Name: human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Agradecemos a los voluntarios sanos que amablemente donaron sangre para el presente estudio. Agradecemos a The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) y al liderazgo del estudio Fox BioNet (FBN) por su apoyo y aportación hacia el protocolo escrito y el video. Agradecemos al profesor Alexander Zimprich, de la Universidad de Viena en Austria, por probar nuestro protocolo y colaboración. Valoramos las contribuciones de Paul Davies al proyecto (director general de la PPU de MRC). También reconocemos el excelente apoyo técnico de la Unidad de Fosforilación y Ubiquitilación de Proteínas MRC (PPU) a saber, Síntesis Química (Natalia Shpiro para la síntesis de MLi-2), Reactivos MRC PPU y equipos de purificación de anticuerpos (coordinados por Hilary McLauchlan y James Hastie). Agradecemos a Mhairi Towler y Fraser Murdoch de Vivomotion por su ayuda para hacer los videos y animaciones. Agradecemos a Steve Soave de 81 películas por su ayuda con las ediciones finales. Esther Sammler cuenta con el apoyo de una beca académica clínica sécoceses escocesa y ha recibido financiación de Parkinson's UK (K-1706).

Según la normativa local del Reino Unido, todas las manipulaciones y pipeteos de sangre humana se llevan a cabo en un gabinete de seguridad biológica de categoría 2. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la junta local de revisión ética y todos los participantes han dado su consentimiento informado.
1. Preparación
<ol><li>Preparar 0,1 ml de EDTA Stock Solution 1 que contiene 100 mM edtA en solución salina con búfer de fosfato (PBS).</li>
	<li>Preparar 60 mL d...

<ol>
	<li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLi-2,+a+Potent,+Selective,+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition.">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Therapies+for+Parkinson's+Disease:+From+Genetics+to+the+Clinic.">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li><li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases.">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2:+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors.">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li><li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+kinase+in+Parkinson's+disease.">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li><li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice.">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li><li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+3-(4-Pyrimidinyl)+Indazole+(MLi-2),+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity.">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li><li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson's+disease+kinase.">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li><li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+VPS35[D620N]+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human.">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li><li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics.">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III.">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical &amp; Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li><li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils.">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32 (2009).</li></ol>

La evidencia clínica, genética y bioquímica convincente apunta hacia un papel importante para LRRK2 y, en particular, su función quinasa en la enfermedad de Parkinson7. Se han desarrollado inhibidores de la quinasa LRRK2 que están entrando en ensayos clínicos2,4,12. Como tal, es necesario explotar LRRK2 como biomarcador para la participación objetivo, así como la estratificación del paciente. Nue...

Los intentos de reducir o detener la enfermedad de Parkinson (PD) han fracasado hasta ahora. El descubrimiento de mutaciones hiperactivadoras en la quinasa repetitiva rica en leucina 2 (LRRK2) que causan y/o aumentan el riesgo de DP ha llevado al desarrollo de inhibidores de la quinasa LRRK21,,2,,3. Estos han entrado ahora en ensayos clínicos4. La función exacta de LRRK2 no está clara, pero un avance importante ha sido la identificación de un subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluyendo Rab10, como los primeros sustratos fisiológicos de buena fe de la quinasa LRRK25,,6,7. Los principales desafíos en la era de las terapias modificadoras de la enfermedad son los marcadores bioquímicos del estado de activación de la quinasa LRRK2 y la participación objetivo de los inhibidores de la quinasa LRRK2.
Hasta ahora, el principal marcador farmacocinético de los inhibidores de LRRK2 in vivo ha sido un grupo de residuos de serina fosforilada constitutivamente de LRRK2, en particular la serina 935, que se desfosforilan en respuesta a diversos inhibidores de LRRK28,9. Sin embargo, la fosforilación de la serina 935 no se correlaciona con la actividad celular intrínseca de la quinasa LRRK2 porque no está fosforilada directamente por LRRK2 y sigue fosforiladaendo en LRRK210inactivo para la quinasa. La actividad de la quinasa LRRK2 se correlaciona bien con la autofosforilación de la serina 1292, pero en términos prácticos no es una lectura adecuada para la actividad endógena de la quinasa LRRK2 mediante el análisis de inmunoblot de extractos de células enteras debido a la falta actual de anticuerpos fiables y fosfoespecíficos para este sitio10,11.
Hemos desarrollado un ensayo robusto y fácil para cuantificar la actividad de la vía de la quinasa LRRK2 en células sanguíneas periféricas humanas que mide la fosforilación controlada por LRRK2 de su diana fisiológica Rab10 en la threonina 7311. La sangre periférica es fácilmente accesible por venesection, que es un procedimiento rápido y de bajo riesgo que causa un mínimo malestar. Nos centramos en los neutrófilos de sangre periférica humana porque constituyen una población abundante (37-80% de todos los glóbulos blancos) y células homogéneas que expresa niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab1011. Además, los neutrófilos de sangre periférica pueden aislarse de forma rápida y eficiente mediante el empleo de un enfoque negativo inmunomagnético. Para garantizar que la posterior fosforilación Rab10 observada sea mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos se incuba con o sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK2 (utilizamos y recomendamos MLi-2)2,12. Esto es seguido por la lisis celular en un tampón que contiene el inhibidor de la proteasa diisopropilo fluorofosfato (DIFP), que es necesario para suprimir la actividad intrínseca de la proteasa de serina que se sabe que es alta en neutrófilos13. Para el análisis final mediante inmunoblotting cuantitativo, recomendamos utilizar el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10 que detecta específicamente el Rab10 Thr73-fosfoepitope y no reacciona cruzadamente con otras proteínas Rab fosforiladas14. La selectividad y especificidad de este anticuerpo ha sido validada en modelos de sobreexpresión de diferentes proteínas Rab y una línea celular de nocaut A549 Rab1014. Por lo tanto, medimos la diferencia en la fosforilación de Rab10 en los lisatos de neutrófilos que han sido tratados con y sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK22. Alternativamente, las muestras también podrían ser analizadas por otros métodos, como la espectrometría cuantitativa de masas.
En conclusión, la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 es un marcador superior de la actividad de quinasa LRRK2 a la fosforilación LRRK2 en la serina 935 y los neutrófilos de sangre periférica humana son un recurso valioso para la investigación de DP en LRRK2. Nuestro protocolo proporciona un ensayo robusto y fácil para interrogar la actividad de la vía LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica y permite la estratificación bioquímica de individuos con mayor actividad quinasa LRRK215. Es importante destacar que estos individuos pueden beneficiarse del futuro tratamiento con inhibidores de la quinasa LRRK2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1 mL Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.762</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1.5 mL Micro tubes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">72.690.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1254.025&#160;</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.113</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">15 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">188 271</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.760.002</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">25 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1685.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">50 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">227 261</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube</td>
			<td style="width:132px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:95px;">BD 367525</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Beckman</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Category 2 biological safety cabinet.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:132px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">11836170001</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DIFP (Diisopropylfluorophosphate)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">D0879</td>
			<td style="width:432px;">Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">6250</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dry ice or liquid nitrogene</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">14190094</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Easy 50 EasySep Magnet&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">18002</td>
			<td style="width:432px;">for holding 1 x 50ml conical tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">19666</td>
			<td style="width:432px;">This contains Solutions called &#8220;Isolation Cocktail&#8221; and &#8220;RapidSpheres magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E3889</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ethanol, in spray bottle</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ice</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Isopropanol (anhydrous grade)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">278475</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &#946;-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) &#946;-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 &#956;g/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td>
			<td style="width:132px;">Merck</td>
			<td style="width:95px;">438194-10MG</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Microcystin-LR</td>
			<td style="width:132px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:95px;">ALX-350-012-M001</td>
			<td style="width:432px;">1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:132px;">Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">450243</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">NaF</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S7920</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Odyssey CLx scan Western Blot imaging system</td>
			<td style="width:132px;">Odyssey</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Permanent marker pen</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Personal protection equipment</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">21875034</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sodium pyrophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S22</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S0389</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suggested antibodies for Western blotting</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]</td>
			<td style="width:132px;">abcam</td>
			<td style="width:95px;">ab230261</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:132px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:95px;">5174</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 680LT</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-68020</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32210</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-rabbit IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32211</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
			<td style="width:132px;">generated by nanoTools (nanotools.de)</td>
			<td style="width:95px;">not applicable*</td>
			<td style="width:432px;">used at 2 &#956;g/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody</td>
			<td style="width:132px;">Antibodies Incorporated</td>
			<td style="width:95px;">&#160;75-253</td>
			<td style="width:432px;">used at 1 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">pS935-LRRK2</td>
			<td style="width:132px;">MRC PPU Reagents and Services</td>
			<td style="width:95px;">UDD2</td>
			<td style="width:432px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation

La quinasa de repetición rica en leucina 2 (LRRK2) es el gen mutado con más frecuencia en la enfermedad hereditaria de Parkinson (PD) y todas las mutaciones patógenas de LRRK2 resultan en la hiperactivación de su función quinasa. Aquí, describimos un ensayo fácil y robusto para cuantificar la actividad de la vía quinasa LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica humana midiendo la fosforilación controlada por LRRK2 de uno de sus sustratos fisiológicos, Rab10 en la threonina 73. El análisis de inmunoblotting descrito requiere un anticuerpo totalmente selectivo y fosfoespecífico que reconozca el epítopeno Rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10. Utiliza neutrófilos de sangre periférica humana, porque la sangre periférica es fácilmente accesible y los neutrófilos son un componente abundante y homogéneo. Es importante destacar que los neutrófilos expresan niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab10. Un inconveniente potencial de los neutrófilos es su alta actividad intrínseca de proteasa de serina, que requiere el uso de inhibidores de la proteasa muy potentes como la neurotoxina organofosfora diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte del tampón de lisis. Sin embargo, los neutrófilos son un recurso valioso para la investigación de la actividad in vivo de la vía quinasa LRRK2 y deben considerarse para su inclusión en las colecciones de biorrepositorios de DP.

Nuestro ensayo permite interrogar la activación de la quinasa LRRK2 asociada a la PD en neutrófilos de sangre periférica humana con la fosforilación Rab10 dependiente de LRRK2 como una lectura. Los neutrófilos son una población homogénea y abundante de glóbulos blancos periféricos que expresa altos niveles de proteínas LRRK2 y Rab10(Figura 1). La única otra población celular entre las células mononucleares de sangre periférica restantes (PPBCD) con un alto número de copias de ...

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Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método para evaluar la actividad endógena de LRRK2 quinasa en la sangre periférica humana. Esto se logra mediante el monitoreo de la fosforilación mediada por LRRK2 de las proteínas Rab, empleando anticuerpos monoclonales Rab específicos de Fosfo de la Fundación Michael J.Fox. Aquí, nos centramos en los neutrófilos de sangre periférica humana como una consensuada de población de sitios homogéneos con altos niveles de expresión de Rab2 y Rab10.El aislamiento de neutrófilos se basa en una selección negativa que dentro de los 40 minutos de la acción terminada permite el aislamiento de 99%neutrófilos puros y viables, al mismo tiempo que produce una alta cantidad de niveles de proteínas. Recoger 10 mililitros de sangre en un tubo de recolección de sangre. Mezclar suavemente invirtiendo los tubos de siete a ocho veces.Transfiera 10 mililitros de sangre a un tubo cónico de 50 mililitros. Añadir a la sangre 100 microlitros de la solución de material EDTA 1, 0.1 molar EDTA PBS Solución, mezclar suavemente. Añadir 500 microlitros cóctel de aislamiento, 50 microlitros por mililitro del kit de aislamiento de neutrófilos a toda la muestra de sangre.Vórtice las perlas magnéticas del kit de aislamiento de neutrófilos durante 30 segundos antes de su uso con el fin de resuspender cuentas magnéticas muy finas. Agregue 500 microlitros de perlas magnéticas a la muestra de sangre y mezcle suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Rebaste el tubo a 50 mililitros con la solución de stock EDTA 2. Esta es una solución EDTA PBS milimétrica. Mezclar muy suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces.Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar la agitación posterior del tubo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Suspensión celular cuidadosamente enriquecida con pipeta que contiene neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán y evite la recolección y perturbación de los glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Deje aproximadamente 10 mililitros de la suspensión de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Cuentas magnéticas de vórtice durante 30 segundos antes de su uso y añadir perlas magnéticas de 0,5 mililitros al tubo que contiene los neutrófilos enriquecidos.Mezclar suavemente invirtiendo el tubo. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar la agitación posterior.Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que contiene neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán.Deje aproximadamente cinco mililitros de la suspensión en la parte inferior del tubo. Para asegurar la eliminación completa de las perlas magnéticas de la mezcla celular, coloque el tubo que contiene las células enriquecidas en el imán. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que ahora contiene neutrófilos puros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán. Deje aproximadamente cinco mililitros de suspensión en la parte inferior del tubo.Rebaja las células aisladas con una solución de stock de EDTA milimolar 2 a un volumen final de aproximadamente 41 mililitros. Pipetear arriba y abajo para mezclar. Divida la solución por igual en dos tubos con aproximadamente 20 mililitros en cada tubo.Centrifugar ambos tubos a 335G durante cinco minutos. Durante el paso de centrifugación, tome el caldo de inhibidores MLi-2, 200 micromolares de la concentración 1000X del congelador de menos 80 grados y déjelo a temperatura ambiente para su uso posterior. Inmediatamente después del paso de centrifugación y sin agitación de los tubos, verter el sobrenadante sin perturbar los pellets de neutrófilos.resuspender cada pellet celular en 10 mililitros de medio de cultivo celular a temperatura ambiente pipeteando suavemente las células hacia arriba y hacia abajo cuatro veces. Etiquetar un tubo DMSO y el otro tubo MLi-2. Para el tubo etiquetado DMSO añadir 10 microlitro de DMSO y añadir 10 microlitros de 200 micromolar MLi-2 solución de stock por pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.Incubar muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mezclar suavemente por inversión cada 10 minutos durante el período de incubación. Durante el tratamiento con inhibidores de la quinasa LRRK2 de 30 minutos, retire la solución de 0,5 molares DIFP del congelador de menos 80 grados y colóquela en una campana de humo sobre hielo.A continuación, mueva un miligramo por mililitro De la solución de stock microcystin-LR desde el congelador de menos 80 grados y colóquelo a temperatura ambiente para descongelar. Descongelar una alícuota, 0,25 mililitros del tampón de la lesis sacándolo del congelador, permitir descongelar a temperatura ambiente y luego colocarlo en hielo para su uso posterior. Prepare un mililitro de medio RPMI que contenga un microlitro de DMSO llame a este búfer de resuspensión DMSO.Preparar un mililitro de medio RPMI que contenga un microlitro de 200 micromolares MLi-2 o un inhibidor alternativo de la quinasa LRRK2 y llamar a este búfer de resuspensión MLi-2. Después del período de incubación de 30 minutos, centrifugar ambos tubos a 335G durante cinco minutos, como antes. Deseche cuidadosamente el sobrenadante en cada tubo sin alterar el pellet de neutrófilos.Para el tubo etiquetado DMSO, resuspend suavemente pellet en un mililitro de DMSO Resuspension Buffer. Y para el tubo etiquetado MLi-2, pellet resuspend en un mililitro de MLi-2 Resuspension Buffer. Transfiera los gránulos de células resuspendidas a los tubos de centrifugación correspondientes etiquetados con DMSO y MLi-2 y centrifugar ambos tubos a 335G durante tres minutos.Durante el paso de centrifugación, prepare el tampón de lelisis. En la campana de humo, agregue cuidadosamente 0,25 microlitros de solución DIFP 0,5 molares, así como 0,25 microlitros de un miligramo por mililitro de microcistina-LR al tampón de 0,25 mililitros de lílisquel. Mezclar y dejar sobre hielo hasta que lo use.Inmediatamente después de la centrifugación, retire cuidadosamente y completamente todo el sobrenadante con una pipeta sin molestar el pellet de neutrófilos y coloque los tubos sobre hielo. Añadir inmediatamente 100 microlitros de tampón de lelisis que contengan DIFP y microcystin-LR a cada tubo. Usando una pipeta de 100 a 200 microlitro, resuspender los pellets celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cinco a 10 veces.Acostar las células sobre hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugar tubos a 20.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los desechos celulares. Transfiera DMSO y MLi-2 sobrenadantes que contienen licatos de neutrófilos en nuevos tubos de centrifugación.Deseche los pellets de escombros. Los analitos de neutrófilos ya están listos para su uso o pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a menos 80 grados para su análisis futuro. Utilizando datos de la base de datos de importación disponible públicamente, este gráfico muestra que la abundancia de las proteínas LRRK2 y Rab10 es particularmente alta en neutrófilos y monocitos de sangre periférica humana.Aislar a los neutrófilos de sangre periférica humana con este procedimiento da como resultado un alto rendimiento impuro de las células. La tabla en la parte superior muestra el número total de células aisladas de 10 mililitros de sangre periférica de tres donantes sanos. También se muestran la pureza y viabilidad de las células aisladas, así como el rendimiento total del lisado proteico.Después del tratamiento con y sin el inhibidor de la quinasa LRRK2, MLi-2, los neutrófilos se lecien en presencia del potente inhibidor de la proteasa, DIFP. Para la figura B en el lado izquierdo, 10 microgramos de extractos de células enteras por carril fueron sometidos a análisis de inmunoblot cuantitativo multiplex con los anticuerpos indicados. La figura de la derecha, C, demuestra la importancia de DIFP para la prevención de la degradación proteolítica, en particular de la gran proteína LRRK2.En comparación, las altas concentraciones de PMSF por sí solas son menos eficaces. Aquí se muestra que la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 se incrementa significativamente en aproximadamente tres veces en los neutrófilos de sangre periférica derivados de pacientes con enfermedad de Parkinson hereditaria que alberga una mutación heterocigota VPS35 D620N en comparación con los controles. El gráfico superior muestra el análisis de inmunoblot multiplex y la parte inferior, la cuantificación de los mismos.Esto sugiere que la mutación VPS35 D620N activa la ruta de actividad de la quinasa LRRK2 por un mecanismo aún desconocido. En resumen, presentamos un ensayo fácil y robusto para medir la actividad de la vía quinasa LRRK2 mediante el seguimiento de la fosforilación de la proteína Rab, como Rab10, en neutrófilos humanos de origen periférico, este método nos permite evaluar la actividad de la vía LRRK2 y determinar cómo las mutaciones, los estados de la enfermedad o los inhibidores modulan la actividad de la vía LRRK2.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Investigación

Bioquímica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...