den gating för levande cell befolkningen bestämdes utifrån de obehandlade negativa kontrollerna och de dexametasonbehandlade positiva kontrollerna (figur 1B). Hämmare prövades först vid 10 µM på tymocyter, och procentandelen av viabla celler mättes efter inkubation för 18 h. Ett 20% fönster för celldöd valdes så att föreningarna som induceras en större än 20% förlust av celler i den levande cellen gate, jämfört med DMSO-behandlade proverna, testades vid lägre koncentrationer (figur 1B). Representativa FACS tomter av valda hämmare-behandlade prover visas att illustrera lönsamhet analysen. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), en PI3K hämmare22, inte kraftigt ökade celldöd vid 10 µM och hämmaren användes vid 10 µM för de efterföljande analyserna. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), en dubbla hämmare av PI3Kα/mTOR23, inducerad celldöd vid 10 µM hög och vid 1 µM men 0,1 µM och 0,1 µM fastställdes vara lämpliga koncentrationen för tillämpning i nedströms analyser. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS-62996-74-1), en pan-C proteinkinashämmare med en etablerad förmåga att inducera apoptos24, inducerad betydande celldöd vid alla koncentrationer testats, även vid 0.1 µM. Det användes i efterföljande analyser vid 0.1 µM som en extra positiv kontroll.
De slutliga koncentrationerna av hämmare valdes ut baserat på de högsta koncentrationerna vari de inte förstärka celldöd av mer än 20% av DMSO-behandlade proverna. Med slutliga koncentrationerna av de hämmare fastställs, förbereddes en lager platta av hämmare så att alla hämmare 500 gånger koncentrationen när det appliceras på cellerna. Figur 1 c visar plattan layout lager plattan, med de slutliga koncentrationerna av hämmare. I alternativa protokoll ruvning cellerna direkt i små volymer plattorna för den laminärt flöde tvätt assay, nödvändiggjorde användningen av små volymer en ytterligare spädning av de-hämmare. För att säkerställa att DMSO innehållet av kulturerna efter hämmare tillägg inte skulle vara för hög för cellerna, hämmare var ytterligare utspädd i komplett RPMI, genom en utspädningsfaktor på 5, så att de var på 100 gånger den planerade koncentrationen när de tillämpas på den celler.
De hämmare, utspätt till giftfritt koncentrationer, användes i analysen för TCR-stimulering-inducerad apoptos i tymocyter5,17. Stimuleringen utfördes med anti-CD3/CD28 pärlor för 18 h, och cellerna var därefter färgas för kaspas-3 aktivering i CD4+ och CD8+ DP thymocyte befolkningen (figur 2). En ökning av kaspas-3 aktivering och CD69 uttryck, och också en TCR nedreglering, observerades hos både det anti-CD3/CD28-stimulerat och DMSO-mock-behandlade anti-CD3/28-stimulerad proverna, jämfört med de nonstimulated proverna. Dexametasonbehandlade proverna visade en ökning i kaspas-3 aktiveringen oberoende av CD69 uppreglering, som förväntas av apoptos-inducerande effekten är oberoende av TCR stimulering.
Figur 3A sammanfattar resultaten av biblioteket screening test för valda hämmare. Både kaspas-3 aktivering och CD69 kan användas för att identifiera potentiella inhibitorer av intresse på grund av dämpningen av uttryck. Som förväntat, dök hämmare av kanoniska mediatorer av TCR signalering upp som positiva träffar i skärmarna. Sådan-hämmare, som visat varierande grad av hämmande potens, ingår ett bredspektrigt hämmare som riktar flera kinaser och även mer specifika hämmare. Vissa hämmare kunde undertrycka både kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering (figur 3B, översta raden, vänstra paneler). En sådan hämmare är bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), som hämmar alla protein kinase C isoformer, förutom proteinkinas A och PDK125,26,27. En annan hämmare i denna kategori är CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; (CAS 494772-86-0), en föreslagna hämmare av IKK228.
Det var föreningar som hämmade CD69 uppreglering men inte försämrar kaspas-3 aktivering (figur 3B, översta raden, rätt paneler). CAY10626, en hämmare av PI3Kα och mTOR23, och U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] metylen]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), en MEK hämmare29, var några av de identifierade hämmare. Resultaten visar att olika hämmare inriktning olika kinaser från särskilda grenar av den TCR signalvägen, särskilt de inriktning sent stadium kinaser, kan resultera i selektiv nedskrivning av T-cells aktivering fenomen.
Det fanns också hämmare som inte undertrycka både CD69 uppreglering och kaspas-3 aktivering (figur 3B, nedersta raden, vänster paneler). Paklitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - hydroxy-benzenepropanoic syra, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), en disruptor mikrotubulära dynamics30och necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS-337349-54-9), en hämmare av RIP1 kinase31, är två hämmare identifieras för att vara i denna kategori. I sådana fall där CD69 uppreglering och kaspas-3 aktivering inte var nedsatt, kan detta på grund av hämmare inte inriktning en relevanta Kinas av TCR signalering utbildningsavsnitt.
Som tidigare nämnts användes staurosporine i skärmarna, i en koncentration som fortfarande inducerad apoptos i tymocyter. Som förväntat, staurosporine-behandlade provet visade höga halter av kaspas-3 aktivering (figur 3B, nedersta raden, högra kolumnen). De låga nivåerna av CD69 uttryck kan hänföras till staurosporine-medierad hämning av PKC, som bisindolylmaleimide II, en annan pan-PKC-hämmare, undertryckta också uttrycket av CD69. Alternativt inducerad staurosporine apoptos i celler innan de kunde upregulate CD69 uttrycket.
För att öka genomströmningen och automatisering av protokollet, utarbetades parallellt protokoll som inneburit att användningen av en automatiserad platta tvätt system via laminärt flöde. Två separata protokoll använder denna automatiserade plattan tvätt enhet var trialed och jämfört med den konventionella metoden för odling av celler i 96 brunnar och färgning cellerna i ett protokoll som centrifugering-beroende. En metod inblandade odla cellerna i 96 brunnar, enligt standardförfarande, och sedan överföra cellerna till plattor som är kompatibel med automatiserade tallrik bricka för färgningen steg (figur 4, DA-tvätt prover). Den andra metoden innebar odla cellerna direkt i plattan-bricka-kompatibel plattorna och fortsätter med protokollet färgning på samma platta (figur 4, DA-kultur prover). Centrifugering-oberoende protokollen ger inte många uppfattbar skillnader i aktiva kaspas-3, CD69 eller TCRβ färgning över de olika prover testas, jämfört med konventionella centrifugering-beroende protokollet (figur 4). Skillnader i färgning intensitet kan tillskrivas använder antikroppar vid lite olika koncentrationer under färgning stegen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg"> Figur 1 : Thymocyte lönsamhet efter behandling med hämmare. (A) experimentella disposition av de största stegen i analysen screening. Det finns tre föreslagna metoder för att stimulera och färgning av de tymocyter som används i aktiveringen analysen, nämligen (1) odling av tymocyter i standard 96 brunnar, följt av färgning med en konventionell centrifugering-baserade protokoll, (2) odling av tymocyter i standard 96 brunnar, följt av färgning med ett centrifugering-oberoende tvätt-protokoll, och (3) odling av tymocyter i små volymer plattor, följt av färgning i samma plattorna med hjälp av en centrifugering-oberoende tvätt protokoll. (B) Gating strategier som används i livskraft analyserna. Levande cellen grinden härrör från framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) tomter, som tidigare beskrivits17. Hämmare som ansågs vara alltför giftiga vid testade koncentrationen var föremål för ytterligare lönsamhet analyser vid 10-faldig lägre koncentrationer. Representativa hämmare-behandlade prover visas. Observera den gemensamma kontroll (DMSO-behandlade [DMSO]) som används för den 1 µM och 0.1 µM prover. (C) plattan layout av utspädda hämmare. En schematisk representation av pläterar av hämmare utspätt i DMSO till en koncentration av 500 x avsedda slutliga koncentration. Var representerar väl en unik hämmare; grå brunnarna är tomma. De koncentrationer som visas är den slutliga koncentrationen när de läggs till cellkulturer, nämligen 10 µM (Mörkröd), 1 µM (fuchsia) och 0,1 µM (blå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg"> Figur 2 : Plattan layout thymocyte aktiveringen analysens. (Överst) Kolumn 1 och 12 är reserverade för kontroller, medan kolumnerna 2 till 11 är hämmare-behandlade prover (beige). Den negativa kontrollen (nonstimulated [NS]; grå) upptar brunnar A1 till D1, och den positiva kontrollen för celldöd (dexametasonbehandlade [DEX]; lila) upptar brunnar E1 H1. Kolumnerna 2 till 12 innehåller tymocyter stimuleras med anti-CD3/CD28 pärlor. Den positiva kontrollen för thymocyte aktivering (stimulerad prover [α-CD3/CD28]; grön) upptar brunnar A12 till D12, och fordonskontroll (stimulerad och DMSO-behandlade [α-CD3/CD28 + DMSO]; röd) upptar brunnar E12 till H12. (Botten) Flow flödescytometri tomter för aktiva kaspas-3 (ActCasp3), CD69, och TCRβ färgning av tymocyter gated inom stadsporten dubbel-positiv (DP). Representativa tomter av de olika kontrollerna visas. NS = nonstimulated; DEX = dexametasonbehandlade prover; Α-CD3/CD28 + DMSO = prover stimuleras med CD3/CD28-belagda pärlor och behandlade med DMSO; Α-CD3/CD28 = prover stimuleras med CD3/CD28-belagda pärlor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg"> Figur 3 : Screening av hämmare biblioteket på thymocyte aktiveringen. (A) summerade data aktiveringen analysens. Detta är resultatet av en representativ experiment visar normaliserade värden i celler med aktiverade kaspas-3 och CD69 uttryck för valda hämmare. Normalisering utfördes genom att jämföra andelen celler i aktiv-kaspas-3-positiva eller CD69-positiv gate till värdet i kontrollen DMSO-behandlade, som är satt att relativa värdet 0 i grafen. (B) valt FACS tomter. Flöde flödescytometri tomter hämmare som undertrycks både kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering (vänster överkant), undertryckta endast CD69 uppreglering (överst till höger), eller hade ingen effekt på kaspas-3 aktivering och CD69 uppreglering (nederst till vänster). Tomter av staurosporine-behandlade provet visas att illustrera effekterna av att använda en hämmare vid toxiska koncentrationer (nederst till höger). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg"> Figur 4 : Jämförelse av de olika test protokoll. Flöde flödescytometri tomter för aktiva kaspas-3 (ActCasp3), CD69, och TCRβ färgning av DP tymocyter efter tre olika test protokoll. Fyra olika villkor är testade, nämligen den negativa kontrollen (nonstimulated [NS]), den positiva kontrollen för celldöd (dexametasonbehandlade [DEX]), fordonskontroll (stimulerad och DMSO-behandlade [α-CD3/CD28 + DMSO]), och en hämmare-behandlade prov (stimulerad och PIK-75-behandlade [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Konventionella = odling av tymocyter i standard 96 brunnar och färgning med en konventionell centrifugering-baserat protokoll; DA-tvätt = odling av tymocyter i standard 96 brunnar och färgning med hjälp av ett laminärt flöde tvätt protokoll; DA-kultur = odling av tymocyter i små volymer plattor och färgning i samma tallrikar med ett laminärt flöde tvätt protokoll.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries at JoVE.com

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Detta dokument använder en flow-flödescytometri-baserad analys till skärmen bibliotek av kemiska hämmare för identifiering av hämmare och sina mål som påverkar T-cells receptor signalering. Metoderna som beskrivs här kan också utökas för hög genomströmning filmvisningar.

Identifiering av mediatorer av T-cells Receptor signalering via Screening av kemiska hämmare bibliotek

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Vår hög genomströmning assay lägger till de tillgängliga metoderna för identifiering av små molekyler och deras mål som modulerar TCR signalering och T-cells aktivering. Vår analys har en själv-korrigerande aspekt genom att filtrera bort giftiga föreningar och identifiera hämmare av TCR signalering och stimulering-inducerad apoptos. Identifiering av medlare av TCR signalering kan stöd i utvecklingen av terapi för immunsjukdomar.Vi gav en stark stimulans för thymocytes härrör från TCR-polyklonala möss. Det är möjligt att använda TCR-transgena möss och stimulera dem med andra peptid ligand tetramerer för svagare stimulering. Denna analys innebär användning av små volymer och av små volymer plattor för odling av cellerna.Detta nödvändiggör noggrann hantering av plattorna och dess innehåll. Det finns många föreningar i biblioteket av kinashämmare som anses farliga. För säkerhetshänsyn, behandla alla föreningar som lika farliga, och följ leverantörens rekommenderade säkerhetsåtgärder.För att påbörja behandlingen av tymocyter med kinashämmare, använd en flerkanalspipett för att lägga till 40 mikroliter per brunn av tymocyter till en liten volymplatta. Lägg tallriken på is. Sedan pipettera en del av kinashämmare, DMSO, och dexametason, och fyra delar av den kompletta RPMI media i en 96-brunnsplatta.Utse åtta brunnar av plattan med liten volym till obehandlade kontroller, fyra brunnar till dexametasonbehandlade positiva kontroller för celldöd genom att lägga till det utspädda dexametasonen vid femmikarkoncentrationen, och fyra brunnar till fordonsbehandlade kontroller, genom att lägga till 0,5 mikroliter av den utspädda DMSO. Därefter, från motsvarande brunnar av inhibitorplattan, tillsätt 0,5 mikroliter av varje utspädd hämmare till 96-brunnsplattan. Till att börja tymocyte stimulering, först se till att anti-CD-3 och CD-28 pärlor är enhetligt åter upphängd.Därefter tvätta en milliliter av pärlorna med två milliliter av PBS-bufferten. Sätt röret på ett magnetiskt stativ för att separera pärlor från supernatant och aspirera lösningen. Sedan åter avbryta pärlorna i en milliliter av den kompletta RPMI medium.Tillsätt 10 mikroliter per brunn av pärlfjädringen till varje inhibitorbehandlat prov, de fyra DMSO-behandlade proverna, och fyra av de åtta obehandlade proverna. Lägg till 10 mikroliter av den kompletta RPMI till de återstående fyra obehandlade brunnarna. Använd en mikroplatt orbital shaker att försiktigt agitera plattan.Därefter inkubera tymocyterna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid miljö i 17 till 20 timmar, eller över natten. Prime en automatiserad laminär flödesplatta bricka, först med 150 milliliter av etanol Tween lösning, sedan med avjoniserat vatten kompletterat med 1%Tween 20, och slutligen, med FACS tvätt buffert. Vid slutet av inkubationen med hjälp av plattan bricksystemet, tvätta plattan med FACS tvätt buffert med hjälp av en nio gånger tvättcykel.Varje tvätt lägger till och tar bort 55 mikroliter av tvättbuffert genom laminärflöde, vilket resulterar i en exponentiell utspädning av reagenserna i brunnarna. För att fläcka ytantigener, späd först en enhetsvolym av anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 och anti-CD-69-antikroppar i 100-enhetsvolymer av FACS-tvättbufferten. Sedan åter avbryta cellerna i 25 mikroliter av färgning antikroppsblandningen.Använd en mikroplatta orbital shaker att försiktigt agitera plattan, och sedan lämna plattan på is i 30 minuter. För att fixa cellerna, tvätta först plattan med 55 mikroliter AV FACS tvättbuffert med nio gånger tvättcykel som beskrivits tidigare. Lägg sedan till 50 mikroliter av fixering-impermeabliseringsbufferten till varje brunn.Blanda väl och inkubera plattan på is i 30 minuter. Efter inkubationen, preparera en perm perm med ett X och tvättbuffert genom att späda 25 milliliter av det medföljande 10X-lagret i 225 milliliter Ultrapure vatten. Prime plattan bricka med en-X buffert och tvätta plattan med 55 mikroliter av en-X buffert med hjälp av en nio gånger tvättcykel som beskrivs tidigare.Till att börja med, blanda en milliliter av antispase 3 antikroppen med två milliliter av en-X perm och tvätt buffert. Tillsätt 25 mikroliter per brunn av blandningen till de fasta cellerna. Använd en mikroplatt orbital shaker att försiktigt agitera plattan.Lämna plattan på is i en timme. Vid slutet av inkubationen upprepas tvättsteget nio gånger med en-X perm och tvättbuffert. Tillsätt sedan 25 mikroliter av FACS tvättbuffert till alla brunnar av plattan.Pipett upp och ner några gånger för att blanda lösningen. Slutligen, överför de blandade proverna till mikrotiterrör. Fylla på rören med FACS tvättbuffert till en total volym på 200 mikroliter, och fortsätt till flödescytometrianalysen.Efter anti-CD-3, CD-28 stimulering, en ökning av kaspas-3 aktivering och TCR nedreglering observerades i både den obehandlade och DMSO mock-behandlade prover. Också, en ökning av CD-69 uttryck observerades i båda stimulerade prover. De dexametason-behandlade prov visade en ökning av kaspas-3 aktivering oberoende av CD-69 uppreglering, som förväntat för den oberoende apoptos-inducerande effekten och TCR stimulering.Den selektiva försämringen av T-cells aktiveringsfenomen visades av olika inhibitorer som antingen undertryckt både caspase-3 aktivering och CD-69 upp-reglering, eller hämmade CD-69 upp-reglering, men inte försämrar caspase-3 aktivering. Det fanns också hämmare som inte riktade en relevant kinas av TCR-signalering väg, och därför inte undertrycka både CD-69 uppreglering och caspase-3 aktivering. Skärmen resultatet av staurosporine, den apoptos-positiva kontroll, visade höga nivåer av kaspas-3 aktivering, som förväntat.Resultatet visade dock också låga nivåer av CD-69 uttryck som kan hänföras till antingen dess medierad hämning av protein kinase C eller dess inducerad apoptos innan CD-69 uttryck. Jämförelse av olika analys protokoll visade inga skillnader i aktiv caspase-3, CD-69 och TCR färgning av den negativa kontrollen, den positiva kontrollen för celldöd, fordonet kontroll och en inhibitor-behandlade prov. Förinkubationsstadier är avsedda att underlätta användningen av den lilla volymen plattan för odling av cellerna.Det standardberoende centrifugeringsberoende protokollet tillhandahålls också i manuskriptet. Potentiellt intressanta hämmare eller mål kan valideras med hjälp av olika celltyper och även i olika arter, såsom pagopheral muslymfocyter eller mänskliga primärceller. Efterföljande karakterisering av de identifierade molekylerna och målen kan bidra till att förbättra förståelsen av T-cellbiologi och expandera på möjliga mål för immunmodulering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Möss med fördefinierade Receptor T cellspecifika Against Toxoplasma gondii Erhållits via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Live avbildning av T-cellsignalering Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS-medierad Forward Genetics Screening för Identifiering av gener involverade i Nonhost Resistance


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Samtidig Kvantifiering av T-cellreceptor Excision cirklar (TRECs) och K-Radering Rekombination Excision cirklar (KRECs) genom realtids-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus Naiv CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolering och<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiering i T cellundergrupper

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduction av benmärgsstamceller för att generera T-cellreceptor Retrogenic Möss

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

En plattform av anti-biofilm analyser lämpade för Exploration of Natural substansbibliotek

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Med användning av röntgenkristallografi, Biophysics, och Funktionella analyser för att bestämma de mekanismer som styr T-cellsreceptorigenkänning of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infektioner som Screening verktyg för identifiering av Viral immunmodulerande och värd antivirala faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...