Name: human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Vi takker de friske frivillige som vennligst donerte blod til den nåværende studien. Vi takker Michael J. Fox Foundation for Parkinsons Research (MJFF) og Fox BioNet-studieledelsen (FBN) for deres støtte og innspill til den skriftlige protokollen og videoen. Vi takker professor Alexander Zimprich fra Universitetet i Wien i Østerrike for å teste vår protokoll og samarbeid. Vi verdsetter bidragene fra Paul Davies til prosjektet (daglig leder av MRC PPU). Vi anerkjenner også den utmerkede tekniske støtten til MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), nemlig kjemisk syntese (Natalia Shpiro for syntesing av MLi-2), MRC PPU Reagenser og tjenester antistoffrenseteam (koordinert av Hilary McLauchlan og James Hastie). Vi takker Mhairi Towler og Fraser Murdoch fra Vivomotion for deres hjelp med å lage videoer og animasjoner. Vi takker Steve Soave fra 81 filmer for å få hjelp med de endelige redigerte. Esther Sammler støttes av en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship og har mottatt støtte fra Parkinsons UK (K-1706).

I henhold til lokal britisk regulering utføres alle manipulasjoner og pipettering av menneskelig blod i et biologisk sikkerhetsskap i kategori 2. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med lokale etikk gjennomgang styret og alle deltakerne har gitt informert samtykke.
1. Forberedelse
<ol><li>Forbered 0,1 ml EDTA Lageroppløsning 1 som inneholder 100 mM EDTA i fosfatbufret saltvann (PBS).</li>
	<li>Forbered 60 ml EDTA Lageroppløsning 2 som inneholder 1 mM EDTA i PBS.</li>
	<li>Forbered lysis...

<ol>
	<li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLi-2,+a+Potent,+Selective,+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition.">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Therapies+for+Parkinson's+Disease:+From+Genetics+to+the+Clinic.">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li><li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases.">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2:+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors.">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li><li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+kinase+in+Parkinson's+disease.">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li><li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice.">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li><li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson's+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition.">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Parkinson's+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils.">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li><li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+3-(4-Pyrimidinyl)+Indazole+(MLi-2),+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity.">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li><li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson's+disease+kinase.">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li><li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+VPS35[D620N]+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human.">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li><li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics.">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III.">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical &amp; Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li><li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils.">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32 (2009).</li></ol>

Overbevisende klinisk, genetisk og biokjemisk bevis peker mot en viktig rolle for LRRK2 og spesielt kinasefunksjonen i Parkinsons sykdom7. LRRK2 kinasehemmere er utviklet og går inn i kliniske studier2,,4,12. Som sådan er det behov for å utnytte LRRK2 som en biomarkør for målengasjement samt pasientstratifisering. Vår protokoll beskriver en robust og enkel analyse for å analysere LRRK2 kinase pathw...

Forsøk på å bremse eller stoppe Parkinsons sykdom (PD) har så langt mislyktes. Oppdagelsen av hyperaktiverende mutasjoner i leucinrike repetisjonkinase 2 (LRRK2) som forårsaker og/eller øker risikoen for PD har ført til utvikling av LRRK2 kinasehemmere1,2,3. Disse har nå inngått kliniske studier4. Den nøyaktige funksjonen til LRRK2 er uklar, men et stort fremskritt har vært identifisering av et undersett av Rab GTPase proteiner, inkludert Rab10, som de første bona fide fysiologiske substrater av LRRK2 kinase5,6,7. Viktige utfordringer i en tid med sykdomsmodifiserende terapeutiske midler er biokjemiske markører for LRRK2 kinase aktiveringsstatus og målengasjement av LRRK2 kinase hemmere.
Så langt har den viktigste farmakokinetiske markøren for LRRK2-hemmere in vivo vært en klynge av konstitutivt fosforert serinrester av LRRK2, spesielt serin 935, som blir defosforylert som svar på ulike LRRK2-hemmere8,9. Serine 935 fosforylering korrelerer imidlertid ikke med egencellulær LRRK2 kinase aktivitet fordi det ikke er direkte fosforylert av LRRK2 og er fortsatt fosforert i kinase-inaktiv LRRK210. LRRK2 kinase aktivitet korrelerer godt med autofosforylering av serin 1292, men det er i praksis ikke en egnet avlesning for endogene LRRK2 kinase aktivitet ved immunoblot analyse av hele celleekstrakter på grunn av dagens mangel på pålitelige og fosforspesifikke antistoffer for dette nettstedet10,11.
Vi har utviklet en robust og enkel analyse for å kvantifisere LRRK2 kinase pathway aktivitet i menneskelige perifere blodlegemer som måler LRRK2-kontrollert fosforylering av sitt fysiologiske målprotein Rab10 ved threonin 7311. Perifert blod er lett tilgjengelig ved veneseksjon, noe som er en lav risiko og rask prosedyre som forårsaker minimal ubehag. Vi fokuserer på humane perifere blod nøytrofiler fordi de utgjør en rikelig (37-80% av alle hvite blodlegemer) og homogen cellepopulasjon som uttrykker relativt høye nivåer av både LRRK2 og Rab1011. Videre kan perifere blod nøytrofiler isoleres raskt og effektivt ved å bruke en immunomagnetisk negativ tilnærming. For å sikre at den påfølgende observerte Rab10 fosforylering medieres av LRRK2, inkuberes hver gruppe nøytrofiler med eller uten en potent og selektiv LRRK2 kinasehemmer (vi bruker og anbefaler MLi-2)2,12. Dette etterfølges deretter av cellelyse i en buffer som inneholder proteasehemmeren diisopropylfluorofosfat (DIFP), som er nødvendig for å undertrykke den indre serinproteaseaktiviteten som er kjent for å være høy i nøytrofiler13. For den endelige analysen ved kvantitativ immunblotting anbefaler vi at du bruker MJFF-pRab10 kaninmonoklonalt antistoff som spesifikt oppdager Rab10 Thr73-fosfoepitop og ikke kryssreagerer med andre fosforerte Rab-proteiner14. Selektivitet og spesifisitet av dette antistoffet har blitt validert i overuttrykkmodeller av forskjellige Rab-proteiner og en A549 Rab10 knock-out celle linje14. Dermed måler vi forskjellen i Rab10 fosforylering hos nøytrofile lysater som har blitt behandlet med og uten en potent og selektiv LRRK2 kinasehemmer2. Alternativt kan prøver også analyseres ved andre metoder, for eksempel kvantitativ massespektrometri.
Til slutt er LRRK2-kontrollert Rab10 fosforylering en overlegen markør for LRRK2 kinase aktivitet til LRRK2 fosforylering ved serin 935 og humane perifere blod nøytrofiler er en verdifull ressurs for PD forskning på LRRK2. Vår protokoll gir en robust og enkel analyse for å avhøre LRRK2 pathway aktivitet i perifert blod nøytrofiler og tillater biokjemisk stratifisering av personer med økt LRRK2 kinase aktivitet15. Viktigere, slike individer kan ha nytte av fremtidig LRRK2 kinase hemmerbehandling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1 mL Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.762</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1.5 mL Micro tubes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">72.690.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1254.025&#160;</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.113</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">15 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">188 271</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.760.002</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">25 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1685.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">50 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">227 261</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube</td>
			<td style="width:132px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:95px;">BD 367525</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Beckman</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Category 2 biological safety cabinet.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:132px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">11836170001</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DIFP (Diisopropylfluorophosphate)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">D0879</td>
			<td style="width:432px;">Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">6250</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dry ice or liquid nitrogene</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">14190094</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Easy 50 EasySep Magnet&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">18002</td>
			<td style="width:432px;">for holding 1 x 50ml conical tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">19666</td>
			<td style="width:432px;">This contains Solutions called &#8220;Isolation Cocktail&#8221; and &#8220;RapidSpheres magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E3889</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ethanol, in spray bottle</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ice</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Isopropanol (anhydrous grade)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">278475</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &#946;-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) &#946;-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 &#956;g/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td>
			<td style="width:132px;">Merck</td>
			<td style="width:95px;">438194-10MG</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Microcystin-LR</td>
			<td style="width:132px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:95px;">ALX-350-012-M001</td>
			<td style="width:432px;">1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:132px;">Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">450243</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">NaF</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S7920</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Odyssey CLx scan Western Blot imaging system</td>
			<td style="width:132px;">Odyssey</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Permanent marker pen</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Personal protection equipment</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">21875034</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sodium pyrophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S22</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S0389</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suggested antibodies for Western blotting</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]</td>
			<td style="width:132px;">abcam</td>
			<td style="width:95px;">ab230261</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:132px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:95px;">5174</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 680LT</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-68020</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32210</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-rabbit IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32211</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
			<td style="width:132px;">generated by nanoTools (nanotools.de)</td>
			<td style="width:95px;">not applicable*</td>
			<td style="width:432px;">used at 2 &#956;g/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody</td>
			<td style="width:132px;">Antibodies Incorporated</td>
			<td style="width:95px;">&#160;75-253</td>
			<td style="width:432px;">used at 1 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">pS935-LRRK2</td>
			<td style="width:132px;">MRC PPU Reagents and Services</td>
			<td style="width:95px;">UDD2</td>
			<td style="width:432px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation

Leucine rik gjenta kinase 2 (LRRK2) er det hyppigst muterte genet i arvelig Parkinsons sykdom (PD) og alle patogene LRRK2 mutasjoner resulterer i hyperaktivering av kinasefunksjonen. Her beskriver vi en enkel og robust analyse for å kvantifisere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blod nøytrofiler ved å måle LRRK2-kontrollert fosforylering av en av sine fysiologiske substrater, Rab10 ved threonine 73. Den immunoblotting analysen beskrevet krever et fullt selektivt og fosforspesifikt antistoff som gjenkjenner Rab10 Thr73 epitopfosforylert av LRRK2, slik som MJFF-pRab10 kanin monoklonalt antistoff. Den bruker humane perifere blod nøytrofiler, fordi perifert blod er lett tilgjengelig og nøytrofiler er en rikelig og homogen bestanddel. Viktigere, nøytrofiler uttrykker relativt høye nivåer av både LRRK2 og Rab10. En potensiell ulempe for nøytrofiler er deres høye egenserinproteaseaktivitet, som nødvendiggjør bruk av svært potente proteasehemmere som organofosfornevrotoksindiisopropylfluorfofat (DIFP) som en del av lysisbufferen. Likevel er nøytrofiler en verdifull ressurs for forskning på LRRK2 kinase pathway aktivitet in vivo og bør vurderes for inkludering i PD biorepositorisamlinger.

Vår analyse gjør det mulig å forhøre aktiveringen av PD-assosierte LRRK2 kinase i humane perifere blod nøytrofiler med LRRK2-avhengige Rab10 fosforylering som en avlesning. Nøytrofiler er en homogen og rikelig perifer hvitblodcellepopulasjon som uttrykker høye nivåer av både LRRK2- og Rab10-proteinene (Figur 1). Den eneste andre cellepopulasjonen blant de gjenværende perifere blodmonukleære cellene (PBMCer) med høyt kopiantall av begge proteiner er monocytter, men disse utgjør b...

Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Mutasjoner i leucine rike gjenta kinase 2 genet (LRRK2) forårsake arvelig Parkinsons sykdom. Vi har utviklet en enkel og robust metode for å vurdere LRRK2-kontrollert fosforylering av Rab10 i humane perifere blodnøytrofiler. Dette kan bidra til å identifisere personer med økt LRRK2 kinase pathway aktivitet.

Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å gi en metode for å vurdere endogene LRRK2 kinase aktivitet i humant perifert blod. Dette oppnås ved å overvåke LRRK2-mediert fosforylering av Rab-proteiner, med Michael J.Fox Foundation fosfossifikke Rab monoklonale antistoffer. Her fokuserer vi på humant perifert blod nøytrofiler som utgjør en utgjør homogen områdepopulasjon med høye uttrykksnivåer av både Rab2 og Rab10.Den nøytrofile isolasjonen er basert på et negativt utvalg som innen 40 minutter etter ferdig virkning tillater isolering av 99% rene og levedyktige nøytrofiler samtidig som den gir høy mengde proteinnivåer. Samle 10 milliliter blod i et blodsamlingsrør. Bland forsiktig ved å invertere rør syv til åtte ganger.Overfør 10 milliliter blod til et 50 milliliter konisk rør. Legg til blod 100 mikroliter EDTA lageroppløsning 1, 0,1 molar EDTA PBS Løsning, bland forsiktig. Tilsett 500 mikroliter isolasjonscocktail, 50 mikroliter per milliliter fra nøytrofilisolasjonssettet til hele blodprøven.Vortex de magnetiske perlene fra nøytrofilisolasjonssettet i 30 sekunder før bruk for å gjenopplive svært fine magnetiske perler. Tilsett 500 mikroliter magnetiske perler til blodprøven og bland forsiktig ved å invertere røret flere ganger. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter.På topp opp tube til 50 milliliter med EDTA lagerløsning 2. Dette er en millimolar EDTA PBS-løsning. Bland ved å forsiktig pipettering opp og ned to til tre ganger.Plasser røret i magneten og fjern lokket for å unngå etterfølgende omrøring av røret. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Rørtteberiket cellefjæring som inneholder nøytrofiler i et nytt konisk rør på 50 milliliter.Ikke berør siden av røret som er i kontakt med magneten og unngå innsamling og perturbasjon av de røde blodcellene nederst på røret. La ca 10 milliliter av røde blodlegemer suspensjon bak på bunnen av røret. Vortex magnetiske perler i 30 sekunder før bruk og tilsett 0,5 milliliter magnetiske perler til røret som inneholder de berikede nøytrofile.Bland forsiktig ved å snu røret. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Plasser røret i magneten og fjern lokket for å unngå etterfølgende omrøring.Inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Pipette forsiktig den berikede cellefjæringen som inneholder nøytrofiler i et nytt konisk rør på 50 milliliter. Ikke berør siden av røret som er i kontakt med magneten.La ca fem milliliter av suspensjonen nederst på røret. For å sikre fullstendig fjerning av magnetiske perler fra celleblanding, plasser røret som inneholder berikede celler i magneten. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.Pipette forsiktig den berikede cellefjæringen som nå inneholder rene nøytrofiler i et nytt konisk rør på 50 milliliter. Ikke berør siden av røret som er i kontakt med magneten. La ca fem milliliter suspensjon nederst på røret.På topp opp isolerte celler med en millimolar EDTA lagerløsning 2 til et endelig volum på ca 41 milliliter. Pipetten opp og ned for å blande. Del oppløsningen likt i to rør med ca. 20 milliliter i hvert rør.Sentrifuge begge rørene på 335G i fem minutter. Under sentrifugeringstrinnet tar du MLi-2-hemmerlager, 200 mikromoslash 1000X konsentrasjon ut av minus 80 graders fryser og la ved romtemperatur for etterfølgende bruk. Umiddelbart etter sentrifugeringstrinnet og uten agitasjon av rørene, hell av supernatanten uten å forstyrre nøytrofilpellets.gjenbruk hver cellepellet i 10 milliliter cellekulturmedium ved romtemperatur ved å forsiktig pipettering celler opp og ned fire ganger. Merk ett rør DMSO og det andre røret MLi-2. Til DMSO merket rør tilsett 10 mikroliter DMSO og tilsett 10 mikroliter av 200 mikromos MLi-2 lagerløsning ved å forsiktig pipettering opp og ned for å blande.Inkuber prøver i 30 minutter ved romtemperatur. Bland forsiktig ved inversjon hvert 10. I løpet av 30 minutters LRRK2 kinasehemmer behandling fjerne 0,5 molar DIFP lager løsning fra minus 80 graders fryser og plasseres i røyk hette på is.Deretter flytter du ett mg per milliliter Microcystin-LR lagerløsning fra minus 80 graders fryser og plasser ved romtemperatur for å tine. Tin en aliquot, 0,25 milliliter lysisbufferen ved å ta den ut av fryseren, la den tine ved romtemperatur og deretter plassere den på is til etterfølgende bruk. Forbered en milliliter RPMI medium som inneholder en mikroliter DMSO kaller dette DMSO Resuspension Buffer.Forbered en milliliter RPMI-medium som inneholder en mikroliter på 200 mikromos MLi-2 eller alternativ LRRK2 kinasehemmer og kall denne MLi-2 Resuspension Buffer. Etter 30 minutters inkubasjonsperiode sentrifuger begge rørene på 335G i fem minutter, som før. Kast forsiktig overnatanten i hvert rør uten å forstyrre nøytrofilpellet.For DMSO merket rør, forsiktig resuspend pellet i en milliliter DMSO resuspensjon Buffer. Og for MLi-2 merket rør, gjenbruk pellet i en milliliter MLi-2 Resuspension Buffer. Overfør gjenbrukte cellepellets til tilsvarende sentrifugeringsrør merket DMSO og MLi-2 og sentrifuger begge rørene ved 335G i tre minutter.Under sentrifugeringstrinnet klargjør du lysisbufferen. I røykhetten legger du forsiktig til 0,25 mikroliter med 0,5 molar DIFP-oppløsning, samt 0,25 mikroliter på ett milligram per milliliter mikrocystin-LR til 0,25 milliliter lysisbufferen. Bland og la det stå på is til bruk.Umiddelbart etter sentrifugeringen, fjern forsiktig og fullstendig alt supernatant med en pipette uten å forstyrre nøytrofilpellet og legg rørene på is. Tilsett umiddelbart 100 mikroliter lysisbuffer som inneholder DIFP og microcystin-LR til hvert rør. Bruk en 100 til 200 mikroliter pipette, resuspend cellepellets ved å pipetter opp og ned omtrent fem til 10 ganger.Ligg celler på is i 10 minutter. Deretter sentrifuge rør på 20,000 ganger G i 15 minutter ved fire grader celsius å fjerne celle rusk. Overfør DMSO og MLi-2 supernatant som inneholder nøytrofile lysater til nye sentrifugeringsrør.Kast ruskpellets. Nøytrofile lysater er nå klare til bruk eller kan knekkes i flytende nitrogen og lagres i minus 80 grader for fremtidig analyse. Ved hjelp av data fra den offentlig tilgjengelige importdatabasen viser denne grafen at en overflod av LRRK2- og Rab10-proteinene er spesielt høy i humant perifert blod nøytrofiler og monocytter.Isolerende humant perifert blod nøytrofiler med denne prosedyren resulterer i en høy uren utbytte av celler. Tabellen øverst viser totalt antall celler isolert fra 10 milliliter perifert blod fra tre friske donorer. Også vist er renhet og levedyktighet av de isolerte cellene, samt totalt proteinlylatutbytte.Etter behandling med og uten LRRK2 kinasehemmer, MLi-2, nøytrofiler er lysed i nærvær av den potente proteasehemmeren, DIFP. For figur B på venstre side ble 10 mikrogram hele celleekstrakter per kjørefelt utsatt for multipleks kvantitativ immunoblotanalyse med de angitte antistoffene. Figuren til høyre, C, demonstrerer viktigheten av DIFP for forebygging av proteolytisk nedbrytning, spesielt av det store LRRK2-proteinet.Til sammenligning er høye konsentrasjoner av PMSF alene mindre effektive. Her er vist at LRRK2-kontrollert Rab10 fosforylering er betydelig økt med omtrent tredoblet i perifert blod nøytrofiler avledet fra pasienter med arvelig Parkinsons sykdom som skjuler en heterozygous VPS35 D620N mutasjon sammenlignet med kontroller. Den øverste grafen viser multipleks immunoblot analyse og bunnen, kvantifiseringen av disse.Dette tyder på at VPS35 D620N mutasjon aktiverer LRRK2 kinase aktivitetsbane ved en ennå ukjent mekanisme. Oppsummert presenterer vi en facile og robust analyse for å måle LRRK2 kinase pathway aktivitet ved å overvåke Rab protein fosforylering, som Rab10, i menneskelig perifer-avledet nøytrofiler, denne metoden tillater oss å vurdere LRRK2 pathway aktivitet og bestemme hvordan mutasjoner, sykdom tilstander eller hemmere modulere LRRK2 pathway aktivitet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analysering av proteinkinaseaktivitet med radiomerket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Styrking av engraftment av humant indusert pluripotent Stem Cell-avledet Cardiomyocytes via en forbigående hemming av Rho kinase aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...