Name: merkel cell polyomavirus infection and detection
Uploaded: 2019-02-07T13:00:00
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Os autores gostaria de agradecer o Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) e Dr. M. Celeste Simon (Universidade da Pensilvânia) para fornecer reagentes e suporte técnico. Agradecemos também os membros dos nossos laboratórios de discussão útil. Este trabalho foi apoiado pelas concessões do National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 e R01CA142723), a concessão de apoio de centro NCI câncer (NCI P30 CA016520) e o prêmio de Penn CFAR (P30 AI 045008).

Prepúcios neonatais humanos foram obtidos pelo centro de pesquisa de doença de pele de Penn. Fibroblastos humanos adultos foram obtidos de pele normal descartada após a cirurgia. Todos os protocolos foram aprovados pela Universidade da Pennsylvania institucional Review Board.
1. isolamento de fibroblastos dérmicos humanos
<ol><li>Use um par de tesouras para cortar fora o tecido subcutâneo e gordo de prepúcio humano neonatal e cortar a amostra de pele em metades ou quartos.</li>
	<li>In...

<ol>
	<li>Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).</li><li>Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+integration+of+a+polyomavirus+in+human+Merkel+cell+carcinoma.">Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma.</a> Science. 319, 1096-1100 (2008).</li><li>Lemos, B., Nghiem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+more+deaths+but+still+no+pathway+to+blame.">Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).</li><li>Agelli, M., Clegg, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+primary+Merkel+cell+carcinoma+in+the+United+States.">Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).</li><li>Liu, W., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+infection+and+Merkel+cell+carcinoma.">Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma.</a> Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).</li><li>Harrison, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+Assembly+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Large+T-Antigen+Origin+Binding+Domains+at+the+Viral+Origin.">Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).</li><li>Kwun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimum+Replication+Origin+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Has+a+Unique+Large+T-Antigen+Loading+Architecture+and+Requires+Small+T-Antigen+Expression+for+Optimal+Replication.">The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication.</a> Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).</li><li>Carter, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+overprinting+gene+in+Merkel+cell+polyomavirus+provides+evolutionary+insight+into+the+birth+of+viral+genes.">Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).</li><li>Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+encodes+a+microRNA+with+the+ability+to+autoregulate+viral+gene+expression.">Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression.</a> Virology. 383 (2), 183-187 (2009).</li><li>Theiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Analysis+of+Replicating+Merkel+Cell+Polyomavirus+Genomes+Delineates+the+Viral+Transcription+Program+and+Suggests+a+Role+for+mcv-miR-M1+in+Episomal+Persistence.">A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.</a> PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycans+and+sialylated+glycans+sequentially+facilitate+Merkel+cell+polyomavirus+infectious+entry.">Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry.</a> PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).</li><li>Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+Tropism+of+BK+and+Merkel+Cell+Polyomaviruses+in+Cell+Culture.">Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture.</a> PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).</li><li>Schowalter, R. M., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Merkel+cell+polyomavirus+minor+capsid+protein.">The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein.</a> PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).</li><li>Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+Merkel+cell+carcinoma.">Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma.</a> Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).</li><li>Chang, Y., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+a+virus-induced+human+cancer.">Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer.</a> Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).</li><li>Hodgson, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+carcinoma:+Changing+incidence+trends.">Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends.</a> Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).</li><li>Tolstov, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Merkel+cell+polyomavirus+infection+II.+MCV+is+a+common+human+infection+that+can+be+detected+by+conformational+capsid+epitope+immunoassays.">Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays.</a> International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).</li><li>Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+cell+polyomavirus+and+two+previously+unknown+polyomaviruses+are+chronically+shed+from+human+skin.">Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin.</a> Cell Host &amp; Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).</li><li>Foulongne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Skin+Microbiota:+High+Diversity+of+DNA+Viruses+Identified+on+the+Human+Skin+by+High+Throughput+Sequencing.">Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing.</a> PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).</li><li>Hopcraft, S. E., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+viruses+and+innate+immunity.">Tumour viruses and innate immunity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+viral+factors+regulating+Merkel+cell+polyomavirus+replication.">Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication.</a> PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).</li><li>Neumann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+and+Particle+Production+by+a+Consensus+Merkel+Cell+Polyomavirus+(MCPyV)+Genome.">Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome.</a> PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).</li><li>Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+damage+response+factors+localize+to+merkel+cell+polyomavirus+DNA+replication+sites+to+support+efficient+viral+DNA+replication.">Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication.</a> Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+the+Target+Cells+and+Mechanisms+of+Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection.">Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).</li><li>Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merkel+Cell+Polyomavirus+Infection+of+Animal+Dermal+Fibroblasts.">Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts.</a> Journal of Virology. 92 (4), (2018).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRD4+regulates+Nanog+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos.">BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).</li><li>Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracellular+assembly+of+papillomaviral+vectors.">Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors.</a> Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</a> (2018)</li><li>. ccr.cancer.gov Available from: <a target="_blank" href="https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm">https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm</a> (2018)</li></ol>

Os métodos descritos acima, incluindo isolamento de fibroblastos dérmicos do tecido da pele humana, elaboração de recombinantes MCPyV virions, infecção das células cultivadas, coloração imunofluorescente e um método de peixes sensível adaptado da tecnologia do HCR, que deve permitir aos investigadores analisar MCPyV infecção27. Um dos passos mais importantes para a realização MCPyV infecção in vitro é a produção de preparações de alta-título do virion. Usando o protocolo par...

Célula de Merkel polyomavirus (MCPyV) é um vírus pequeno, double-stranded do DNA que tem sido associado um câncer de pele raro mas agressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. A taxa de mortalidade de MCC, cerca de 33%, ultrapassa a de melanoma3,4. MCPyV tem um genoma circular de ~ 5 kb1,5 , dividido por uma região reguladora não-codificantes (NCRR) em regiões1de codificação cedo e tarde. O NCRR contém a origem viral de replicação (Ori) e promotores bidirecional para transcrição viral6,7. A região precoce codifica proteínas de antígeno de tumor chamadas grande T (LT), pequeno T (sT), 57kT, alternativa LT ORF (ALTO), bem como de autoregulatory miRNA1,8,9,10. Região da tarde codifica as proteínas do capsídeo VP1 e VP211,12,13. LT e sT são as proteínas de MCPyV mais bem estudadas e foram mostrados para suportar a replicação do DNA viral e tumorigênese induzida por MCPyV5. Integração clonal de MCPyV DNA no genoma hospedeiro, que tem sido observado em até 80% de MCCs, provavelmente é um factor causal para tumor de vírus positivo desenvolvimento14,15.
A incidência de MCC triplicou durante os últimos vinte anos16. Infecção assintomática do MCPyV também é generalizada na população em geral17,18,19. Com o aumento do número de diagnósticos MCC e a alta prevalência de infecção MCPyV, há uma necessidade de melhorar a nossa compreensão do vírus e seu potencial oncogênica. No entanto, muitos aspectos da biologia de MCPyV e oncogênicos mecanismos permanecem mal compreendidos20. Isto é principalmente porque MCPyV Replica mal em celulares estabelecidas linhas11,12,21,22,23 e, até recentemente, as células capazes de suportar a MCPyV da pele infecção não tinha sido descoberto22. Estudos mecanicistas para investigar plenamente MCPyV e sua interação com células hospedeiras foram dificultados pela falta de um sistema de cultura de células para a propagação do vírus5.
Descobrimos que fibroblastos dérmicos humanos primários (HDFs) isolaram em infecção do prepúcio humano neonatal suporte robusta MCPyV, ambos em vitro e ex vivo24. Neste estudo, pudemos estabelecer o primeiro modelo de infecção de cultura celular para MCPyV24. Baseando-se este modelo de sistema, nós mostramos que a indução de genes de metaloproteinase (MMP) matriz pelo WNT/β-catenina sinalização via e outros factores de crescimento estimula a infecção MCPyV. Além disso, achamos que o FDA aprovou MEK antagonista trametinib inibe eficazmente MCPyV infecção5,25. Destes estudos, também estabelecemos um conjunto de protocolos para isolar os fibroblastos dérmicos humanos24,25, preparando MCPyV virions11,12, realizando MCPyV infecção em fibroblastos dérmicos humanos 24 , 25 e detecção de MCPyV de proteínas por se coloração26. Além disso, adaptamos o in situ DNA hibridização reação em cadeia (HCR) tecnologia27 para desenvolver uma técnica altamente sensível de peixe (peixe de HCR-DNA) para detecção de DNA MCPyV em células de pele humana infectada. Esses novos métodos será útil para estudar o ciclo infeccioso de MCPyV, bem como a resposta celular a infecção MCPyV. As células de reservatório de hospedeiros naturais que mantêm MCPyV infecção e as células que dão origem aos tumores MCC permanecem desconhecidas. As técnicas que descrevemos neste manuscrito poderiam ser aplicadas para examinar vários tipos de células humanas para identificar tanto as células de reservatório e origem de tumores MCC. Nossos métodos estabelecidos, tais como peixes HCR-DNA, também podem ser empregados na detecção de outros vírus de tumor de DNA e a caracterização das interações de células do hospedeiro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="838">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:185px;">HyClone</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">GLUTAMAX I, 100X</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Recombinant Human EGF Protein, CF</td>
			<td style="width:185px;">R&#38;D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dispase II</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11032</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">anti-MCPyV LT (CM2B4)</td>
			<td style="width:185px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-136172</td>
			<td>Lot # B2717</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MCV VP1 rabbit</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td>Rabbit polyclonal serum #10965</td>
			<td>https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:185px;">Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:339px;">Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td>354060</td>
			<td>Store at -80 degree celsius</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Benzonase Nuclease</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase</td>
			<td style="width:185px;">EPICENTRE</td>
			<td>E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Probe hybridization buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:339px;">Probe wash buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Amplification buffer</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Alexa 594-labeled hairpins</td>
			<td style="width:185px;">Molecular technologies</td>
			<td>B4</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R3136</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Buffer PB</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">19066</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">blue miniprep spin column</td>
			<td style="width:185px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:185px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:185px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagicMark XP</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC5602</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

merkel cell polyomavirus infection and detection

Merkel, carcinoma celular (MCC), uma forma altamente agressiva de câncer de pele pode provocar infecção de polyomavirus (MCPyV) de células de Merkel. Estudos mecanicistas para investigar plenamente os mecanismos oncogênicos e biologia molecular de MCPyV foram dificultados pela falta de modelos de cultura celular adequada. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos para executar e detecção de infecção MCPyV de células de pele humana primária. Os protocolos descrevem o isolamento de fibroblastos dérmicos humanos, preparação de recombinantes MCPyV virions e detecção da infecção do vírus por imunofluorescência (IF) coloração e reação em cadeia em situ hibridização de DNA (HCR), que é um altamente sensível fluorescência na abordagem de situ hybridization (FISH). Os protocolos neste documento podem ser adaptados por pesquisadores interessados a identificar outros tipos de células ou linhas celulares que suportam MCPyV infecção. A abordagem descrita do peixe também poderia ser adaptada para a detecção de níveis baixos de DNAs virais presentes na pele humana infectada.

O protocolo descrito neste manuscrito permitiu o isolamento de uma população quase homogênea de HDFs (Figura 1). Como demonstrado pela coloração imunofluorescente, quase 100% da células dérmicas humanas isolado usando nas condições descritas no presente protocolo foram positivamente manchado por colágeno, vimentina e marcadores de fibroblastos dérmicos eu24, mas negativo para o ser humano marcador de queratinócitos do prep?...

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Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Aqui, apresentamos um protocolo para infectar primário dos fibroblastos dérmicos humano com MCPyV. O protocolo inclui o isolamento de fibroblastos dérmicos, preparação de virions MCPyV, infecção por vírus, mancha da imunofluorescência e fluorescência hibridação in situ. Este protocolo pode ser estendido para caracterizar as interações MCPyV-host e descobrindo outros tipos de células infectáveis pelo MCPyV.

Célula de Merkel Polyomavirus infecção e deteção

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

Apresentamos o primeiro modelo de cultura celular para infecção por Poliomavírus Celular de Merkel. O protocolo inclui isolamento dos fibroblastos dérmicos, preparação da infecção pelo vírus MCPyV, coloração imunofluorescente e hibridização fluorescente in situ. Este protocolo permite estudar o ciclo infeccioso mcpyv e interações com células hospedeiras, evitando artefatos associados à superexpressão de genes virais.Para começar, use uma tesoura para cortar a gordura e o tecido subcutâneo do prepúcio neonatal humano. Corte a amostra de pele em metades ou trimestres. Coloque o tecido em 5 mililitros de 10 miligramas por mililitro de base II NPBS, suplementado com antibiótico-antimíctico.Incubar a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use fórceps de microdisseção para separar cuidadosamente a epiderme das camadas dérmicas em um prato de 10 centímetros. Transfira o tecido dérmico resultante para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 5 mililitros de 2 miligramas por colagenase mililitro tipo IV em meio livre de FBS complementado com antibiótico-anitmycotic.Incubar a amostra a 37 graus Celsius em dióxido de carbono de 5% com agitação periódica por quatro a seis horas, até que apenas alguns agregados de tecido macroscópico permaneçam. Depois disso, use uma pipeta de 10 mililitros para pipeta a solução amostral para cima e para baixo vigorosamente 10 vezes, liberando células únicas da derme. Centrifugar a 180 g por cinco minutos e descartar o supernatante.Emplaque as células dissociadas em meio DMEM suplementado. No final da tarde ou à noite, semente 6 milhões de células 293TT28 em um prato de 10 centímetros contendo meio DMEM suplementado. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte, certifique-se de que as células são cerca de 50% confluentes, depois transfeito as células com 66 microliters de reagente transfeccionado, 12 microgramas de MCPyV re-ligado isolar DNA R17B, 8,4 microgramas de expressão ST plasmid pMtB, e 9,6 microgramas de expressão LT plasmid pADL. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, quando as células transfeinadas são quase confluentes, experimento as células e as transferem para um prato de 15 centímetros para expansão contínua.Quando esse prato se tornar quase confluente, transfira as células em três novos pratos de 15 centímetros. Quando esses novos pratos se tornarem quase confluentes, colde as células como descrito no protocolo de texto. Centrífuga a 180 g em temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, remova o supernasce e adicione um volume celular de magnésio DPBS. Adicione 25 sulfato de amônio micromolar, seguido por 0,5% Triton X-100, 0,1% benzonase e 0,1% de um DNAse dependente de ATP. Misture bem e incubar a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, esfrie a mistura no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione 0,17 volume de cloreto de sódio. Misture e incubar no gelo por mais 15 minutos.Centrifugar a 12 mil g a 4 graus Celsius por 10 minutos. Se o supernatante não estiver claro, inverta suavemente o tubo e repita a centrifugação. Depois disso, transfira o supernatante para um novo tubo.Resuspend a pelota em 1 volume de DPBS suplementado com 0,8 mols de cloreto de sódio. Centrifugar a 12 mil g a 4 graus Celsius por 10 minutos. Se o supernatante não estiver claro, inverta suavemente o tubo e repita a centrifugação.Combine as duas supernacantas e centrífuga novamente a 12 mil g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta para depositar gradientes de iodixanol em tubos de polímero de paredes finas, conforme descrito no protocolo de texto. Carregue 3 mililitros do supernanato contendo vírus esclarecido em cima do gradiente iodixanol preparado.Centrifugar com rotor SW 55 Ti a 234 mil g e a 16 graus Celsius por 3,5 horas, certificando-se de definir a aceleração e desaceleração para desacelerar. Após a ultracentrifugação ser concluída, colete 12 frações em tubos siliconizados. Depois de manter e desprender as células, a 10 mililitros de DMEM suplementado e meio F12 para o prato.Transfira a solução celular para um tubo de 15 mililitros. Centrífuga a 180 g por dois minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em DMEM e F12 médio suplementados a uma densidade celular entre 20 mil e 40 mil células por mililitro.Em seguida, sementes 200 ou 400 microliters da suspensão celular suplementadas com 1 miligrama por mililitro de colagenase tipo IV em cada poço de uma placa de 24 ou 96 poços, respectivamente. Remova o estoque de viron MCPyV do congelador de menos 80 graus Celsius e coloque no gelo para descongelar. Adicione 1 bilhão de equivalentes de genoma viral de virions MCPyV por um microliter de iodixanol para cada 2500 a 5000 células a serem infectadas.Bata suavemente na lateral da placa e incuba a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Primeiro, fixe as células em deslizamentos de cobertura com 4% pfa em PBS por 10 minutos, depois lave os deslizamentos de tampa duas vezes com PBS e trate-as com 70% de etanol a quatro graus Celsius durante a noite para permeabiliizar as células. No dia seguinte, substitua o etanol por tampão de hidratação da sonda e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos para pré-hibridizar as amostras.30 minutos antes do fim da incubação de pré-hibridização, diluir as sondas na solução de hibridização da sonda a uma diluição de 1:500 e incubar a 45 graus Celsius. Quando as incubações estiverem completas, pipeta aproximadamente 10 microlitros da mistura da sonda diluída em um slide de microscópio para cada deslizamento de cobertura. Coloque cada lado da célula de deslizamento de cobertura para baixo em sua respectiva gota de mistura de hibridização.Usando uma quantidade liberal de cimento de borracha, sele as bordas e a parte de trás de cada deslizamento de cobertura ao seu slide. Coloque o slide no lado plano de um bloco de calor e aqueça-os a 94 graus Celsius por três minutos. Depois disso, transfira o slide para uma câmara umidificada e incuba-os a 45 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, use fórceps para descascar cuidadosamente o cimento de borracha. Coloque a tampa deslizando lado da célula para cima nos poços de uma placa de 24 poços e lave-as com tampão de lavagem da sonda três vezes à temperatura ambiente. Adicione 200 microliters de tampão de amplificação a cada poço contendo um deslizamento de cobertura e incubar à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos.Enquanto isso, anneal cada um dos dois grampos de oligonucleotídeo rotulados reconhecendo as sondas em tubos PCR separados aquecendo-os a 94 graus Celsius por 90 segundos, e depois resfriando-os à temperatura ambiente por 30 minutos. Misture os grampos em tampão de amplificação a uma diluição de 1:50. Em seguida, estique o filme de parafina sobre a face aberta de uma tampa de placa de 12 poços para fazer uma superfície para a reação de amplificação.Pipeta 50-100 gotículas de microliter da mistura de grampos no filme de parafina para cada deslizamento de cobertura. Usando fórceps, remova cuidadosamente cada deslizamento de cobertura da solução de pré-amplificação e toque na borda de um lenço descartável poroso para secar. Coloque cada lado da célula de deslizamento de cobertura seca para baixo em uma gota de amplificação.Transfira a tampa da placa para uma câmara umidificada e incubar durante a noite à temperatura ambiente e no escuro. No dia seguinte, devolva os deslizamentos de cobertura para os poços da placa de 24 poços. Adicione 5X SSCT contendo DAPI a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora.Depois disso, lave as amostras duas vezes com 5X SSCT em temperatura ambiente. Monte a tampa lavada desliza em slides de microscópio e use um microscópio de fluorescência invertida para analisar as células e a imagem das amostras. Neste estudo, uma população quase homogênea de fibroblastos dérmicos humanos é isolada.A coloração imunofluorescente revela que quase 100% das células dérmicas humanas isoladas estão positivamente detidas para marcadores de fibroblasto dermal, vimentina e colágeno, mas negativo para o marcador de queratinócito de foreskin humano K14. Os virions MCPyV são então gerados e depois de visualizar a banda de virions MCPyV concentradas no núcleo do gradiente, 500 frações de microliter são coletadas e mcPyV qPCR é realizado para identificar as frações de pico. Imagens imunofluorescentes de HDFs infectados com MCPyV são mostradas aqui, onde células que são LT positivas, VP1 positivas ou lt e VP1 positivo são consideradas positivas para a infecção pelo MCPyV.Mais de 30% das células são LT positivas, e mais de 10% são VP1 positivas. Os genomas MCPyV replicados nas células infectadas são detectados usando tanto o PEIXE HCR-DNA quanto o PEIXE DE DNA Imunofluorescente-HCR-DNA. Enquanto o HCR-DNA FISH revela a localização do DNA MCPyV presente na fábrica de replicação, os métodos de peixes imunofluorescentes-HCR-DNA permitem a detecção simultânea do DNA MCPyV e da co-localização da proteína LT nos centros de replicação.Para alcançar a melhor eficiência de infecção por vírus, é muito importante que o MCPyV esteja concentrado em pelo menos 2 x 10 a 8º genoma do vírus por microliter, já que o iodoxanol é tóxico para as células. Após a infecção por MCPyV dos fibroblastos dérmicos, muitas análises biológicas moleculares podem ser realizadas, incluindo imunofluorescência, imuno-bloqueio, imunopositigação e ensaio baseado em qPCR. O sistema de infecção que descrevemos torna possível que os pesquisadores estudem estágios da infecção pelo MCPyV, como tráfico nuclear e embalagens virais.MCPyV é um vírus BSL-2, mas pouco se sabe sobre seu potencial de patologia nas quantidades alcançadas em um ambiente laboratorial. Portanto, os pesquisadores devem tomar precauções para evitar a exposição ao vírus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Imunologia e Infecção

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...