Name: human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Nous remercions les bénévoles en bonne santé qui ont gentiment donné du sang pour la présente étude. Nous remercions la Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) et le leadership de l’étude Fox BioNet (FBN) pour leur soutien et leur contribution au protocole écrit et à la vidéo. Nous remercions le professeur Alexander Zimprich de l’Université de Vienne en Autriche d’avoir testé notre protocole et notre collaboration. Nous apprécions la contribution de Paul Davies au projet (directeur général de la MRC PPU). Nous reconnaissons également l’excellent soutien technique de l’Unité de phosphore et d’ubiquitylation des protéines de la MRC (PPU), à savoir la synthèse chimique (Natalia Shpiro pour la synthèse MLi-2), les équipes de purification des anticorps du PPU Hilary McLauchlan et James Hastie). Nous remercions Mhairi Towler et Fraser Murdoch de Vivomotion pour leur aide à faire les vidéos et les animations. Nous remercions Steve Soave de 81 films pour l’aide avec les montages finaux. Esther Sammler est soutenue par une bourse universitaire clinique senior écossaise et a reçu un financement de Parkinson’s UK (K-1706).

Selon la réglementation locale du Royaume-Uni, toutes les manipulations et les canalisations de sang humain sont entreprises dans un cabinet de sécurité biologique de catégorie 2. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au comité local d’examen de l’éthique et tous les participants ont donné leur consentement éclairé.
1. Préparation
<ol><li>Préparer 0,1 mL de solution de stock EDTA 1 contenant 100 mM EDTA en saline tamponnée par phosphate (PBS).</li>
	<li>P...

<ol>
	<li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLi-2,+a+Potent,+Selective,+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition.">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Therapies+for+Parkinson's+Disease:+From+Genetics+to+the+Clinic.">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li><li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases.">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2:+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors.">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li><li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+kinase+in+Parkinson's+disease.">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li><li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice.">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li><li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson's+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition.">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Parkinson's+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils.">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li><li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+3-(4-Pyrimidinyl)+Indazole+(MLi-2),+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity.">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li><li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson's+disease+kinase.">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li><li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+VPS35[D620N]+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human.">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li><li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics.">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III.">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical &amp; Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li><li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils.">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32 (2009).</li></ol>

Des preuves cliniques, génétiques et biochimiques convaincantes indiquent un rôle important pour LRRK2 et en particulier sa fonction de kinase dans la maladie de Parkinson7. LRRK2 inhibiteurs de kinase ont été développés et entrent essais cliniques2,4,12. En tant que tel, il est nécessaire d’exploiter LRRK2 comme biomarqueur pour l’engagement cible ainsi que la stratification des patients. Not...

Les tentatives visant à ralentir ou à stopper la maladie de Parkinson (MP) ont jusqu’à présent échoué. La découverte de mutations hyperactivantes dans la kinase répétitive riche en leucine 2 (LRRK2) qui causent et/ou augmentent le risque de a conduit au développement des inhibiteurs de la kinase LRRK21,2,3. Ceux-ci sont maintenant entrés dans les essais cliniques4. La fonction exacte de LRRK2 n’est pas claire, mais un progrès majeur a été l’identification d’un sous-ensemble de protéines Rab GTPase, y compris Rab10, comme les premiers substrats physiologiques de bonne foi de la kinase LRRK25,6,7. Les principaux défis à l’ère des thérapies modificateurs de la maladie sont les marqueurs biochimiques de l’état d’activation de kinase LRRK2 et l’engagement cible des inhibiteurs de la kinase LRRK2.
Jusqu’à présent, le principal marqueur pharmacocinétique pour les inhibiteurs LRRK2 in vivo a été un groupe de résidus de sérines constitutivement phosphorylated de LRRK2, en particulier la sérine 935, qui deviennent déphosphorylated en réponse à divers inhibiteurs LRRK28,9. Cependant, la phosphorylation de la sérine 935 ne est pas corrélée avec l’activité intrinsèque de kinase cellulaire LRRK2 parce qu’elle n’est pas directement phosphorée par LRRK2 et est encore phosphorylée dans LRRK210,inactive à la kinase. LRRK2 activité kinase se corrèle bien avec l’autophosphorylation de la sérine 1292, mais il n’est en termes pratiques pas une lecture appropriée pour l’activité endogène LRRK2 kinase par l’analyse immunoblot des extraits de cellules entières en raison de l’absence actuelle d’anticorps fiables et phosphospecific pour ce site10,11.
Nous avons développé un essai robuste et facile pour quantifier l’activité de la voie de la kinase LRRK2 dans les cellules sanguines périphériques humaines qui mesure la phosphorylation LRRK2 de sa protéine cible physiologique Rab10 à la thréonine 7311. Le sang périphérique est facilement accessible par venesection, qui est un faible risque et une procédure rapide qui provoque un inconfort minimal. Nous nous concentrons sur les neutrophiles sanguins périphériques humains parce qu’ils constituent une population abondante (37-80% de tous les globules blancs) et les cellules homogènes qui exprime des niveaux relativement élevés de LRRK2 et Rab1011. En outre, les neutrophiles sanguins périphériques peuvent être isolés rapidement et efficacement en employant une approche négative immunomagnétique. Pour s’assurer que la phosphorylation Rab10 observée ultérieure est médiée par LRRK2, chaque lot de neutrophiles est incubé avec ou sans un inhibiteur puissant et sélectif de la kinase LRRK2 (nous utilisons et recommandons MLi-2)2,12. Ceci est ensuite suivi par la lyse cellulaire dans un tampon contenant l’inhibiteur de la protéase diisopropyl fluorophosphate (DIFP), qui est nécessaire pour supprimer l’activité intrinsèque de protéase de sérine qui est connue pour être élevée dans les neutrophiles13. Pour l’analyse finale par immunoblotting quantitatif, nous recommandons d’utiliser l’anticorps monoclonal de lapin MJFF-pRab10 qui détecte spécifiquement le Rab10 Thr73-phosphoepitope et ne réagit pas contre-réagit avec d’autres protéines Rab phosphorylated14. La sélectivité et la spécificité de cet anticorps ont été validées dans des modèles de surexpression de différentes protéines Rab et une ligne cellulaire A549 Rab10 knock-out14. Ainsi, nous mesurons la différence dans la phosphorylation Rab10 dans les lysates neutrophiles qui ont été traités avec et sans un inhibiteur puissant et sélectif de la kinase LRRK22. Alternativement, les échantillons pourraient également être analysés par d’autres méthodes, telles que la spectrométrie quantitative de masse.
En conclusion, la phosphorylation Rab10 contrôlée par LRRK2 est un marqueur supérieur de l’activité de kinase LRRK2 à la phosphorylation LRRK2 à la serine 935 et les neutrophiles du sang périphérique humain sont une ressource précieuse pour la recherche de dans LRRK2. Notre protocole fournit un essai robuste et facile pour interroger l’activité de voie LRRK2 dans les neutrophiles périphériques de sang et permet la stratification biochimique des individus avec l’activité accrue de kinase de LRRK215. Fait important, ces personnes peuvent bénéficier du futur traitement inhibiteur de la kinase LRRK2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1 mL Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.762</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1.5 mL Micro tubes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">72.690.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1254.025&#160;</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.113</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">15 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">188 271</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.760.002</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">25 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1685.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">50 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">227 261</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube</td>
			<td style="width:132px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:95px;">BD 367525</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Beckman</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Category 2 biological safety cabinet.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:132px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">11836170001</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DIFP (Diisopropylfluorophosphate)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">D0879</td>
			<td style="width:432px;">Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">6250</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dry ice or liquid nitrogene</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">14190094</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Easy 50 EasySep Magnet&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">18002</td>
			<td style="width:432px;">for holding 1 x 50ml conical tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">19666</td>
			<td style="width:432px;">This contains Solutions called &#8220;Isolation Cocktail&#8221; and &#8220;RapidSpheres magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E3889</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ethanol, in spray bottle</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ice</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Isopropanol (anhydrous grade)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">278475</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &#946;-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) &#946;-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 &#956;g/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td>
			<td style="width:132px;">Merck</td>
			<td style="width:95px;">438194-10MG</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Microcystin-LR</td>
			<td style="width:132px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:95px;">ALX-350-012-M001</td>
			<td style="width:432px;">1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:132px;">Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">450243</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">NaF</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S7920</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Odyssey CLx scan Western Blot imaging system</td>
			<td style="width:132px;">Odyssey</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Permanent marker pen</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Personal protection equipment</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">21875034</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sodium pyrophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S22</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S0389</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suggested antibodies for Western blotting</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]</td>
			<td style="width:132px;">abcam</td>
			<td style="width:95px;">ab230261</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:132px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:95px;">5174</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 680LT</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-68020</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32210</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-rabbit IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32211</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
			<td style="width:132px;">generated by nanoTools (nanotools.de)</td>
			<td style="width:95px;">not applicable*</td>
			<td style="width:432px;">used at 2 &#956;g/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody</td>
			<td style="width:132px;">Antibodies Incorporated</td>
			<td style="width:95px;">&#160;75-253</td>
			<td style="width:432px;">used at 1 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">pS935-LRRK2</td>
			<td style="width:132px;">MRC PPU Reagents and Services</td>
			<td style="width:95px;">UDD2</td>
			<td style="width:432px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation

La kinase répétée riche en leucine 2 (LRRK2) est le gène le plus souvent muté dans la maladie héréditaire de Parkinson (PD) et toutes les mutations pathogènes de LRRK2 ont comme conséquence l’hyperactivation de sa fonction de kinase. Ici, nous décrivons un essai facile et robuste pour quantifier l’activité de voie de kinase de LRRK2 dans les neutrophiles périphériques humains de sang en mesurant la phosphorylation LRRK2-contrôlée de l’un de ses substrats physiologiques, Rab10 à la thréonine 73. L’analyse de l’immunoblotting décrite nécessite un anticorps entièrement sélectif et phosphospécifique qui reconnaît le phosphore épitopique Rab10 Thr73 par LRRK2, comme l’anticorps monocnel MJFF-pRab10 lapin. Il utilise des neutrophiles sanguins périphériques humains, parce que le sang périphérique est facilement accessible et les neutrophiles sont un constituant abondant et homogène. Fait important, les neutrophiles expriment des niveaux relativement élevés de LRRK2 et Rab10. Un inconvénient potentiel des neutrophiles est leur activité intrinsèque élevée de protéase de sérine, qui nécessite l’utilisation des inhibiteurs très puissants de protéase tels que la neurotoxine d’organophosphorus diisopropylfluorophosphate (DIFP) dans le cadre du tampon de lyse. Néanmoins, les neutrophiles sont une ressource précieuse pour la recherche sur l’activité de la voie kinase LRRK2 in vivo et devraient être considérés pour l’inclusion dans les collections de biorepository.

Notre essai permet d’interroger l’activation de la kinase LRRK2 associée au chez les neutrophiles du sang périphérique humain avec la phosphorylation Rab10 dépendante de LRRK2 comme lecture. Les neutrophiles sont une population de globules blancs périphériques homogènes et abondantes qui exprime des niveaux élevés des protéines LRRK2 et Rab10(figure 1). La seule autre population cellulaire parmi les cellules mononucléaires périphériques restantes (PBMC) avec un nombre élev?...

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Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Les mutations dans le gène riche de leucine de répétition de kinase 2 (LRRK2) causent la maladie héréditaire de Parkinson. Nous avons développé une méthode facile et robuste pour évaluer la phosphorylation LRRK2-contrôlée de Rab10 dans les neutrophiles périphériques humains de sang. Ceci peut aider à identifier des individus avec l’activité accrue de voie de kinase de LRRK2.

Isolement humain de neutrophile de sang périphérique pour interroger la voie de kinase LRRK2 associée de Parkinson en évaluant la phosphorylation de Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode pour évaluer l’activité endogène de kinase LRRK2 dans le sang périphérique humain. Ceci est réalisé en surveillant la phosphorylation lrrk2-médiée des protéines de Rab, employant les anticorps monoclonaux de Rab phospho-spécifiques de fondation de Michael J.Fox. Ici, nous nous concentrons sur les neutrophiles sanguins périphériques humains comme constituant de la population homogène de site avec des niveaux élevés d’expression de Rab2 et rab10.L’isolement du neutrophile est basé sur une sélection négative qui, dans les 40 minutes de l’action terminée permet l’isolement de 99% des neutrophiles purs et viables tout en donnant une grande quantité de niveaux de protéines. Recueillir 10 millilitres de sang dans un tube de collecte de sang. Mélanger délicatement en inversant les tubes sept à huit fois.Transférer 10 millilitres de sang dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter au sang 100 microlitres de solution de stock EDTA 1, 0,1 molar EDTA PBS Solution, mélanger délicatement. Ajouter 500 microlitres cocktail d’isolement, 50 microlitres par millilitre de la trousse d’isolement neutrophile à l’échantillon de sang entier.Vortex les perles magnétiques du kit d’isolation neutrophile pendant 30 secondes avant utilisation afin de résuspendre les perles magnétiques très fines. Ajouter 500 perles magnétiques de microlitres à l’échantillon de sang et mélanger délicatement en inversant le tube plusieurs fois. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Rechargez le tube jusqu’à 50 millilitres avec la solution de stock EDTA 2. Il s’agit d’une solution millimolaire EDTA PBS. Mélanger en descendant très doucement de haut en bas deux à trois fois.Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter l’agitation ultérieure du tube. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Suspension cellulaire enrichie de pipette soigneusement qui contient des neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant et évitez la collecte et la perturbation des globules rouges au fond du tube. Laissez environ 10 millilitres de la suspension des globules rouges derrière au fond du tube. Vortex perles magnétiques pendant 30 secondes avant utilisation et ajouter 0,5 millilitre perles magnétiques au tube contenant les neutrophiles enrichis.Mélanger délicatement en inversant le tube. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter toute agitation ultérieure.Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Pipette soigneusement la suspension cellulaire enrichie qui contient des neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant.Laisser environ cinq millilitres de suspension au fond du tube. Pour assurer l’élimination complète des perles magnétiques du mélange cellulaire, placez le tube contenant des cellules enrichies dans l’aimant. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.Pipette soigneusement la suspension cellulaire enrichie qui contient maintenant des neutrophiles purs dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant. Laissez environ cinq millilitres de suspension au fond du tube.Recharger les cellules isolées avec une solution millimolaire de stock EDTA 2 à un volume final d’environ 41 millilitres. Pipette de haut en bas pour mélanger. Divisez également la solution en deux tubes d’environ 20 millilitres dans chaque tube.Centrifugeuse des deux tubes à 335G pendant cinq minutes. Pendant l’étape de centrifugation, prendre le stock inhibiteur de MLi-2, 200 micromolaire slash 1000X concentration du congélateur moins 80 degrés et laisser à température ambiante pour une utilisation ultérieure. Immédiatement après l’étape de centrifugation et sans agitation des tubes, versez le supernatant sans déranger les granulés de neutrophile.resuspendez chaque granule cellulaire en 10 millilitres de milieu de culture cellulaire à température ambiante en pipetting doucement les cellules de haut en bas quatre fois. Étiquetez un tube DMSO et l’autre tube MLi-2. Au tube étiqueté DMSO ajouter 10 microlitres de DMSO et ajouter 10 microlitres de 200 micromolaires MLi-2 solution de stock en pipetting doucement de haut en bas pour mélanger.Incuber des échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Mélanger délicatement par inversion toutes les 10 minutes pendant la période d’incubation. Pendant le traitement inhibiteur de la kinase LRRK2 de 30 minutes, retirez la solution de stock DIFP molaire du congélateur à moins 80 degrés et placez-la dans le capot de fumée sur la glace.Ensuite, déplacez un milligramme par millilitre solution de stock microcystine-LR à partir du congélateur de moins 80 degrés et placez-le à température ambiante pour décongeler. Décongeler un aliquot, 0,25 millilitre du tampon de lyse en le sortant du congélateur, permettre de décongeler à température ambiante, puis le placer sur la glace pour une utilisation ultérieure. Préparez un millilitre de milieu RPMI contenant un microlitre de DMSO appelez ce tampon de resuspension DMSO.Préparez un millilitre de milieu RPMI contenant un microlitre de 200 micromolaire MLi-2 ou un inhibiteur alternatif de kinase LRRK2 et appelez ce tampon de resuspension MLi-2. Après la période d’incubation de 30 minutes, centrifuger les deux tubes à 335G pendant cinq minutes, comme avant. Jetez soigneusement le supernatant dans chaque tube sans déranger la pastille de neutrophile.Pour le tube étiqueté DMSO, résuspendez doucement les granulés dans un millilitre de tampon de resuspension DMSO. Et pour le tube étiqueté MLi-2, réutilisez les granulés dans un millilitre de tampon de resuspension MLi-2. Transférer les granulés cellulaires résuspendus vers les tubes de centrifugation correspondants étiquetés DMSO et MLi-2 et les centrifugeuses des deux tubes à 335G pendant trois minutes.Pendant l’étape de centrifugation, préparer le tampon de lyse. Dans le capot des vapeurs, ajouter soigneusement 0,25 microlitres de solution DIFP molaire de 0,5 molaire, ainsi que 0,25 microlitres d’un milligramme par millilitre microcystine-LR au tampon de lyse de 0,25 millilitre. Mélanger et laisser sur la glace jusqu’à utilisation.Immédiatement après la centrifugation, retirer soigneusement et complètement tout supernatant à l’intérieur d’une pipette sans déranger la pastille de neutrophile et placer les tubes sur la glace. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de tampon de lyse contenant du DIFP et de la microcystine-LR à chaque tube. À l’aide d’une pipette de 100 à 200 microlitres, résuspendez les granulés cellulaires en faisant monter et descendre environ cinq à dix fois.Allongez les cellules sur la glace pendant 10 minutes. Puis, des tubes de centrifugeuse à 20 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour enlever les débris cellulaires. Transférer le supernatant DMSO et MLi-2 contenant des lysates de neutrophile dans de nouveaux tubes de centrifugation.Jeter les granulés de débris. Les lysates de neutrophile sont maintenant prêts à l’emploi ou peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à moins 80 degrés pour une analyse future. À l’aide des données de la base de données d’importation accessible au public, ce graphique montre qu’une abondance des protéines LRRK2 et Rab10 est particulièrement élevée dans les neutrophiles et les monocytes sanguins périphériques humains.Isoler les neutrophiles sanguins périphériques humains avec cette procédure entraîne un rendement impur élevé des cellules. Le tableau en haut montre le nombre total de cellules isolées de 10 millilitres de sang périphérique provenant de trois donneurs en bonne santé. La pureté et la viabilité des cellules isolées ainsi que le rendement total en protéines lysate sont également démontrés.Après traitement avec et sans l’inhibiteur de kinase LRRK2, MLi-2, les neutrophiles sont lysés en présence de l’inhibiteur puissant de protéase, DIFP. Pour la figure B sur le côté gauche, 10 microgrammes d’extraits de cellules entières par voie ont été soumis à l’analyse quantitative multiplexe d’immunoblot avec les anticorps indiqués. Le chiffre de droite, C, démontre l’importance du DIFP pour la prévention de la dégradation protéolytique, en particulier de la grande protéine LRRK2.En comparaison, les concentrations élevées de PMSF seules sont moins efficaces. Voici montré que la phosphorylation rab10 contrôlée par LRRK2 est significativement augmentée d’environ trois fois dans les neutrophiles périphériques de sang dérivés des patients présentant la maladie héréditaire de Parkinson hébergeant une mutation hétérozygote de VPS35 D620N par rapport aux contrôles. Le graphique supérieur montre l’analyse des immunoblots multiplexes et le fond, dont la quantification est.Ceci suggère que la mutation VPS35 D620N active le chemin de kinase de LRRK2 de l’activité par un mécanisme pourtant inconnu. En résumé, nous présentons un essai facile et robuste pour mesurer l’activité de voie de kinase de LRRK2 en surveillant la phosphorylation de protéine de Rab, telle que Rab10, dans les neutrophiles périphériques-dérivés humains, cette méthode nous permet d’évaluer l’activité de voie de LRRK2 et de déterminer comment les mutations, les états de la maladie ou les inhibiteurs modulent l’activité de voie de LRRK2.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Dosage de l&#39;activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Recherche

Biochimie

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Étudier les Interactiens ARN de la protéine Kinase RNA-activé durant le Cycle cellulaire chez les mammifères

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Améliorer l'engraftment des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme par l'intermédiaire d'une inhibition transitoire de l'activité de Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Dépistage de l'inhibiteur de kinase dans les microréseaux de protéines humaines auto-assemblés

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Essai non radioactif pour mesurer la phosphorylation polynucléotide des petits substrats nucléotides

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...