Name: human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

אנו מודים למתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות דם למחקר הנוכחי. אנו מודים לקרן מייקל ג'יי פוקס לחקר פרקינסון (MJFF) ולמנהיגות המחקר פוקס ביונט (FBN) לתמיכה ולכניסה לפרוטוקול הכתוב ולווידאו. אנו מודים לפרופסור אלכסנדר זיפריץ ' מאוניברסיטת וינה באוסטריה על בחינת הפרוטוקול ושיתוף הפעולה שלנו. אנו מעריכים את התרומות של פול דייוויס לפרויקט (מנהל כללי של MRC PPU). אנו מכירים גם את התמיכה הטכנית המצוינת של זרחון חלבון MRC והיחידה אוביקווילציה (PPU) כלומר סינתזה כימית (נטליה שפירו MLi-2), MRC PPU ריאגנטים ושירותים נוגדנים לטיהור צוותים (מתואם על ידי הילארי McLauchlan וג Hastie). אנו מודים מולר מטאולר ו פרייזר מרדוק מ Vivomotion עבור עזרתם עם עשיית קטעי וידאו ואנימציות. אנו מודים לסטיב סואב מ 81 סרטים לסיוע בעריכות הסופיות. אסתר סממלר נתמכת על ידי מלגת לימודים אקדמית בכירה סקוטית וקיבלה מימון של פרקינסון בבריטניה (K-1706).

על פי רגולציה בבריטניה המקומית כל המניפולציות וליטוף של דם אנושי נעשים בארון בטיחות בקטגוריה 2. כל ההליכים בוצעו בהתאם לועדת האתיקה המקומית וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מושכלת.
1. הכנה
<ol><li>הכינו 0.1 mL של מניות EDTA פתרון 1 המכיל 100 mM EDTA ב-פוספט באגירה מלוחים (PBS).</li>
	<li>הכינו 60 mL של פתר?...

<ol>
	<li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLi-2,+a+Potent,+Selective,+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition.">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Therapies+for+Parkinson's+Disease:+From+Genetics+to+the+Clinic.">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li><li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases.">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2:+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors.">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li><li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+kinase+in+Parkinson's+disease.">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li><li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice.">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li><li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson's+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition.">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Parkinson's+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils.">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li><li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+3-(4-Pyrimidinyl)+Indazole+(MLi-2),+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity.">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li><li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson's+disease+kinase.">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li><li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+VPS35[D620N]+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human.">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li><li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics.">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III.">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical &amp; Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li><li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils.">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32 (2009).</li></ol>

הוכחה משכנעת קלינית, גנטית, וביוכימית מצביע על תפקיד חשוב עבור LRRK2 ובמיוחד הפונקציה קינאז שלה במחלת פרקינסון7. מעכבי LRRK2 קינאז פותחו והם נכנסים ניסויים קליניים2,4,12. ככזה יש צורך לנצל LRRK2 כסמן עבור מעורבות היעד, כמו גם המטופל ריב...

נסיונות להאט או להפסיק את מחלת פרקינסון (PD) נכשלו עד כה. הגילוי של מוטציות היפראותיים ב-לאוצין לחזור על קינאז 2 (LRRK2) הגורמות ו/או הגברת הסיכון למשטרה הובילה לפיתוח מעכבי LRRK2 קינאז1,2,3. אלה נכנסו עכשיו ניסויים קליניים4. הפונקציה המדויקת של LRRK2 אינו ברור, אבל התקדמות מרכזית כבר זיהוי של מערכת החלבונים של רב gtpase, כולל Rab10, כמו מצעים פיסיולוגיים בתום הראשון של הLRRK2 קינאז5,6,7. אתגרים מרכזיים בעידן של מחלות-שינוי therapeutics הם סמנים ביוכימיים של מצב הפעלה LRRK2 קינאז והתחייבות היעד של מעכבי LRRK2 קינאז.
עד כה, הסמן העיקרי של פרמקוטיק לLRRK2 מעכבי ב vivo הייתה מקבץ של שאריות סרין בצורה מצטברת של LRRK2, בפרט סרין 935, אשר הפכו להיות בתגובה למעכבי LRRK2 שונים8,9. עם זאת, סרין 935 זרחון אינו מתאם עם פעילות פנימית LRRK2 קינאז הפנימי משום שהוא אינו זרחי במישרין על-ידי LRRK2 והוא עדיין זרחבקינאז-לא פעיל LRRK210. LRRK2 קינאז פעילות מתאימה היטב עם הוספולציה של סרין 1292, אבל זה במונחים מעשיים לא מתאים לפעילות אנדודוגני LRRK2 קינאז על-ידי ניתוח חיסוני כתמי של תמציות תאים שלמות בשל היעדר הנוכחי של נוגדנים אמינים ופוספוסקיים עבור אתר זה10,11.
פיתחנו שיטת חזק וקל לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול בתאי הדם היקפיים האדם המודד LRRK2 זרחון מבוקר של חלבון היעד הפיזיולוגי שלה Rab10 ב טראונין 7311. דם היקפי נגיש בקלות על ידי ונציה, שהוא סיכון נמוך והליך מהיר הגורם אי-נוחות מינימלית. אנו מתמקדים בגוף היקפי דם נויטרופילים כי הם מהווים שופע (37-80% של כל כדוריות הדם הלבנות) ואת האוכלוסייה תאים הומוגנית המבטא רמות גבוהות יחסית של שני LRRK2 ו Rab1011. יתר על כן, דם היקפי נויטרופילים יכול להיות מבודד במהירות וביעילות על ידי שימוש בגישה שלילית אימונוגנטית. כדי להבטיח כי הנצפים לאחר מכן Rab10 זילציה מתווכת על ידי LRRK2, כל אצווה של נויטרופילים הוא מודבטים עם או בלי חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכבי (אנו משתמשים וממליצים mli-2)2,12. זה ואחריו לאחר מכן הפירוק התא במאגר המכיל את מעכב פרוטאז diisopropyl fluorophosphate (difp), אשר הכרחי לדיכוי פעילות סרין פרוטאז מהותי כי ידוע להיות גבוה נויטרופילים13. לניתוח הסופי של האנליזה הכמותית, אנו ממליצים על שימוש בנוגדן MJFF-pRab10 הארנב שמזהה במפורש את Rab10 Thr73-פוספופאפיפ ואינו מגיב באמצעות חלבונים אחרים זרחתיים מסוג14. סלקטיביות וספציפיות של נוגדן זה אומת במודלים overexpression של חלבונים שונים של ראב ו A549 Rab10 לנקוש קו תא14. כך, אנו למדוד את ההבדל Rab10 זרחון ב נויטרופילים lysates כי כבר טופלו עם וללא חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכב2. לחילופין, ניתן לנתח דגימות גם בשיטות אחרות, כגון ספקטרומטר מסה כמותי.
לסיכום, LRRK2 שבשליטת Rab10 זרחון הוא סמן מעולה של פעילות LRRK2 קינאז LRRK2 זרחון ב סרין 935 ו-היקפי הדם נויטרופילים היקפיים הם משאב רב ערך עבור מחקר PD לתוך LRRK2. הפרוטוקול שלנו מספק מעשה יציב וקל לחקור פעילות מסלול LRRK2 דם היקפיים נויטרופילים ומאפשר ריבוד ביוכימיים של אנשים עם פעילות מוגברת LRRK2 קינאז15. חשוב מכך, אנשים כאלה עשויים להפיק תועלת מטיפול מעכב LRRK2 קינאז עתידיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1 mL Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.762</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1.5 mL Micro tubes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">72.690.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1254.025&#160;</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.113</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">15 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">188 271</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.760.002</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">25 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1685.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">50 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">227 261</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube</td>
			<td style="width:132px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:95px;">BD 367525</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Beckman</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Category 2 biological safety cabinet.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:132px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">11836170001</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DIFP (Diisopropylfluorophosphate)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">D0879</td>
			<td style="width:432px;">Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">6250</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dry ice or liquid nitrogene</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">14190094</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Easy 50 EasySep Magnet&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">18002</td>
			<td style="width:432px;">for holding 1 x 50ml conical tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">19666</td>
			<td style="width:432px;">This contains Solutions called &#8220;Isolation Cocktail&#8221; and &#8220;RapidSpheres magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E3889</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ethanol, in spray bottle</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ice</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Isopropanol (anhydrous grade)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">278475</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &#946;-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) &#946;-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 &#956;g/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td>
			<td style="width:132px;">Merck</td>
			<td style="width:95px;">438194-10MG</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Microcystin-LR</td>
			<td style="width:132px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:95px;">ALX-350-012-M001</td>
			<td style="width:432px;">1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:132px;">Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">450243</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">NaF</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S7920</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Odyssey CLx scan Western Blot imaging system</td>
			<td style="width:132px;">Odyssey</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Permanent marker pen</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Personal protection equipment</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">21875034</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sodium pyrophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S22</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S0389</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suggested antibodies for Western blotting</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]</td>
			<td style="width:132px;">abcam</td>
			<td style="width:95px;">ab230261</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:132px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:95px;">5174</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 680LT</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-68020</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32210</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-rabbit IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32211</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
			<td style="width:132px;">generated by nanoTools (nanotools.de)</td>
			<td style="width:95px;">not applicable*</td>
			<td style="width:432px;">used at 2 &#956;g/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody</td>
			<td style="width:132px;">Antibodies Incorporated</td>
			<td style="width:95px;">&#160;75-253</td>
			<td style="width:432px;">used at 1 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">pS935-LRRK2</td>
			<td style="width:132px;">MRC PPU Reagents and Services</td>
			<td style="width:95px;">UDD2</td>
			<td style="width:432px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation

הלוצין העשיר חוזר קינאז 2 (LRRK2) הוא הגן השכיח ביותר במחלת פרקינסון תורשתית (PD) וכל מוטציות LRRK2 פתוגניים התוצאה היפרהפעלה של הפונקציה קינאז שלה. כאן, אנו מתארים שיטת קל ויציב לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול היקפי דם היקפיים על ידי מדידת LRRK2 זרחון מבוקר של אחד מצעים פיזיולוגיים שלה, Rab10 ב טראונין 73. הניתוח החיסוני המתואר מחייב מאוד בררני ופוספנטי הנוגדן כי מזהה את Rab10 Thr73 אפירופה זרחזיום על ידי LRRK2, כגון נוגדן MJFF-pRab10 הארנב מונובטיים. הוא משתמש דם היקפית אנושי נויטרופילים, כי דם היקפי נגיש בקלות נויטרופילים הם מרכיב שופע הומוגנית. חשוב מכך, נויטרופילים לבטא רמות גבוהות יחסית של LRRK2 ו Rab10. חיסרון פוטנציאלי של נויטרופילים הוא הפעילות הפנימית הגבוהה סרין פרוטאז שלהם, אשר מחייבת את השימוש של מעכבי פרוטאז חזק מאוד כגון diisopropylfluorophosphate הרעלן העצבי זרחן (DIFP) כחלק מאגר לפירוק. עם זאת, נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ב vivo וצריך להיחשב עבור הכללה לתוך משטרת ביוריאטורי אוספים.

הבדיקה שלנו מאפשרת לחקור את ההפעלה של LRRK2 קינאז PD-הקשורים המשטרה הקשורה בדם היקפי דם נויטרופילים עם LRRK2 תלוי Rab10 זרחון כמו בדיקה. נויטרופילים הם היקפיים ושופע היקפי דם לבנים האוכלוסייה המבטא רמות גבוהות של LRRK2 ו Rab10 חלבונים (איור 1). אוכלוסיית התאים היחידה היחידה בקרב תאי הדם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה להערכת פעילות קינאז LRRK2 אנדוגני בדם היקפי אנושי. זה מושגת על ידי ניטור LRRK2 מתווך זרחון של חלבונים Rab, העסקת מייקל J.Fox קרן פוספו ספציפי נוגדנים חד שבטיים כלבת. כאן אנו מתמקדים בניטרופילים של דם היקפי אנושי כקבוצה של אוכלוסיית אתר הומוגנית עם רמות ביטוי גבוהות הן של Rab2 והן של Rab10.בידוד הנויטרופילים מבוסס על בחירה שלילית שבתוך 40 דקות מיום סיום הפעולה מאפשרת בידוד של 99% נויטרופילים טהורים ובת קיימא וגם מניבה כמות גבוהה של רמות חלבון. לאסוף 10 מיליליטר של דם לתוך צינור איסוף דם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך צינורות שבע עד שמונה פעמים.להעביר 10 מיליליטר של דם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. הוסף לדם 100 microliters של פתרון מלאי EDTA 1, 0.1 פתרון EDTA PBS טוחן, לערבב בעדינות. הוסיפו 500 מיקרוליטרים לקוקטייל בידוד, 50 מיקרוליטר למיליליטר מערכת הבידוד של נויטרופילים לכל דגימת הדם.מערבולת את חרוזים מגנטיים מתוך ערכת בידוד נויטרופילים במשך 30 שניות לפני השימוש על מנת resuspend חרוזים מגנטיים עדין מאוד. מוסיפים 500 מיקרוליטרים חרוזים מגנטיים לדגימה בדם ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.למעלה צינור עד 50 מיליליטר עם פתרון מלאי EDTA 2. זהו פתרון EDTA PBS מילימולארי אחד. מערבבים על ידי צינורות בעדינות רבה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים.מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה, כדי למנוע תסיסה לאחר מכן של הצינור. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות פיפטה מועשרת השעיית תא המכיל נויטרופילים לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר.אין לגעת בצד הצינור כי הוא במגע עם מגנט ולהימנע איסוף והתלהמות של תאי הדם האדומים בתחתית הצינור. השאירו בערך 10 מיליליטר של ההשעיה של תא הדם האדום מאחור בתחתית הצינור. מערבולת חרוזים מגנטיים במשך 30 שניות לפני השימוש ולהוסיף 0.5 מיליליטר חרוזים מגנטיים לצינור המכיל את נויטרופילים מועשרים.מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה, כדי למנוע תסיסה הבאים.דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות pipette ההשעיה תא מועשר המכיל נויטרופילים בצינור חרוט חדש 50 מיליליטר. אל תיגע בצד הצינור כי הוא במגע עם המגנט.השאירו כחמישה מיליליטר של ההשעיה בתחתית הצינור. כדי להבטיח הסרה מלאה של חרוזים מגנטיים מתערובת התאים, מניחים צינור המכיל תאים מועשרים לתוך המגנט. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.בזהירות pipette ההשעיה תא מועשר כי עכשיו מכיל נויטרופילים טהורים לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר. אל תיגע בצד הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כחמישה מיליליטר של השעיה בתחתית הצינור.למעלה תאים מבודדים עם פתרון מלאי EDTA מילימולרי אחד 2 לנפח סופי של כ 41 מיליליטר. פיפטה למעלה ולמטה לערבב. מחלקים את הפתרון באופן שווה לשני צינורות עם כ -20 מיליליטר בכל צינור.צנטריפוגה שני הצינורות ב335G במשך חמש דקות. במהלך שלב הצנטריפוגה, קח את מלאי מעכבי MLi-2, 200 מיקרומולר קו נטוי 1000X ריכוז מתוך המקפיא מינוס 80 מעלות ולהשאיר בטמפרטורת החדר לשימוש הבא. מיד לאחר צעד הצנטריפוגה וללא תסיסה של הצינורות, לשפוך את supernatant מבלי להפריע כדורי נויטרופילים.תן שימוש חוזר בכל גלולת תא ב-10 מיליליטר של תאים בינוניים בטמפרטורת החדר על-ידי צינורות עדינים של תאים למעלה ולמטה ארבע פעמים. תווית צינור אחד DMSO והשני צינור MLi-2. כדי DMSO שכותרתו צינור להוסיף 10 microliter של DMSO ולהוסיף 10 microliters של 200 פתרון מלאי MLi-2 micromolar על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה לערבב.דגימות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך כל 10 דקות במהלך תקופת הדגירה. במהלך 30 דקות LRRK2 טיפול מעכבי קינאז להסיר 0.5 פתרון מלאי DIFP טוחן מן המקפיא מינוס 80 מעלות ומנחים ברדס אדים על קרח.לאחר מכן, להעביר מיליגרם אחד לכל מיליליטר Microcystin-LR פתרון מלאי מן המקפיא מינוס 80 מעלות מקום בטמפרטורת החדר כדי להפשיר. להפשיר aliquot, 0.25 מיליליטר של חיץ תזה על ידי לקיחת אותו מהמקפיא, לאפשר להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם אותו על קרח לשימוש הבא. הכן מיליליטר אחד של מדיום RPMI המכיל מיקרוליטר אחד של DMSO קרא למאגר ההתכווצות מחדש DMSO זה.הכן מיליליטר אחד של מדיום RPMI המכיל מיקרוליטר אחד של 200 מיקרומולאר MLi-2 או מעכב קינאז LRRK2 חלופי ולקרוא זה מאגר MLi-2 Resuspension. לאחר תקופת הדגירה של 30 דקות, צנטריפוגה שני הצינורות ב 335G במשך חמש דקות, כמו קודם. בזהירות להשליך את supernatant בכל צינור מבלי להפריע גלולת נויטרופילים.עבור הצינור המסווים DMSO, התן בעדינות גלולה במיליליטר אחד של מאגר ההתכווצות של DMSO. ולצינור המסויר MLi-2, תן שימוש חוזר גלולה במיליליטר אחד של חיץ ההמשך MLi-2. העבר כדורי תאים מתווסתים לצינורות צנטריפוגה תואמים שכותרתו DMSO ו- MLi-2 וצנטריפוגה שני הצינורות ב 335G במשך שלוש דקות.במהלך שלב הצנטריפוגה, הכן את מאגר התמוגה. במכסה המנוע של האדים, הוסיפו בזהירות 0.25 מיקרוליטרים של תוסף DIFP טוחן 0.5, כמו גם 0.25 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר מיקרוציסטין-LR למאגר תמוגה 0.25 מיליליטר. מערבבים ומשאירים על קרח עד לשימוש.מיד לאחר הצנטריפוגה, בזהירות לחלוטין להסיר את כל supernatant עם פיפטה מבלי להפריע גלולה נויטרופילים מניחים צינורות על קרח. מיד להוסיף 100 microliters של מאגר תיזה המכיל DIFP ומיקרוציסטין-LR לכל צינור. באמצעות פיפטה של 100 עד 200 מיקרוליטר, השתמש מחדש כדורי התא על ידי צינור למעלה ולמטה על חמש עד 10 פעמים.שכב תאים על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, צינורות צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. העבר DMSO ו MLi-2 על טבעי המכיל lysates נויטרופילים לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים.השלך כדורי פסולת. ליזטים נויטרופילים מוכנים כעת לשימוש או ניתן לצלם קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן במינוס 80 מעלות לניתוח עתידי. באמצעות נתונים ממאגר היבוא הזמין לציבור, גרף זה מראה כי שפע של חלבוני LRRK2 ו- Rab10 גבוה במיוחד בנייטרופילים ומונוציטים של דם היקפי אנושי.בידוד נויטרופילים בדם היקפי אנושי עם הליך זה גורם לתפוקה טמאה גבוהה של תאים. הטבלה בחלק העליון מראה את המספר הכולל של תאים מבודדים מ 10 מיליליטר של דם היקפי משלושה תורמים בריאים. כמו כן מוצגים טוהר וכדאיות של התאים המבודדים, כמו גם תפוקת ליזאט חלבון הכוללת.לאחר טיפול עם וללא מעכב קינאז LRRK2, MLi-2, נויטרופילים הם lysed בנוכחות מעכב פרוטאז חזק, DIFP. עבור איור B בצד שמאל, 10 מיקרוגרם של תמציות תאים שלמים לכל נתיב היו נתונים לניתוח אימונובלו כמותי מולטיפלקס עם הנוגדנים שצוינו. הנתון מימין, C, מדגים את החשיבות של DIFP למניעת השפלה פרוטאוליטית, במיוחד של חלבון LRRK2 הגדול.לשם השוואה, ריכוזים גבוהים של PMSF לבד הם פחות יעילים. הנה הראה כי זרחון Rab10 נשלט LRRK2 גדל באופן משמעותי על ידי כשלושה נויטרופילים בדם היקפי נגזר חולים עם מחלת פרקינסון תורשתית מחסה מוטציה VPS35 D620N הטרוזית בהשוואה לפקדים. הגרף העליון מציג את ניתוח האימונובלו מולטיפלקס ואת החלק התחתון, כימות שלו.הדבר מצביע על כך שהמוטציה VPS35 D620N מפעילה את נתיב הפעילות של LRRK2 kinase על ידי מנגנון שעדיין לא ידוע. לסיכום, אנו מציגים הערכה קלילה וחזקה למדידת פעילות מסלול LRRK2 kinase על ידי ניטור זרחון חלבון ראב, כגון Rab10, בנויטרופילים המופקים על ידי היקפי אנושי, שיטה זו מאפשרת לנו להעריך את פעילות מסלול LRRK2 ולקבוע כיצד מוטציות, מצבי מחלה או מעכבים לווסת את פעילות מסלול LRRK2.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...