Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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Diese Arbeit wurde von der NIH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS) gefördert, die HG008100 (J.W.G., L.M.H. und J.E.K.) gewährte.

HINWEIS: Eine Übersicht über den gesamten MEMA-Prozess, einschließlich der geschätzten Zeit, ist im Flussdiagramm in Abbildung 1dargestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von MEMAs in 8-Well-Platten. Das Protokoll kann für andere Platten oder Dias angepasst werden.
1. Herstellung von Protein-, Verdünnungs- und Färbepuffern
<ol><li>Ausgleich durch Fläschchen von ECMs, Liganden und Zytokinen auf Raumtemperatur (RT) und kurz Z...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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Die Bedeutung von "Dimensionalität" und Kontext war ein motivierender Faktor bei der Entwicklung von In-vitro-Kultursystemen als Werkzeuge für die Charakterisierung von Krebszellen durch ihre Interaktion mit der Mikroumgebung11und die Fähigkeit von In-vitro-Kultursystemen Kultursysteme, um die in vivo-Umgebung nachzuahmen, sind eine treibende Kraft hinter dem Streben, diese Kultursysteme zu verbessern. In-vitro-Systeme bleiben jedoch wichtige Instrumente der Krebsforschung gerade wegen ihrer F?...

Die Kultivierung von Krebszelllinien auf Kunststoff in zweidimensionalen (2D) Monolayern bleibt eines der Wichtigsten Arbeitspferde für Krebsforscher. Jedoch, die Mikroumgebung wird zunehmend für seine Fähigkeit, zelluläre Phänotypen zu beeinflussen erkannt. Bei Krebs, die Tumor-Mikroumgebung ist bekannt, mehrere zelluläre Verhaltensweisen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Überleben, Invasion, und Reaktion auf Therapie1,2. Herkömmliche monolayer Zellkulturen haben in der Regel keine Mikroumgebungseinflüsse, was zur Entwicklung komplexerer dreidimensionaler (3D) Assays zum Wachsen von Zellen geführt hat, einschließlich kommerziell erhältlicher gereinigter Kellermembranextrakte. Diese gereinigten Matrizen sind jedoch in der Regel kompliziert zu verwenden und leiden unter technischen Problemen wie Chargenvariabilität3 und komplexen Zusammensetzungen3. Infolgedessen kann es schwierig sein, bestimmten Proteinen, die sich aufzelluläre Phänotypen auswirken können, eine Funktion zuzuweisen 3 .
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir die Microenvironment Microarray (MEMA) Technologie entwickelt, die die Mikroumgebung auf einfache Kombinationen von extrazellulärer Matrix (ECM) und löslichen Wachstumsfaktorproteinenreduziert 4,5 . Die MEMA-Plattform ermöglicht die Identifizierung dominanter Mikroumweltfaktoren, die das Verhalten von Zellen beeinflussen. Mithilfe eines Arrayformats können Tausende von Kombinationen von Mikroumgebungsfaktoren in einem einzigen Experiment ermittelt werden. Das hier beschriebene MEMA hinterfragt 2.500 verschiedene einzigartige Mikroumgebungsbedingungen. ECM-Proteine, die in Brunnenplatten gedruckt werden, bilden Wachstumspads, auf denen Zellen kultiviert werden können. Lösliche Liganden werden einzelnen Brunnen zugesetzt, wodurch an jedem einzelnen Ort, dem die Zellen ausgesetzt sind, einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen (ECM + Ligand) entstehen. Zellen werden für mehrere Tage kultiviert, dann fixiert, gefärbt und abgebildet, um zelluläre Phänotypen als Ergebnis der Exposition gegenüber diesen spezifischen Mikroumgebungskombinationen zu bewerten. Da es sich bei den Mikroumgebungen um einfache Kombinationen handelt, ist es einfach, Proteine zu identifizieren, die große phänotypische Veränderungen in den Zellen antreiben. MEMAs wurden erfolgreich verwendet, um Faktoren zu identifizieren, die mehrere zelluläre Phänotypen beeinflussen, einschließlich derjenigen, die Entscheidungen über das Zellschicksal und die Reaktion auf Therapie4,5,6,7vorantreiben. Diese Reaktionen können in einfachen 2D-Experimenten validiert und dann unter Bedingungen beurteilt werden, die die Komplexität der Tumormikroumgebung vollständiger rekapitulieren. Die MEMA-Plattform ist sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl von Zelltypen und Endpunkten, vorausgesetzt, dass gute phänotypische Biomarker verfügbar sind.

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

Das Verständnis der Auswirkungen der Mikroumgebung auf den Phänotyp von Zellen ist aufgrund der komplexen Mischung sowohl aus löslichen Wachstumsfaktoren als auch matrixassoziierten Proteinen in der Mikroumgebung in vivo ein schwieriges Problem. Darüber hinaus verwenden leicht verfügbare Reagenzien für die Modellierung von Mikroumgebungen in vitro in der Regel komplexe Mischungen von Proteinen, die unvollständig definiert sind und unter der Variabilität von Charge zu Charge leiden. Die Microenvironment Microarray (MEMA)-Plattform ermöglicht die Bewertung tausender einfacher Kombinationen von Mikroumweltproteinen für ihre Auswirkungen auf zelluläre Phänotypen in einem einzigen Test. Die MEMAs werden in Brunnenplatten hergestellt, was die Zugabe einzelner Liganden ermöglicht, um Brunnen zu trennen, die arrayierte extrazelluläre Matrixproteine (ECM) enthalten. Die Kombination des löslichen Liganden mit jedem gedruckten ECM bildet eine einzigartige Kombination. Ein typischer MEMA-Assay enthält mehr als 2.500 einzigartige kombinatorische Mikroumgebungen, denen Zellen in einem einzigen Assay ausgesetzt sind. Als Testfall wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf der MEMA-Plattform plattiert. Die Analyse dieses Assays identifizierte Faktoren, die das Wachstum und die Proliferation dieser Zellen sowohl verbessern als auch hemmen. Die MEMA-Plattform ist hochflexibel und kann für den Einsatz mit anderen biologischen Fragen über die Krebsforschung hinaus erweitert werden.

Um die Auswirkungen der Mikroumwelt auf das Zellwachstum und die Zellproliferation zu vereinfachen und Bedingungen zu identifizieren, die das Zellwachstum und die Zellproliferation förderten oder hemmten, wurde die Brustkrebszelllinie MCF7 auf einer Reihe von acht 8-Well-MEMAs gesät, wie im Protokoll beschrieben. Dieser Assay setzte die Zellen 48 verschiedenen EKMs und 57 verschiedenen Liganden für insgesamt 2736 kombinatorische mikroökologische Bedingungen aus. Nach 71 h in der Kultur wurden Zellen mit EdU gepulst, ...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist es, zu zeigen, wie Mikroumgebungsmikroarrays (MEMA) hergestellt und verwendet werden können, um die Auswirkungen von Tausenden von einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen auf den Phänotyp kultivierter Zellen abzufragen.

Verwendung von Mikroarrays zur Vernehmung von Mikroumweltauswirkungen auf zelluläre Phänotypen bei Krebs

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Die Untersuchung der Tumormikroumgebung ist aufgrund ihrer Komplexität schwierig. Wir haben Mikroumgebungsmikroarrays entwickelt, die aus einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen bestehen, die die Identifizierung wichtiger Treiber von Tumorzellphänotypen ermöglichen. Der hauptvorteil der MEMA-Plattform besteht darin, dass es aufgrund der definierten Mikroumgebungsbedingungen einfach ist, Mikroumgebungsfaktoren zu identifizieren, die Phänotypen von Interesse antreiben.Die MEMA-Plattform ist in anderen Nicht-Krebs-Systemen, einschließlich Primärzellstämmen und Stammzellen, weit verbreitet. Es gibt eine Reihe von technischen Tricks und Schritten, die wir entwickelt haben, um die Arbeit an der nassen Bank zu beschleunigen und das Protokoll zu vereinfachen. Verwenden Sie zunächst einen Touch-Pin-Drucker, um extrazelluläre Matrixdruckmischungen an fiduzialen Flecken in Acht-Well-Platten zu drucken.Verwenden Sie Pins mit 350 Mikrometern Durchmesser, die in einer vierfach siebendruckigen Druckkopfkonfiguration angeordnet sind, um die extrazelluläre Matrix für die Mikroumgebungsmikroarrays zu drucken. Der Kollagenblock wird als Raster auf MEMAs gedruckt. Die PBS-gefüllten Brunnen bieten zusätzliche Feuchtigkeit, um ein Austrocknen der extrazellulären Matrix-Druckmischungs-Quellplatte zu verhindern.Drucken Sie die Arrays in den Acht-Well-Platten als 20 Spalten in 35 Reihen, für insgesamt 700 Punkte. Nach dem Drucken Platten mindestens drei Tage vor der Verwendung in einem Trockenschrank lagern. Entwerfen Sie zunächst ein 96-Well-Plattenlayout mit Abstand, das den Einsatz einer Mehrkanalpipette mit vier Abstandsspitzen ermöglicht, so dass die Behandlung vieler MEMA-Platten gleichzeitig erfolgen kann.Dann holen Sie die Liganden aus dem Gefrierschrank, und tauen in Eis in einer laminaren Strömung haukapuze. Kurz streichen und drehen Sie jede Röhre nach unten. Verwenden Sie den vom Hersteller empfohlenen Puffer, um die Liganden auf einen 200-fachen Arbeitsbestand zu verdünnen.Pipette 10 Mikroliter von jedem 200-fachen Ligandenbestand in den entsprechenden Brunnen innerhalb der 96-Well-Platte. Verwenden Sie Dichtungsfolie, um die Platten zu versiegeln und bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Erstellen Sie Ligandenbehandlungsplatten in Chargen und erfassen Sie alle Metadaten für die nachgelagerte Analyse.Blockieren Sie vor der Kultivierung von Zellen die MEMAs mit zwei Millilitern pro Bohrkörper des nicht störenden Blockierpuffers für 20 Minuten. Verwenden Sie einen Y-Splitter mit zwei Pasteur Pipetten, um den Sperrpuffer in mehreren Brunnen gleichzeitig zu aspirieren, und waschen Sie dann die Brunnen dreifach mit PBS. Um die Austrocknung zu verhindern, lassen Sie das endgültige Volumen von PBS in den Brunnen, bis sie für die Zellbeschichtung bereit sind.Optimieren Sie vor einem vollständigen MEMA-Experiment die MCF7-Zellsaatkonzentration, indem Sie ein Zelltitrationsexperiment durchführen. Ein idealer Ort, wie hier gezeigt, hat genügend Zellzahlen, um Daten zu extrahieren, aber nicht so viele, dass der Spot übermäßig konfluent ist. Im MEMA die verbleibenden PBS- und Saat-MCF7-Zellen bei 30 000 bis 35 000 Zellen pro Brunnen in zwei Millilitern Sämedium ansaugen.Stellen Sie das MEMA bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Nach der Haftung über Nacht im Inkubator, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie durch zwei Milliliter reduzierten Wachstumsmedium, um die stimulierende Wirkung von bestimmten Liganden zu isolieren. Dann eine zuvor gefrorene Ligandenbehandlungsplatte auf Eis auftauen.Zentrifuge aufgetaut Platte bei 200 mal g für eine Minute. 200 Mikroliter Medium von jedem Brunnen in der MEMA-Kulturplatte auf den entsprechenden Brunnen in der Ligandenbehandlungsplatte übertragen. Rohrleitung nach oben und unten, um den Liganden mit dem Medium zu mischen, und diese Mischung zurück in den entsprechenden Brunnen in der MEMA-Kulturplatte übertragen.Leicht von Hand schaukeln und die MEMA-Platten zum Inkubator zurückbringen, um die Liganden-ECM-Kombination bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu bewirtschaften. Nach 71 Stunden 100-mal EdU in die MEMA-Bohrungen geben, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu erreichen. Inkubieren Sie es für eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Nach der letzten Inkubation, aspirieren Sie die Brunnen. Fix MEMAs in zwei Milliliter pro Brunnen von 2%PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann die PFA aus den Brunnen aspirieren.Permeabilisieren Sie mit zwei Millilitern pro Brunnen von 0,1% nichtionisches Tensid für 15 Minuten. Das Tensid ansaugen und dann die Brunnen mit zwei Millilitern PBS und PBS-T nacheinander waschen. Danach fügen Sie 1,5 Milliliter EdU-Erkennungsreaktionsreagenzien zu jedem Brunnen hinzu.Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, schaukeln und vor Licht schützen. Dann die Reaktion mit 1,5 Milliliter kommerziellequench Puffer pro Brunnen zu löschen. Wieder aspirieren und mit PBS-T waschen, bevor sie mit optimierten Konzentrationen von Flecken oder Antikörpern inkubiert werden.MeMA-Brunnen mit primären Antikörpern im Färbepuffer inkubieren, die über Nacht bei vier Grad Celsius schaukeln. Nach der primären Antikörperinkubation, waschen Brunnen mit PBS gefolgt von PBS-T. Fügen Sie sekundäre Antikörper in 0,5 Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzu, verdünnt in Einem Färbepuffer.Inkubieren, eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln schaukeln. Waschen Sie Brunnen zweimal mit zwei Millilitern pro Brunnen PBS, und lassen Sie sie in den letzten zwei Milliliter PBS. Um meMA abgebildet zu zeigen, stellen Sie es auf die Mikroskopstufe eines automatisierten Bildgebungssystems mit geeigneten Fluoreszenzdetektionskanälen.Ausgabe resultierender Bilddaten an ein Bildverwaltungssystem. Segmentieren Sie Zellen und berechnen Sie Intensitätsstufen mit CellProfiler. In diesem Protokoll zeigen Zellzyklusprofile von binned DAPI-Intensitätswerten im Vergleich zu Zellzahlen von einer Acht-Well-Platte Zellen in g1 im Vergleich zur G2-Zellzyklusphase an.Dies entspricht zwei nDNA-Gehalt in Zellen in der frühen Wachstumsphase und vier nDNA-Gehalt in Zellen, die kurz vor der Mitose stehen. Die Auswirkungen der Mikroumgebung von Liganden und ECM auf die Zellzahl und die EdU-Einarbeitung werden gezeigt. Rot gibt eine höhere Zellenzahl an, und blau ist die niedrigere Zellennummer.Viele der Effekte sind Liganden-gesteuert, da die ECM-Bedingung die Zellzahl oder EdU-Positivität nicht stark beeinflusst hat. Natagen 1 ist eine klare Ausnahme, da das Vorhandensein dieses ECM-Moleküls die Zellbindung und das Wachstum von MCF7 hemmt. Liganden wie FGF6 und Neuregulin-1 alpha erhöhen die Zellzahl und haben hohe Raten der EdU-Inkorporation, während Liganden wie Amphiregulin und Neuregulin-1 SMDF die Zellbindung und das Wachstum von Zellen hemmen.Ein Beispiel für MCF7-Zellen, die an einem meMA-Spot wachsen, der mit Neuregulin-1 alpha behandelt wird, zeigt hohe Raten der EdU-Inkorporation, die durch rosa Kerne angezeigt werden. In diesem Bild ist grüner Fleck eine Zellmaske und blau DAPI. Da ein vollständiges MEMA-Experiment teuer ist, ist es sehr wichtig, Optimierungsschritte wie Zell- und Serumtitrationen durchzuführen, bevor das vollständige Experiment durchgeführt wird.Sobald mit der MEMA-Plattform mikroökologische Bedingungen von Interesse identifiziert wurden, können die spezifischen Liganden und extrazellulären Matrixproteine mit herkömmlichen 2D- und 3D-Zellkultursystemen eingehender untersucht werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Mit 22 3 Anti-PD-L1-Antikörper konzentrieren sich auf Biopsie und Zytologie Proben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...