Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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这项工作得到了NIH网络蜂窝签名共同基金图书馆(LINCS)赠款HG008100(J.W.G.、L.M.H.和J.E.K)的支持。

注:图 1所示的流程图概述了整个 MEMA 流程(包括估计时间) 。该协议详细介绍了 8 孔板中 MEMEA 的制造。该协议可适用于其他板或幻灯片。
1. 蛋白质、稀释剂和染色缓冲液的制备
<ol><li>将 EMS、配体和细胞因子小瓶与室温 (RT) 和短暂离心器进行平衡。如产品数据表所示,添加适当的 RT 缓冲区的适当体积。按照制造商关于库存集中的建议进行操作...

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	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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"维数"和语境的重要性一直是体外培养系统发展的动力,通过它们与微环境的相互作用,以及体外细胞的能力,作为癌细胞表征的工具。模仿体内环境的文化系统是寻求改善这些文化系统的动力。然而,体外系统仍然是癌症研究的重要工具,正是因为它们能够将复杂的体内情况提炼为简化的12型。
虽然 2D 系统可以包括 EVM 和配体,但它们传统上缺乏?...

在二维(2D)单层塑料上培养癌细胞系仍然是癌症研究人员的主要工作之一。然而,微环境因其影响细胞表型的能力而日益得到认可。在癌症中,肿瘤微环境已知影响多种细胞行为,包括生长、存活、入侵和对治疗1、2的反应。传统的单层细胞培养通常缺乏微环境影响,这导致开发更复杂的三维(3D)检测来生长细胞,包括市售的纯化基底膜提取物。然而,这些纯化的基质通常使用复杂,并遭受技术问题,如批次变异性3和复杂组合物3。因此,很难将功能分配给可能影响细胞表型3的特定蛋白质。
为了弥补这些限制,我们开发了微环境微阵列 (MEMA) 技术,该技术将微环境简化为细胞外基质 (ECM) 和可溶性生长因子蛋白4、5 的简单组合.MEMA 平台能够识别影响细胞行为的显性微环境因素。通过使用数组格式,可以在单个实验中测定数千个微环境因子的组合。此处描述的 MEMA 询问了 2,500 种不同的独特微环境条件。印在井板的ECM蛋白形成生长垫,细胞可以赖以培养。可溶性配体被添加到单个孔中,在细胞暴露的每个不同点上创建独特的组合微环境(ECM + 配体)。细胞被培养数天,然后固定,染色和图像,以评估细胞表型作为暴露于这些特定的微环境组合的结果。由于微环境是简单的组合,因此很容易识别驱动细胞中主要型型变化的蛋白质。MEMEA已经成功地用于识别影响多细胞表型的因素,包括那些驱动细胞命运决定和对治疗4、5、6、7的反应的因素。这些反应可以在简单的2D实验中验证,然后可以在更全面地概括肿瘤微环境复杂性的条件下进行评估。MEMA 平台高度适应各种细胞类型和端点,前提是提供良好的型型生物标志物。

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

由于可溶性生长因子和基质相关蛋白在体内微环境中的混合混合,理解微环境对细胞表型的影响是一个难题。此外,用于体外微环境建模的现成试剂通常利用未完全定义的蛋白质的复杂混合物,并遭受批次到批次的变异。微环境微阵列 (MEMA) 平台允许评估数千种微环境蛋白的简单组合,以在单个测定中评估其对细胞表型的影响。MEMEA在井板中制备,允许添加单独的配体来分离含有阵列细胞外基质(ECM)蛋白质的孔。可溶性配体与每个印刷的 ECM 的组合形成了独特的组合。典型的 MEMA 测定包含超过 2,500 个独特的组合微环境,细胞在单个检测中暴露。作为测试案例,乳腺癌细胞系MCF7被镀在MEMA平台上。分析这种测定确定了增强和抑制这些细胞的生长和增殖的因素。MEMA 平台非常灵活,可扩展用于癌症研究以外的其他生物学问题。

为了简化微环境对细胞生长和增殖的影响,并确定促进或抑制细胞生长和增殖的条件,乳腺癌细胞系MCF7被播种在协议中描述的一组8 8孔MEMA上。这种测定使细胞接触48种不同的EMS和57种不同的配体,共2736个组合微环境条件。在培养71小时后,用EdU脉冲细胞,固定,渗透,并沾染DAPI,EdU检测反应,抗纤维蛋白抗体,抗H3K9me3抗体。细胞在高含量显微镜上成像。图像被上传到一个Omero服务器10,分段使?...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

这里介绍的方法的目的是展示如何制造微环境微阵列 (MEMA) 并用于询问数千种简单组合微环境对培养细胞表型的影响。

利用微阵列研究微环境对癌症细胞表型的影响

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

由于肿瘤微环境的复杂性，研究肿瘤微环境是困难的。我们开发了由简单的组合微环境组成的微环境，允许识别肿瘤细胞表型的主要驱动因素。MEMA 平台的主要优点是，由于微环境条件都定义了，因此很容易识别驱动感兴趣表型的微环境因素。MEMA平台广泛适用于其他非癌症系统，包括原细胞株和干细胞。我们开发了许多工程技巧和步骤来加快湿式工作并简化协议。首先，使用触摸销打印机将基准点中的细胞外矩阵打印混合物打印到八孔板中。使用以四倍七打印头配置排列的直径为 350 微米的引脚打印微环境微阵列的细胞外矩阵。胶原蛋白块作为网格打印到 MEMAs 上。PBS 填充井提供额外的湿度，以防止从细胞外基质打印混合物源板中干燥。将八孔板中的阵列打印为 20 列，35 行，共 700 个点。打印后，在干燥器中存放印版至少三天，然后使用。首先，设计一个96孔板布局与间距，允许使用多通道移液器与四个间隔尖端，使许多 MEMA 板的治疗可以一次完成。然后从冰柜中取出配体，在层流罩中的冰中解冻。简要轻拂并旋转每个管。使用制造商推荐的缓冲液将配体稀释为 200 倍的工作库存。移液 10 微升每个 200 倍配体股票到相应的井内 96 井板。使用密封膜密封板，并将其存放在零下20摄氏度。成批制作配体处理板，并捕获所有元数据以进行下游分析。在培养细胞之前，用每井两毫升的非污污阻塞缓冲液阻断缓冲液阻断 MEMAs 20 分钟。使用带两个巴斯德移液器的 Y 分路器，在多个孔中同时吸气阻塞缓冲液，然后用 PBS 三重清洗孔。为防止干燥，请将 PBS 的最终体积留在井中，直到准备好进行细胞电镀。在进行完整的 MEMA 实验之前，通过执行细胞滴定实验优化 MCF7 细胞种子浓度。理想的点（如图所示）具有足够的单元格数来提取数据，但数量并不多，以致该点过于汇合。在 MEMA 中，将剩余的 PBS 和种子 MCF7 细胞吸进 30，000 至 35，000 个细胞，每井以两毫升种子介质进行吸气。将 MEMA 放在 37 摄氏度的孵化器中。在培养箱中隔夜粘附后，吸气培养的培养物，代之以两毫升的生长介质，以分离特定配体对刺激作用。然后在冰上解冻以前冻结的配体处理板。将离心板以200倍g下解冻一分钟。将 MEMA 培养板中每一井的 200 微升介质转移到配体处理板中合适的井中。上下移液，将配体与介质混合，将混合物移回 MEMA 培养板中的适当井。用手轻轻摇动，将 MEMA 板返回到孵化器，在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下培养配体-ECM 组合。71 小时后，在 MEMA 油井中加入 100 次 EdU，最终浓度为 10 微摩尔。在37摄氏度和5%的二氧化碳下再孵育一小时。最后孵育后，吸气井。在室温下，将 MEMAs 固定为每井 2%PFA 的两毫升，15 分钟。然后从井中吸入 PFA。每井用两毫升0.1%非日性表面活性剂进行渗透，15分钟。吸气表面活性剂，然后用两毫升的PBS和PBS-T，按顺序清洗水井。之后，向每一井加入1.5毫升EdU检测反应试剂。在室温下孵育一小时，摇动并保护免受光线影响。然后用每孔1.5毫升商用淬火缓冲液淬火反应。再次吸气，用PBS-T清洗，然后用优化浓度的污渍或抗体进行孵化。在染色缓冲液中用原抗体孵育 MEMA 井，在四摄氏度下一夜之间摇动。在初级抗体孵育后，用PBS洗井，然后用PBS-T洗井。每毫升DAPI加入0.5微克的二次抗体，在染色缓冲液中稀释。孵育，在黑暗中室温下摇摆一小时。每孔 PBS 用两毫升清洗井两次，并将它们留在 PBS 的最后两毫升中。要成像染色的 MEMA，请将它放在具有适当荧光检测通道的自动成像系统的显微镜舞台上。将生成的图像数据输出到图像管理系统。使用 CellProfiler 对单元格进行分段并计算强度水平。在此协议中，装箱 DAPI 强度值的细胞周期配置文件与来自一个八井板的细胞计数指示 G1 与 G2 细胞周期相中的细胞。这对应于细胞在早期生长阶段的两个nDNA含量，以及即将经历分切的细胞中的四个nDNA含量。显示了配体和 ECM 的微环境对单元号和 EdU 合并的影响。红色表示单元格数较高，蓝色表示较低的单元格数。许多影响是配体驱动的，因为 ECM 条件没有强烈影响细胞号或 EdU 的积极性。Natagen 1 是一个明显的例外，因为此 ECM 分子的存在会抑制 MCF7 的细胞结合和生长。配体，如FGF6和neuregulin-1α增强细胞数，具有高率的EdU合并率，而配体，如安菲鲁林和内鲁古林-1SMDF抑制细胞结合和细胞生长。用神经古林-1α治疗的 MEMA 点生长的 MCF7 细胞的例子显示，EdU 合并率很高，以粉红色核表示。在此图像中，绿色污渍是细胞掩码，蓝色是 DAPI。由于完整的 MEMA 实验成本高昂，因此在执行完整实验之前执行优化步骤（如细胞和血清滴定）非常重要。使用 MEMA 平台确定感兴趣的微环境条件后，可以使用传统的 2D 和 3D 细胞培养系统更深入地研究特定的配体和细胞外基质蛋白。

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使用阵列库的中等通量筛选和基于双 Luciferase 的分录报告器识别转录因子稳压器

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