Name: human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Bu çalışma için kan bağışında bulunan sağlıklı gönüllülere teşekkür ederiz. Biz Michael J. Fox Vakfı Parkinson Araştırma için teşekkür (MJFF) ve Fox BioNet çalışma liderlik (FBN) destek ve yazılı protokol ve video doğru giriş için. Avusturya'daki Viyana Üniversitesi'nden Profesör Alexander Zimprich'e protokolümüzü ve işbirliğimizi test ettiği için teşekkür ederiz. Paul Davies'in projeye katkılarına değer vermekteyiz (MRC PPU genel müdürü). Ayrıca MRC Protein Fosforilasyon ve Ubiquitition Unit (PPU) yani Kimyasal Sentez (Natalia Shpiro MLi-2 sentezi için), MRC PPU Reaktifler ve Hizmetler antikor arıtma ekipleri (tarafından koordine mükemmel teknik destek tanımak Hilary McLauchlan ve James Hastie). Biz Video ve animasyonlar yapımında yardım için Vivomotion Gelen Mhairi Towler ve Fraser Murdoch teşekkür ederiz. Biz steve Soave 81 film den son edinimleri ile yardım için teşekkür ederiz. Esther Sammler Bir İskoç Kıdemli Klinik Akademik Bursu tarafından desteklenir ve Parkinson İngiltere (K-1706) fon aldı.

Yerel İngiltere mevzuatına göre insan kanının tüm manipülasyonları ve borulama bir kategori 2 biyolojik güvenlik kabinesinde üstlenilir. Tüm prosedürler yerel etik inceleme kuruluna uygun olarak gerçekleştirildi ve tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay verdi.
1. Hazırlık
<ol><li>Fosfat tamponlu salinde (PBS) 100 mM EDTA içeren 0,1 mL EDTA Stok Çözeltisi 1 hazırlayın.</li>
	<li>PBS'de 1 mM EDTA içeren 60 mL EDTA Stok Çözeltisi 2 hazırlayın.</li>
	<li>50 mM Tris...

<ol>
	<li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li><li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLi-2,+a+Potent,+Selective,+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition.">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li><li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li><li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Therapies+for+Parkinson's+Disease:+From+Genetics+to+the+Clinic.">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li><li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases.">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2:+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors.">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li><li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+kinase+in+Parkinson's+disease.">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li><li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice.">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li><li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson's+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition.">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li><li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Parkinson's+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils.">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li><li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+3-(4-Pyrimidinyl)+Indazole+(MLi-2),+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity.">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li><li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+serine+proteases:+specific+regulators+of+inflammation.">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li><li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson's+disease+kinase.">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li><li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease+VPS35[D620N]+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human.">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li><li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics.">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li><li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III.">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical &amp; Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li><li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils.">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32 (2009).</li></ol>

Zorlayıcı klinik, genetik ve biyokimyasal kanıtlar LRRK2 için önemli bir rol doğru işaret ve özellikle Parkinson hastalığında kizaz fonksiyonu7. LRRK2 kiyaz inhibitörleri geliştirilmiştir ve klinik çalışmalara giriyorsunuz2,4,12. Bu nedenle, lrrk2'nin hedef katılımı ve hasta tabakalaşması için bir biyomarker olarak sömürülmesine ihtiyaç vardır. Protokolümüz, insan periferik k...

Parkinson hastalığını (PH) yavaşlatmaya veya durdurma girişimleri şimdiye kadar başarısız oldu. Lösin zengin tekrar kilaz 2 hiperaktivasyon mutasyonlarının keşfi (LRRK2) neden ve / veya PH riskini artırmak LRRK2 kiyaz inhibitörlerigelişimineyol açmıştır1 ,2,3. Bunlar artık klinikçalışmalaragirdik 4 . LRRK2 tam işlevi belirsizdir, ama büyük bir ilerleme Rab GTPase proteinlerin bir alt kümesinin belirlenmesi olmuştur, Rab10 dahil, LRRK2 kisenin ilk iyi niyetli fizyolojik substratları olarak5,6,7. Hastalık değiştirici terapötikler çağında kisa ların temel zorlukları LRRK2 kizaz aktivasyon durumunun biyokimyasal belirteçleri ve LRRK2 kiyaz inhibitörlerinin hedef katılımıdır.
Şimdiye kadar, vivo LRRK2 inhibitörleri için temel farmakokinetik belirteç lrrk2 kurucu fosforile serin kalıntıları bir küme olmuştur, özellikle serine 935, çeşitli LRRK2 inhibitörleri yanıt olarak fosforilted hale8,9. Ancak, serine 935 fosforilasyon doğrudan LRRK2 tarafından fosforile değildir ve hala kilaz-inaktif LRRK210fosforile çünkü içsel hücresel LRRK2 kiziz aktivitesi ile ilişkili değildir. LRRK2 kinasaktivitesi serin1292 otofosforilasyon ile iyi ilişkilidir, ama pratik açısından bu site için güvenilir ve fosfospesifik antikorların mevcut eksikliği nedeniyle tüm hücre özleri immünoblot analizi ile endojen LRRK2 kinaz aktivitesi için uygun bir okuma değil10,11.
Biz threonine 7311de fizyolojik hedef protein Rab10 LRRK2 kontrollü fosforilasyon ölçer insan periferik kan hücrelerinde LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için sağlam ve kolay bir taht geliştirdik. Periferik kana, düşük riskli ve en az rahatsızlığa neden olan hızlı bir işlem olan venekesit ile kolayca ulaşılabilir. Onlar bol (tüm beyaz kan hücrelerinin% 37-80) ve hem LRRK2 ve Rab1011nispeten yüksek düzeyde ifade homojen hücre popülasyonu oluşturmak çünkü biz insan periferik kan nötrofiller odaklanmak. Ayrıca, periferik kan nötrofilleri immünomanyetik negatif yaklaşım la hızlı ve verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonraki gözlenen Rab10 fosforilasyon LRRK2 aracılık olduğundan emin olmak için, nötrofil her toplu veya güçlü ve seçici LRRK2 kiyaz inhibitörü olmadan kuluçka (biz kullanmak ve MLi-2 tavsiye)2,12. Bu daha sonra proteaz inhibitörü diisopropil florofosfat içeren bir tampon hücre lisis i takip (DIFP), nötrofiller yüksek olduğu bilinen içsel serin prote proteaz aktivitesini bastırmak için gerekli olan13. Kantitatif immünoblotting tarafından son analiz için, özellikle Rab10 Thr73-fosfoepitop algılar ve diğer fosforile Rab proteinleri ile çapraz tepki vermez MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor kullanmanızı öneririz14. Bu antikor seçiciliği ve özgüllüğü farklı Rab proteinleri ve A549 Rab10 knock-out hücre hattı14aşırı ekspresyon modellerinde doğrulanmıştır. Böylece, güçlü ve seçici LRRK2 kinaz inhibitörü2ile tedavi edilmiş nötrofil lysates Rab10 fosforilasyon farkı ölçmek . Alternatif olarak, örnekler nicel kütle spektrometresi gibi diğer yöntemlerle de analiz edilebilir.
Sonuç olarak, LRRK2 kontrollü Rab10 fosforilasyon serin 935 de LRRK2 fosforilasyon LRRK2 kiziaz aktivitesinin üstün bir belirteç ve insan periferik kan nötrofiller LRRK2 içine PD araştırma için değerli bir kaynaktır. Protokolümüz periferik kan nötrofillerinde LRRK2 yol aktivitesini sorgulamak için sağlam ve kolay bir tahkikat sağlar ve artmış LRRK2 kinaz aktivitesi15olan bireylerin biyokimyasal tabakalaşmasını sağlar. Daha da önemlisi, bu tür bireyler gelecekteki LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilirler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="978">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1 mL Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.762</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">1.5 mL Micro tubes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">72.690.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1254.025&#160;</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.113</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">15 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">188 271</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">70.760.002</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">25 mL Pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:95px;">86.1685.001</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">50 mL falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Cellstar</td>
			<td style="width:95px;">227 261</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube</td>
			<td style="width:132px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:95px;">BD 367525</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Beckman</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Category 2 biological safety cabinet.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:132px;">Roche</td>
			<td style="width:95px;">11836170001</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">DIFP (Diisopropylfluorophosphate)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">D0879</td>
			<td style="width:432px;">Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">6250</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dry ice or liquid nitrogene</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">14190094</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Easy 50 EasySep Magnet&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">18002</td>
			<td style="width:432px;">for holding 1 x 50ml conical tube</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Stemcell</td>
			<td style="width:95px;">19666</td>
			<td style="width:432px;">This contains Solutions called &#8220;Isolation Cocktail&#8221; and &#8220;RapidSpheres magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E3889</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ethanol, in spray bottle</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">E6758</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ice</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Isopropanol (anhydrous grade)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">278475</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &#946;-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) &#946;-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 &#956;g/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;">alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td>
			<td style="width:132px;">Merck</td>
			<td style="width:95px;">438194-10MG</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Microcystin-LR</td>
			<td style="width:132px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:95px;">ALX-350-012-M001</td>
			<td style="width:432px;">1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Na3VO4</td>
			<td style="width:132px;">Aldrich</td>
			<td style="width:95px;">450243</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">NaF</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S7920</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Odyssey CLx scan Western Blot imaging system</td>
			<td style="width:132px;">Odyssey</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Permanent marker pen</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Personal protection equipment</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td style="width:132px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:95px;">21875034</td>
			<td style="width:432px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sodium pyrophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S22</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">S0389</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">50020</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:95px;">M3148</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suggested antibodies for Western blotting</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]</td>
			<td style="width:132px;">abcam</td>
			<td style="width:95px;">ab230261</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Anti-&#945;-tubulin</td>
			<td style="width:132px;">Cell Signaling Technologies</td>
			<td style="width:95px;">5174</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 680LT</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-68020</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32210</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Goat anti-rabbit IRDye 800CW</td>
			<td style="width:132px;">LI-COR</td>
			<td style="width:95px;">926-32211</td>
			<td style="width:432px;">used at 1:10,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
			<td style="width:132px;">generated by nanoTools (nanotools.de)</td>
			<td style="width:95px;">not applicable*</td>
			<td style="width:432px;">used at 2 &#956;g/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody</td>
			<td style="width:132px;">Antibodies Incorporated</td>
			<td style="width:95px;">&#160;75-253</td>
			<td style="width:432px;">used at 1 &#956;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">pS935-LRRK2</td>
			<td style="width:132px;">MRC PPU Reagents and Services</td>
			<td style="width:95px;">UDD2</td>
			<td style="width:432px;">MJFF-total Rab10 mouse antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human peripheral blood neutrophil isolation for interrogating the parkinson's associated lrrk2 kinase pathway by assessing rab10 phosphorylation

Lösin zengini tekrarlayan kiziaz 2 (LRRK2) kalıtsal Parkinson hastalığında (PH) en sık mutasyona uğrayan gendir ve tüm patojenik LRRK2 mutasyonları kizaz fonksiyonunun hiperaktivasyonuile sonuçlanır. Burada, fizyolojik substratlarından biri olan Rab10'un threonine 73'teki LRRK2 kontrollü fosforilasyonunu ölçerek insan periferik kan nötrofillerindeki LRRK2 kiyazı yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir tahkikat tanımlıyoruz. Açıklanan immünolot analizi, MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor gibi LRRK2 tarafından fosforile rab10 Thr73 epitopunu tanıyan tam seçici ve fosfospesifik antikor gerektirir. Periferik kan kolayca erişilebilir ve nötrofiller bol ve homojen bir bileşen dir, çünkü insan periferik kan nötrofilkullanır. Daha da önemlisi, nötrofiller hem LRRK2 hem de Rab10'un nispeten yüksek düzeylerini ifade eder. Nötrofillerin potansiyel bir dezavantajı yüksek içsel serin proteaz aktivitesidir, bu da lisis tamponunun bir parçası olarak organofosfor nörotoksin diisopropilorofosfat (DIFP) gibi çok güçlü proteaz inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo LRRK2 kiyazı yolu aktivitesi araştırma için değerli bir kaynak ve PD biyorepozitory koleksiyonlarına dahil edilmesi için düşünülmelidir.

Bizim taht bir okuma olarak LRRK2 bağımlı Rab10 fosforilasyon ile insan periferik kan nötrofillerinde PD ilişkili LRRK2 kizaz aktivasyonu sorgulama sağlar. Nötrofiller, hem LRRK2 hem de Rab10 proteinlerinin yüksek düzeylerini ifade eden homojen ve bol periferik beyaz kan hücresi popülasyonudur(Şekil 1). Kalan periferik kan mononükleer hücreleri arasında kalan tek hücre popülasyonu (PBMCs) her iki proteinin yüksek kopya numaraları monositler, ancak bu beyaz kan hücrelerini...

Watch this Scientific Journal Video about Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation at JoVE.com

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Bu işlemin genel amacı insan periferik kan endojen LRRK2 kinaz aktivitesini değerlendirmek için bir yöntem sağlamaktır. Bu, Michael J.Fox Vakfı fosfospesifik Rab monoklonal antikorların kullanımı yla Rab proteinlerinin LRRK2 aracılı fosforilasyonunun izlenmesiyle elde edilir. Burada, hem Rab2 hem de Rab10 yüksek ekspresyon düzeyleri ile homojen site popülasyonunun bir parçası olarak insan periferik kan nötrofiller üzerinde duruluyor.Nötrofil izolasyonu, bitmiş eylem 40 dakika içinde% 99 saf ve canlı nötrofillerizolasyon sağlar aynı zamanda protein düzeyleri yüksek miktarda verim negatif bir seçim dayanmaktadır. Bir kan toplama tüpü içine 10 mililitre kan toplamak. Tüpleri 7-8 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.50 mililitrelik konik bir tüpe 10 mililitre kan aktarın. Kana 100 mikrolitre EDTA stok çözeltisi 1, 0.1 molar EDTA PBS Çözeltisi ekleyin, hafifçe karıştırın. Nötrofil izolasyon kitinden tüm kan örneğine 500 mikrolitre izolasyon kokteyli, mililitre başına 50 mikrolitre ekleyin.Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 saniye boyunca girdaplayın. Kan örneğine 500 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat.EDTA stok çözeltisi 2 ile 50 mililitreye kadar tüp toplayın. Bu bir milimolar EDTA PBS Çözümü. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetting tarafından karıştırın.Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat. Dikkatle pipet yeni bir 50 mililitre konik tüp içine nötrofiller içeren hücre süspansiyon zenginleştirilmiş.Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyon yaklaşık 10 mililitre bırakın. Kullanmadan önce 30 saniye boyunca vortex manyetik boncuklar ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp 0.5 mililitre manyetik boncuk ekleyin.Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.Oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yat. Dikkatle pipet yeni bir nötrofil içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon 50 mililitrekonik tüp. Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın.Tüpün altında süspansiyon yaklaşık beş mililitre bırakın. Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat.Dikkatle pipet şimdi yeni bir 50 mililitre konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon. Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Tüpün altında yaklaşık beş mililitre süspansiyon bırakın.Yaklaşık 41 mililitre lik son hacmine kadar bir milimolar EDTA stok çözeltisi 2 ile izole hücreleri toplayın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için. Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mililitre olan iki tüpe eşit olarak bölün.335G'de her iki tüpü de beş dakika santrifüj edin. Santrifüj adımı sırasında, MLi-2 inhibitör stok, eksi 80 derece dondurucu dışında 200 mikromolar eğik 1000X konsantrasyonu almak ve sonraki kullanım için oda sıcaklığında bırakın. Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün.hücre lerini dört kez hafifçe borulandırarak oda sıcaklığında 10 mililitre hücre kültürü ortamıiçinde her hücre peletini yeniden askıya alın. Etiket bir tüp DMSO ve diğer tüp MLi-2. DMSO etiketli tüp için 10 mikrolitre DMSO ekleyin ve karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından 200 mikromolar MLi-2 stok çözeltisi 10 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka örnekleri. Kuluçka döneminde her 10 dakikada bir ters çevrilerek hafifçe karıştırın. 30 dakika LRRK2 kinaz inhibitörü tedavisi sırasında eksi 80 derece dondurucu dan 0,5 molar DIFP stok çözeltisi kaldırmak ve buz üzerinde duman kaputyerleştirin.Daha sonra, eksi 80 derece dondurucu dan mililitre Microcystin-LR stok çözeltisi başına bir miligram hareket ve çözülmek için oda sıcaklığında yer. Bir aliquot, dondurucu dan çıkararak lysis tampon 0.25 mililitre defrost, oda sıcaklığında defrost izin ve daha sonra kullanmak için buz üzerine yerleştirin. DMSO bir mikrolitre içeren RPMI orta bir mililitre hazırlayın bu DMSO Resuspension Tampon diyoruz.200 mikromolar MLi-2 veya alternatif LRRK2 kiyazı inhibitörü bir mikrolitre içeren RPMI orta bir mililitre hazırlayın ve bu MLi-2 Resuspension Tampon diyoruz. 30 dakikalık kuluçka döneminden sonra, her iki tüpü de 335G'de her iki tüpü de daha önce olduğu gibi beş dakika santrifüj edin. Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.DMSO etiketli tüp için, bir mililitre DMSO Resuspension Tampon'da peleti hafifçe yeniden askıya alın. Ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 Resuspension Tampon bir mililitre pelet resuspend. Yeniden askıya alınan hücre peletlerini DMSO ve MLi-2 etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 335G'de üç dakika santrifüj edin.Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputunda, 0,25 molar DIFP çözeltisinin 0,25 mikrolitreyanı nın yanı sıra 0,25 mililitrelik lisis tamponuna mililitre başına bir miligram mikrolitre mikrolitre ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin. Hemen her tüp için DIFP ve mikrosistin-LR içeren lysis tampon 100 mikrolitre ekleyin. 100 ila 200 mikrolitrelik pipet kullanarak, hücre peletlerini yaklaşık 5-10 kez yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.Hücreleri 10 dakika boyunca buzun üzerinde yat. Sonra, 20,000 kez G'de santrifüj tüpleri hücre enkazLarını temizlemek için 15 dakika boyunca 4 derece santigrat derece. Transfer DMSO ve MLi-2 supernatant içeren nötrofil lysates yeni santrifüj tüpleri içine.Enkaz peletlerini atın. Nötrofil lysates şimdi kullanıma hazır veya sıvı azot dondurulmuş ve gelecekteki analiz için eksi 80 derece saklanabilir. Kamuya açık ithalat veritabanından elde edilen verileri kullanarak, bu grafik LRRK2 ve Rab10 proteinlerinin bir bolluk insan periferik kan nötrofiller ve monositler özellikle yüksek olduğunu göstermektedir.Bu işlem ile insan periferik kan nötrofilleri izole hücrelerin yüksek kirli verim sonuçları. Üstteki tablo, üç sağlıklı donörden 10 mililitre periferik kandan izole edilen toplam hücre sayısını gösteriyor. Ayrıca izole hücrelerin saflığı ve canlılığının yanı sıra toplam protein lisat verimi de gösterilmiştir.LRRK2 kinaz inhibitörü, MLi-2 ile ve olmadan tedaviden sonra nötrofiller güçlü proteaz inhibitörü, DIFP varlığında lysed edilir. Sol taraftaki Şekil B için, şerit başına 10 mikrogram tüm hücre ekstresi belirtilen antikorlarla çokkatlı kantitatif immünoblot analizine tabi tutuldu. Sağdaki figür, C, büyük LRRK2 proteini başta olmak üzere, proteolitik bozulmanın önlenmesi için DIFP önemini göstermektedir.Buna karşılık, pmsf yüksek konsantrasyonlarda tek başına daha az etkilidir. Burada lrrk2 kontrollü Rab10 fosforilasyon önemli ölçüde kontrollere göre heterozigot VPS35 D620N mutasyonu barındıran kalıtsal Parkinson hastalığı olan hastalardan elde edilen periferik kan nötrofillerinde yaklaşık üç kat arttığı gösterilmektedir. Üst grafik multipleks immünoblot analizini ve alt kısmını, bunların niceliğini gösterir.Bu, VPS35 D620N mutasyonunun henüz bilinmeyen bir mekanizma ile LRRK2 kinazisi aktive ettiğini göstermektedir. Özetle, rab10 gibi Rab protein fosforilasyonlarını insan periferik türevi nötrofillerde izleyerek LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir analiz salıyoruz, bu yöntem LRRK2 yol aktivitesini değerlendirmemize ve mutasyonların, hastalık durumlarının veya inhibitörlerinin LRRK2 yol aktivitesini nasıl modüle ettiğini belirlememize olanak sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...