Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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Ce travail a été appuyé par la subvention HG008100 (J.W.G., L.M.H.et J.E.K) de la Bibliothèque des signatures cellulaires de réseau (LINCS) du Fonds commun des NIH.

REMARQUE: Un aperçu de l'ensemble du processus MEMA, y compris le temps estimé, est décrit dans le diagramme de débit indiqué à la figure 1. Ce protocole détaille la fabrication des MEMA dans des plaques de 8 puits. Le protocole peut être adapté pour d'autres plaques ou diapositives.
1. Préparation de tampons de protéines, de diluants et de taches
<ol><li>Équilibrez les flacons d'ECM, de ligands et de cytokines à température ambian...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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L'importance de la « dimensionnalité » et du contexte a été un facteur motivant dans le développement de systèmes de culture in vitro comme outils dans la caractérisation des cellules cancéreuses par leur interaction avec le microenvironnement11, et la capacité de l'in vitro les systèmes de culture pour imiter l'environnement in vivo est une force motrice derrière la quête pour améliorer ces systèmes de culture. Les systèmes in vitro, cependant, restent des outils importants de la ...

La culture des lignées de cellules cancéreuses sur le plastique dans les monocouches bidimensionnelles (2D) demeure l'un des principaux chevaux de bataille pour les chercheurs sur le cancer. Cependant, le microenvironnement est de plus en plus reconnu pour sa capacité à avoir un impact sur les phénotypes cellulaires. Dans le cancer, le microenvironnement de tumeur est connu pour influencer les comportements cellulaires multiples, y compris la croissance, la survie, l'invasion, et la réponse à la thérapie1,2. Les cultures traditionnelles des cellules monocouches n'ont généralement pas d'influences microenvironnement, ce qui a conduit au développement d'essais tridimensionnels (3D) plus complexes pour faire pousser des cellules, y compris des extraits de membrane de sous-sol purifiés disponibles dans le commerce. Cependant, ces matrices purifiées sont généralement compliquées à utiliser et souffrent de problèmes techniques tels que la variabilité des lots3 et les compositions complexes3. En conséquence, il peut être difficile d'attribuer la fonction à des protéines spécifiques qui peuvent avoir un impact sur les phénotypes cellulaires3.
Pour remédier à ces limitations, nous avons développé la technologie microenvironnement micro-réseau (MEMA), qui réduit le microenvironnement à de simples combinaisons de matrice extracellulaire (ECM) et de protéines solubles de facteur de croissance4,5 . La plate-forme MEMA permet d'identifier les facteurs microenvironnementaux dominants qui ont un impact sur le comportement des cellules. En utilisant un format de tableau, des milliers de combinaisons de facteurs microenvironnement peuvent être astoyées en une seule expérience. Le MEMA décrit ici interroge 2 500 conditions microenvironnement uniques différentes. Les protéines ECM imprimées dans des plaques de puits forment des plaquettes de croissance sur lesquelles les cellules peuvent être cultivées. Des ligands solubles sont ajoutés à des puits individuels, créant des microenvironnements combinatoires uniques (ECM et ligand) à chaque endroit différent auquel les cellules sont exposées. Les cellules sont cultivées pendant plusieurs jours, puis fixes, tachées et représentées pour évaluer les phénotypes cellulaires à la suite de l'exposition à ces combinaisons microenvironnement spécifiques. Étant donné que les microenvironnements sont des combinaisons simples, il est facile d'identifier les protéines qui entraînent des changements phénotypiques majeurs dans les cellules. Les MEMA ont été utilisés avec succès pour identifier les facteurs qui influencent plusieurs phénotypes cellulaires, y compris ceux qui conduisent les décisions de destin cellulaire et la réponse à la thérapie4,5,6,7. Ces réponses peuvent être validées dans des expériences 2D simples et peuvent ensuite être évaluées dans des conditions qui récapitulent plus complètement la complexité du microenvironnement tumoral. La plate-forme MEMA est très adaptable à une variété de types de cellules et de points de terminaison, à condition que de bons biomarqueurs phénotypiques soient disponibles.

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

Comprendre l'impact du microenvironnement sur le phénotype des cellules est un problème difficile en raison du mélange complexe de facteurs de croissance solubles et de protéines associées à la matrice dans le microenvironnement in vivo. En outre, les réactifs facilement disponibles pour la modélisation des microenvironnements in vitro utilisent généralement des mélanges complexes de protéines qui sont incomplètement définis et souffrent de la variabilité de lot à lot. La plate-forme microenvironnement microréseau (MEMA) permet d'évaluer des milliers de combinaisons simples de protéines microenvironnement pour leur impact sur les phénotypes cellulaires en un seul test. Les MEMA sont préparés dans des plaques de puits, ce qui permet l'ajout de ligands individuels pour séparer les puits contenant des protéines de matrice extracellulaire (ECM). La combinaison du ligand soluble avec chaque ECM imprimé forme une combinaison unique. Un analyse meMA typique contient plus de 2 500 microenvironnements combinatoires uniques auxquels les cellules sont exposées en un seul analyse. Comme cas d'essai, la ligne de cellules de cancer du sein MCF7 a été plaquée sur la plate-forme de MEMA. L'analyse de cet analyse a identifié des facteurs qui améliorent et inhibent la croissance et la prolifération de ces cellules. La plate-forme MEMA est très flexible et peut être étendue pour une utilisation avec d'autres questions biologiques au-delà de la recherche sur le cancer.

Afin de simplifier les impacts microenvironnementaux sur la croissance et la prolifération des cellules et d'identifier les conditions qui ont favorisé ou inhibé la croissance et la prolifération cellulaires, la lignée cellulaire du cancer du sein MCF7 a été enseve sur un ensemble de huit MEMA de huit puits tels que décrits dans le protocole. Cet analyse a exposé les cellules à 48 ECM différents et 57 ligands différents, pour un total de 2736 conditions micro-environnementales combinatoires. Après 71 h dans ...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Le but de la méthode présentée ici est de montrer comment les microréseaux microenvironnements (MEMA) peuvent être fabriqués et utilisés pour interroger l'impact de milliers de microenvironnements combinatoires simples sur le phénotype des cellules cultivées.

Utilisation de microréseaux pour interroger l'impact microenvironnemental sur les phénotypes cellulaires dans le cancer

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

L’étude du microenvironnement tumoral est difficile en raison de sa complexité. Nous avons développé des microrésorés de microenvironnement composés de microenvironnements combinatoires simples qui permettent l’identification des principaux moteurs des phénotypes tumoraux. L’avantage majeur de la plate-forme MEMA est que parce que les conditions de microenvironnement sont toutes définies, il est simple d’identifier les facteurs de microenvironnement qui stimulent les phénotypes d’intérêt.La plate-forme MEMA est largement applicable dans d’autres systèmes non cancéraux, y compris les souches de cellules primaires et les cellules souches. Il y a un certain nombre de trucs et d’étapes d’ingénierie que nous avons développés pour accélérer le travail de banc humide et simplifier le protocole. Pour commencer, utilisez une imprimante à broches tactiles pour imprimer le mélange d’impression matricielle extracellulaire en taches fiduciales dans des plaques de huit puits.Utilisez des broches de diamètre de 350 micromètres disposées dans une configuration de tête d’impression quatre fois sept pour imprimer la matrice extracellulaire pour les microrésonnements. Le bloc de collagène est imprimé sur memas comme une grille. Les puits remplis de PBS fournissent une humidité supplémentaire pour éviter le dessèchement de la plaque source du mélange d’impression matricielle extracellulaire.Imprimez les tableaux dans les plaques de huit puits comme 20 colonnes par 35 lignes, pour un total de 700 taches. Après impression, conserver les assiettes dans un dessiccateur pendant au moins trois jours avant de les utiliser. Tout d’abord, concevoir une disposition de plaque de 96 puits avec espacement qui permet l’utilisation d’une pipette multicanal avec quatre pointes espacées, de sorte que le traitement de nombreuses plaques MEMA peut être fait à la fois.Puis récupérer les ligands du congélateur, et décongeler dans la glace dans un capot d’écoulement laminaire. Feuilletez brièvement et tournez vers le bas chaque tube. Utilisez le tampon recommandé par le fabricant pour diluer les ligands à un stock de travail 200 fois.Pipette 10 microlitres de chaque stock de ligand 200 fois dans le puits correspondant dans la plaque de 96 puits. Utilisez un film d’étanchéité pour sceller les plaques et les conserver à moins-20 degrés Celsius. Faites des plaques de traitement ligand en lots, et capturez toutes les métadonnées pour l’analyse en aval.Avant de faire la culture des cellules, bloquer les MEMA avec deux millilitres par puits de tampon de blocage nonfouling pendant 20 minutes. Utilisez un séparateur Y avec deux pipettes Pasteur pour aspirer tampon de blocage dans plusieurs puits à la fois, puis triple laver les puits avec PBS. Pour éviter la dessiccation, laissez le volume final de PBS dans les puits jusqu’à ce qu’il soit prêt pour le placage cellulaire.Avant une expérience MEMA complète, optimisez la concentration d’ensemencement des cellules MCF7 en effectuant une expérience de titration cellulaire. Un endroit idéal, comme indiqué ici, a un nombre suffisant de cellules pour extraire des données, mais pas tellement que l’endroit est trop confluent. Dans le MEMA, aspirer les cellules MCF7 restantes de PBS et de graines à 30 000 à 35 000 cellules par puits dans deux millilitres de milieu d’ensemencement.Placez le MEMA dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après l’adhérence pendant la nuit dans l’incubateur, aspirer le milieu et remplacer par deux millilitres de milieu de croissance réduit pour isoler l’impact stimulant de ligands spécifiques. Décongeler ensuite une plaque de traitement ligand préalablement congelée sur la glace.Centrifugeuse plaque décongelée à 200 fois g pendant une minute. Transférer 200 microlitres de milieu de chaque puits dans la plaque de culture MEMA au puits approprié dans la plaque de traitement ligand. Pipette de haut en bas pour mélanger le ligand avec le milieu, et transférer ce mélange vers le puits approprié dans la plaque de culture MEMA.Rock légèrement à la main et retourner les plaques MEMA à l’incubateur pour la culture de la combinaison ligand-ECM à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 71 heures, ajouter 100 fois EdU aux puits MEMA pour une concentration finale de 10 micromolaires. Incubez-le pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Après l’incubation finale, aspirer les puits. Fixer les MEMA en deux millilitres par puits de 2%PFA pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le PFA des puits.Perméabilize avec deux millilitres par puits de 0,1% surfactant non ionique pendant 15 minutes. Aspirer le surfactant, puis laver les puits avec deux millilitres de PBS et PBS-T, séquentiellement. Par la suite, ajoutez 1,5 millilitres de réaccentrages de réaction de détection EdU à chaque puits.Incuber pendant une heure à température ambiante, à bascule et à l’abri de la lumière. Ensuite, étancher la réaction avec 1,5 millilitre tampon d’étanchéation commerciale par puits. Aspirez à nouveau et lavez-les avec du PBS-T avant d’incuber avec des concentrations optimisées de taches ou d’anticorps.Incuber les puits MEMA avec des anticorps primaires dans le tampon de coloration, se berçant à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation primaire d’anticorps, lavez les puits avec PBS suivis de PBS-T. Ajouter des anticorps secondaires dans 0,5 microgramme par millilitre DAPI, dilué dans le tampon de coloration.Incuber, en basculant pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Lavez les puits deux fois avec deux millilitres par puits de PBS, et laissez-les dans les deux derniers millilitres de PBS. Pour colorer le MEMA taché, placez-le au microscope d’un système d’imagerie automatisé avec des canaux de détection fluorescents appropriés.Sortie des données d’image résultantes vers un système de gestion d’image. Segmentez les cellules et calculez les niveaux d’intensité à l’aide de CellProfiler. Dans ce protocole, les profils de cycle cellulaire des valeurs d’intensité binned DAPI par rapport au nombre de cellules d’une plaque de huit puits indiquent les cellules dans la phase de cycle cellulaire G1 contre G2.Cela correspond à deux teneurs en NDNA dans les cellules en phase de croissance précoce, et quatre teneurs en NDNA dans les cellules sur le point de subir une mitose. L’impact du microenvironnement des ligands et de l’ECM sur le nombre de cellules et l’incorporation d’EdU est démontré. Le rouge indique un nombre de cellules plus élevé, et le bleu est un nombre de cellules inférieur.Beaucoup d’effets sont ligand-conduits, car la condition d’ECM n’a pas fortement impacté le nombre de cellules ou la positivité d’EdU. Natagen 1 est une exception claire, car la présence de cette molécule ECM inhibe la liaison cellulaire et la croissance du MCF7. Ligands tels que FGF6 et neuregulin-1 alpha améliorer le nombre de cellules et ont des taux élevés d’incorporation EdU, tandis que les ligands tels que l’amphiregulin et neuregulin-1 SMDF inhibent la liaison cellulaire et la croissance des cellules.Un exemple de cellules MCF7 se développent sur un spot MEMA traité avec neuregulin-1 alpha montre des taux élevés d’incorporation d’EdU, indiqués par les noyaux roses. Dans cette image, la tache verte est masque cellulaire, et le bleu est DAPI. Étant donné qu’une expérience MEMA complète coûte cher, il est très important d’effectuer des étapes d’optimisation, telles que des titrations cellulaires et sériques, avant d’effectuer l’expérience complète.Une fois que les conditions microenvironnementales d’intérêt sont identifiées à l’aide de la plate-forme MEMA, les ligands spécifiques et les protéines matricielles extracellulaires peuvent être étudiés plus en profondeur à l’aide des systèmes traditionnels de culture cellulaire 2D et 3D.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

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le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotidienne Cancer Cell Injection pour produire des modèles de souris de Brain Métastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Utilisant le test de Dot pour analyser la Migration des cellules feuilles

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

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The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

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Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

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Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

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