Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
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著者は、試薬およびテクニカル サポートを提供するため、博士 Meenhard Herlyn (ウィスター研究所) とサイモン ・ m ・ セレステ (ペンシルベニア大学) を感謝したいです。私たちはまた役に立つ議論のため私たちの研究所のメンバーに感謝します。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) 助成金 (R01CA187718、R01CA148768、R01CA142723)、NCI 癌センター助成金 (NCI P30 CA016520)、およびペン CFAR 賞 (P30 AI 045008) によって支えられました。

人間の新生児の包皮は、ペン皮膚病研究センターから得られました。大人ひと線維芽細胞は、手術後破棄された正常な皮膚から得られました。すべてのプロトコルは、ペンシルベニア州制度検討委員会の大学によって承認されました。
1. ひと真皮線維芽細胞の単離
<ol><li>人間の新生児の包皮から脂肪と皮下組織を切り落とすし、半分または四半期に肌サンプルをカット...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. 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A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

人間の皮膚組織から真皮線維芽細胞の単離、遺伝子組換え MCPyV 粒子の作製、培養細胞、免疫蛍光染色、HCR 技術から適応魚法の感染など、上記の方法をMCPyV 感染症27を分析する研究者を有効にする必要があります。MCPyV 感染症体外を達成するために最も重要な手順の 1 つは高力価ウイルス粒子製剤の生産です。ここで説明した組換え MCPyV ウイルス粒子の準備のためのプロト?...

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス (MCPyV) は、稀だが攻撃的な皮膚癌、メルケル細胞癌 (MCC)1,2に関連付けられている小さな、二本鎖 DNA ウイルスです。クライアントは、約 33% の死亡率は、悪性黒色腫3,4を超えています。MCPyV は、初期および後期地域1のコーディングに非コーディングの規制地域 (傘下) によって二等分される 〜 5 kb1,5の円形ゲノム。傘下には、ウイルスの起源レプリケーション (Ori) とウイルスの転写6、7のための双方向性プロモーターが含まれています。初期の地域型 miRNA1,8,9,10と同様、大きい T (LT)、小さい T (sT)、57kT、代替 LT ORF (アルト) と呼ばれる腫瘍抗原タンパク質をエンコードします。後半の地域は、カプシド タンパク質 VP1 と VP211,12,13をエンコードします。LT、sT 最高研究 MCPyV 蛋白質は、ウイルスの DNA 複製と MCPyV 誘発消化管腫瘍5をサポートするために示されています。MCCs の 80% までで観察されている、ホストのゲノムに MCPyV DNA のクローンの統合可能性がウイルス陽性腫瘍開発14,15の原因因子です。
MCC の発生率は、過去 20 年16に三倍になった。MCPyV 感染の無症候性も一般的な人口17,18,19の普及です。クライアント診断数の増加と MCPyV 感染の高い有病率、ウィルスとその発癌性潜在性の私達の理解を改善する必要があります。ただし、MCPyV 生物学および発癌のメカニズムの多くの側面は、ほとんど理解20を保ちます。これは主な理由は MCPyV は悪い細胞ライン11,12,21,22,23複製し、最近まで、皮膚細胞の MCPyV をサポート感染症では、発見された22はされていませんでした。完全に MCPyV と宿主細胞との相互作用を調査する機構の研究は、ウイルス5を伝播するための細胞培養系の欠如によって妨げられています。
プライマリひと真皮線維芽細胞 (HDFs) が両方生体外で人間の新生児包皮サポート堅牢な MCPyV 感染に由来がわかりましたと前のヴィヴォ24。本研究からは、MCPyV24の最初の細胞培養感染モデルを確立しました。このモデル システム上に構築された、WNT/β-カテニン シグナル伝達経路と他の成長因子によるマトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) 遺伝子の誘導が MCPyV 感染症を刺激することを示した.さらに、FDA 承認 MEK 拮抗薬 trametinib が MCPyV 感染症5,25を効果的に阻害することがわかった。これらの研究から我々 も策定してひと真皮線維芽細胞24,25を分離するためのプロトコルの準備 MCPyV 粒子11,12、ひと皮膚線維芽細胞の MCPyV 感染を実行します。24,25と場合染色26検出 MCPyV 蛋白質。さらに、我々 は、その場で DNA ハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR) 技術27感染したヒトの皮膚細胞の MCPyV DNA を検出する高感度の魚の技術 (HCR DNA 魚) を開発する適応。これらの新しいメソッドは MCPyV 感染に対する細胞の応答と同様、MCPyV の感染サイクルの勉強の役に立つでしょう。MCPyV 感染を維持する自然なホスト貯留層細胞と MCC 腫瘍を生じさせる細胞は不明のまま。本稿で述べる技術は、貯留層細胞を識別するためにひと細胞の様々 な種類と MCC 腫瘍の起源を調べるに適用でした。HCR DNA 魚など、方法を確立は、他の DNA の腫瘍ウイルスの検出、ホスト細胞相互作用の評価にも用いることが。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス (MCPyV) の感染は、メルケル細胞腫 (MCC)、皮膚癌の非常に積極的なフォームにつながります。MCPyV 分子生物学と発癌のメカニズムを完全に調査する機械論的研究は、適切な細胞培養モデルの欠如によって妨げられています。ここでは、一連の実行および主要な人間の皮膚細胞の MCPyV 感染症を検出するためのプロトコルについて述べる。プロトコル (IF) な免疫蛍光染色、原の DNA ハイブリダイゼーション連鎖反応 (HCR)、非常に敏感である組換え MCPyV 粒子の作製とウイルス感染症の検出ひと真皮線維芽細胞の隔離を記述します。現場の交配 (魚) のアプローチで蛍光します。本プロトコルは、他のセルタイプまたはサポート MCPyV 感染細胞を識別するために興味がある研究者によって合わせることができます。説明魚アプローチは、また、ウイルス Dna 感染したひと皮膚に存在の低レベルを検出するため適応でした。

本稿で説明されたプロトコルは、HDFs (図 1) のほぼ同種の人口の分離を許可しました。蛍光抗体染色で示されているようにこのプロトコルに記述されている条件が積極的に人間の皮膚細胞分離使用のほぼ 100% ステンド真皮線維芽細胞マーカー、ビメンチン、コラーゲンに私24、しかし人間の負包皮表皮細胞マーカー K14 (<strong class...

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Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

ここでは、MCPyV とプライマリひと皮膚繊維芽細胞に感染するプロトコルを提案します。プロトコルには、in situ ハイブリダイゼーションの真皮線維芽細胞の単離、MCPyV ウイルス粒子やウイルス感染、免疫蛍光染色、蛍光の準備が含まれています。このプロトコルは、MCPyV によって MCPyV ホストの相互作用の特性や他の細胞型の感染の発見に拡張できます。

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス感染と検出

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

メルケル細胞ポリマウイルス感染の最初の細胞培養モデルを発表した。このプロトコルは、真皮線維芽細胞の単離、MCPyVウイルス感染の調製、免疫蛍光染色、および蛍光シンジコダイゼーションを含む。このプロトコルは、ウイルス遺伝子の過剰発現に関連するアーチファクトを避けながら、MCPyV感染性サイクルおよび宿主細胞との相互作用を研究することを可能にする。まず、はさみを使用して、ヒト新生児包皮の脂肪と皮下組織をトリミングします。皮膚サンプルを半分または四分の一に切ります。抗生物質抗ミコティックを補った1ミリリットル当たり10ミリグラムの組織を1ミリグラムのII NPBSに入れる。一晩摂氏4度でインキュベートします。翌日、マイクロディスセクション鉗子を使用して、10センチメートルの皿の真皮層から表皮を慎重に分離します。得られた真皮組織を、抗生物質-アニティクスを添加したFBSフリー培地で、1ミリリットルコガナーゼ1ミリグラム当たり2ミリグラムの5ミリリットルを含む円錐管に移す。サンプルを摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートし、周期的に4〜6時間揺れ、わずか数個の巨視組織凝集体が残るまで培養します。この後、10ミリリットルのピペットを使用してサンプル溶液を激しく10回ピペットし、真皮から単一細胞を放出する。遠心分離機を180gで5分間、上清を捨てます。解答した細胞を添加されたDMEM培地に盛り付けます。午後遅くまたは夕方に、600万個の293TT28細胞を、補足されたDMEM培地を含む10センチメートル皿に種を付ける。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。翌朝、細胞が約50%コンフルエントであることを確認し、66マイクロリットルのトランスフェクション試薬、12マイクログラムの再連結MCPyV単離R17B DNA、8.4マイクログラムのST発現プラスミドpMtB、および9.6マイクログラムのLT発現プラスミドpADLで細胞をトランスフェクトする。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩細胞をインキュベートします。翌日、トランスフェクトされた細胞がほぼコンフルエントである場合、細胞をトリプシン化し、15センチメートルの皿に移して継続的な拡張を行う。その料理がほぼコンフルエントになったら、細胞を3つの新しい15センチメートルの皿に移します。これらの新しい料理がほぼコンフルエントになると、テキストプロトコルで概説されているように細胞を収穫します。室温で180gで5分間遠心分離機。その後、上清を除去し、DPBSマグネシウムの1つのセル体積を追加します。硫酸アンモニウム25ミクロモルを加え、続いて0.5%トリトンX-100、0.1%ベンゾナーゼ、および0.1%のATP依存性ドナーゼを加える。よく混ぜて、一晩摂氏37度でインキュベートします。翌日、氷の上で15分間冷やします。次に、0.17の塩化ナトリウムを加えます。さらに15分間氷の上で混ぜてインキュベートします。摂氏4度で10分間、12千gの遠心分離機。上清がはっきりしない場合は、管を軽く反転し、遠心分離を繰り返します。この後、上清を新しいチューブに移します。ペレットを塩化ナトリウムの0.8モルを補ったDPBSの1体積で再懸濁します。摂氏4度で12,000gの遠心分離機を10分間。上清がはっきりしない場合は、管を軽く反転し、遠心分離を繰り返します。2つの上澄みと遠心分離機を摂氏4度で12,000gで再び10分間組み合わせます。次に、ピペットを使用して、テキストプロトコルで概説されているように、ピペットを使用して、iodiキサノールの勾配を薄壁の5ミリリットルポリアロマーチューブに堆積させます。調製されたイオデキサノール勾配の上に明確化されたウイルス含有上清の3ミリリットルをロードする。SW 55 Tiローターを234,000g、摂氏16度で3.5時間遠心分離機で、加速と減速を遅くするようにしてください。超遠心分離が完了した後、シリコンチューブに12分を集める。細胞を維持および剥離した後、10ミリリットルの添加されたDMEMおよびF12培地を皿にする。細胞溶液を15ミリリットルチューブに移します。180gで2分間遠心分離機。上清を捨て、1ミリリットル当たり20,000~40,000細胞の間の細胞密度で、補充されたDMEMおよびF12培地中の細胞を再び懸濁します。次いで、細胞懸濁液の種子200または400マイクロリットルを、それぞれ24または96ウェルプレートの各ウェルにコラゲターゼ型IV型の1ミリグラムで補う。MCPyVビロンストックをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置いて解凍します。感染する2500〜5000細胞ごとに、イオジキサノール1マイクロリットル当たりMCPyVビリオンの10億個のウイルスゲノム相当量を追加する。プレートの側面を軽くタップし、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。まず、PBSで4%PFAで細胞をカバースリップに10分間固定し、PBSでカバースリップを2回洗浄し、一晩摂氏4度で70%エタノールで処理して細胞を透過させます。翌日、エタノールをプローブハイドレーションバッファーに交換し、室温で60分間インキュベートしてサンプルをプレハイブリダイズします。プレハイブリダイゼーションインキュベーション終了の30分前に、プローブハイブリダイゼーション液中のプローブを1:500希釈で希釈し、摂氏45度でインキュベートします。インキュベーションが完了すると、約10マイクロリットルの希釈プローブ混合物をカバースリップごとに顕微鏡スライドにピペットします。各カバースリップセル側をハイブリダイゼーションミックスのそれぞれの液滴の上に下に置きます。自由な量のゴムセメントを使用して、各カバースリップの端と背面をスライドに密封します。ヒートブロックの平らな側にスライドを設定し、3分間摂氏94度に加熱します。この後、スライドを加湿したチャンバーに移し、一晩で摂氏45度でインキュベートします。翌日は、ゴムセメントを慎重に剥がすために鉗子を使用してください。カバースリップセル側を24ウェルプレートのウェルに上げ、室温でプローブ洗浄バッファーで3回洗浄します。カバースリップを含む各ウェルに200マイクロリットルの増幅バッファーを加え、室温で30〜60分間インキュベートします。一方、プローブを94°Cに90秒間加熱し、30分間室温に冷却することにより、別々のPCRチューブ内のプローブを認識する2つの標識されたオリゴヌクレオチドヘアピンのアニール。1:50 の希釈で、増幅バッファーにヘアピンを混ぜ合わせます。次に、12ウェルプレート蓋の開いた面にパラフィンフィルムを伸ばし、増幅反応のための表面を作る。ピペット50〜100マイクロリットルのヘアピン混合物を、各カバースリップ用パラフィンフィルム上に。鉗子を使用して、慎重にプリ増幅溶液から各カバースリップを取り外し、乾燥するために多孔質の使い捨てワイプにエッジをタッチします。各乾燥カバースリップセル側を増幅液滴の上に下に置きます。プレート蓋を加湿したチャンバーに移し、室温と暗闇の中で一晩インキュベートします。翌日、カバースリップを24ウェルプレートの井戸に戻します。各ウェルに1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの濃度でDAPIを含む5X SSCTを加え、室温で1時間インキュベートします。この後、室温で5X SSCTでサンプルを2回洗浄します。洗浄したカバースリップを顕微鏡スライドに取り付け、反転蛍光顕微鏡を使用して細胞を分析し、サンプルを画像化します。本研究では、ヒト真皮線維芽細胞のほぼ均質集団が単離される。免疫蛍光染色法は、分離したヒト皮膚細胞のほぼ100%が真皮線維芽細胞マーカー、ビメンチン、コラーゲンに対して陽性染色されているが、ヒトの包皮ケラチノサイトマーカーK14に対しては陰性であることを明らかにしている。MCPyVビリオンが生成され、勾配のコアに集中したMCPyVビリオンのバンドを視覚化した後、500マイクロリットル分数が収集され、MCPyV qPCRがピーク画分を同定するために行われる。MCPyVに感染したHDFの免疫蛍光染色画像がここに示されており、ここで、LT陽性、VP1陽性、またはLTおよびVP1陽性の両方の細胞がMCPyV感染に対して陽性であると考えられる。細胞の30%以上がLT陽性であり、10%以上がVP1陽性である。感染細胞で複製されたMCPyVゲノムは、HCR-DNA FISHと免疫蛍光-HCR-DNA FISHの両方を使用して検出されます。HCR-DNA FISHは、複製工場に存在するMCPyV DNAの局在を明らかにしていますが、免疫蛍光-HCR-DNA FISH法は、MCPyV DNAとLTタンパク質の両方を複製センターで同時に検出することができます。最高のウイルス感染効率を達成するためには、イオドキサノールが細胞に有毒であるため、MCPyVがマイクロリットル当たり少なくとも2 x 10〜8番目のウイルスゲノムに集中することが非常に重要です。真皮線維芽細胞のMCPyV感染後、免疫蛍光、免疫遮断、免疫作法、およびqPCRベースのアッセイを含む多くの分子生物学的分析を行うことができる。我々が述べた感染システムは、研究者が核密売やウイルス包装のようなMCPyV感染の段階を研究することを可能にする。MCPyVはBSL-2ウイルスであるが、実験室で達成された量の病理の可能性についてはほとんど知られていない。したがって、研究者はウイルスへの暴露を避けるために予防措置を講じる必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

免疫・感染学

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス感染と検出

メルケル細胞ポリオーマウイルス感染と検出