Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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इस काम नेटवर्क सेलुलर हस्ताक्षर (LINCS) अनुदान HG008100 (J.W.G., L.M.H., और J.E.K.) के NIH आम निधि पुस्तकालय द्वारा समर्थित किया गया था.

नोट: अनुमानित समय सहित संपूर्ण MEMA प्रक्रिया का ओवरव्यू चित्र 1में दर्शाए गए प्रवाह आरेख में रेखांकित किया गया है। इस प्रोटोकॉल 8 अच्छी प्लेटों में MEMAs के निर्माण का विवरण. प्रोटोकॉल अन्?...

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"आयामीता" और संदर्भ के महत्व microenvironment11के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से कैंसर की कोशिकाओं की विशेषता में उपकरण के रूप में इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों के विकास में एक प्रेरित कारक रहा है , और इन विट...

दो आयामी (2 डी) monolayers में प्लास्टिक पर कैंसर सेल लाइनों की Culturing कैंसर शोधकर्ताओं के लिए प्रमुख workhorses में से एक बनी हुई है. हालांकि, microenvironment तेजी से सेलुलर phenotypes को प्रभावित करने की क्षमता के लिए मान्यता प्राप्त किया जा रहा है. कैंसर में, ट्यूमर microenvironment कई सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, विकास सहित, अस्तित्व, आक्रमण, और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया1,2. पारंपरिक monolayer सेल संस्कृतियों आम तौर पर microenvironment प्रभावों की कमी है, जो अधिक जटिल तीन आयामी (3 डी) assays के विकास के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध तहखाने झिल्ली अर्क सहित. हालांकि, इन शुद्ध matrices आम तौर पर उपयोग करने के लिए जटिल हैं और बैच परिवर्तनशीलता3 और जटिल रचनाओं3के रूप में तकनीकी समस्याओं से ग्रस्त हैं. परिणामस्वरूप, विशिष्ट प्रोटीनों को फ़ंक्शन असाइन करना कठिन हो सकता है जो कोशिकीय फीनोटाइप्स3को प्रभावित कर सकता है।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने माइक्रोएमेंटेरेन माइक्रोरेरे (एमईएमए) तकनीक विकसित की है, जोमाइक्रोएमेंटेंस को अपचारी मैट्रिक्स (ईसीएम) और घुलनशील वृद्धि कारक प्रोटीन 4, 5 के सरल संयोजन ों तक कम कर देता है। . MEMA मंच प्रमुख microenvironmental कारकों है कि कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित की पहचान सक्षम बनाता है. एक सरणी प्रारूप का उपयोग करके, microenvironment कारकों के संयोजन के हजारों एक ही प्रयोग में परख किया जा सकता है. यहाँ वर्णित MEMA 2,500 विभिन्न अद्वितीय microenvironment शर्तों पूछताछ. ईसीएम प्रोटीन अच्छी तरह से प्लेटों में मुद्रित विकास पैड जिस पर कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा सकता है फार्म. घुलनशील ligands व्यक्तिगत कुओं में जोड़ रहे हैं, प्रत्येक अलग जगह है जो कोशिकाओं को उजागर कर रहे हैं पर अद्वितीय combinatorial microenvironments (ECM + ligand) बनाने. कोशिकाओं को कई दिनों के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं, तो तय, दाग, और इन विशिष्ट microenvironment संयोजन के लिए जोखिम का एक परिणाम के रूप में सेलुलर phenotypes का आकलन करने के लिए छवि. चूंकि microenvironments सरल संयोजन कर रहे हैं, यह प्रोटीन है कि कोशिकाओं में प्रमुख phenotypic परिवर्तन ड्राइव की पहचान करने के लिए सीधा है. MEMAs सफलतापूर्वक कारकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि कई सेलुलर phenotypes को प्रभावित, उन है कि सेल भाग्य निर्णय ड्राइव और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया सहित4,5,6,7. इन प्रतिक्रियाओं को सरल 2 D प्रयोगों में मान्य किया जा सकता है और फिर उन परिस्थितियों में मूल्यांकन किया जा सकता है जो ट्यूमर माइक्रोएमेंम्पवायरन की जटिलता को फिर से दोहराते हैं। MEMA मंच अत्यधिक सेल प्रकार और समापन बिंदु की एक किस्म के लिए अनुकूल है, बशर्ते कि अच्छा phenotypic biomarkers उपलब्ध हैं.

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

कोशिकाओं के फीनोटाइप पर सूक्ष्म पर्यावरण के प्रभाव को समझना एक कठिन समस्या है क्योंकि विवो में सूक्ष्म पर्यावरण में घुलनशील विकास कारकों और मैट्रिक्स-संबद्ध प्रोटीन दोनों के जटिल मिश्रण के कारण एक कठिन समस्या है। इसके अलावा, इन विट्रो में microenvironments के मॉडलिंग के लिए आसानी से उपलब्ध अभिकर्मकों आम तौर पर प्रोटीन है कि अधूरी परिभाषित कर रहे हैं और बैच से बैच परिवर्तनशीलता से पीड़ित जटिल मिश्रण का उपयोग. microenvironment microarray (MEMA) मंच एक परख में सेलुलर phenotypes पर उनके प्रभाव के लिए microenvironment प्रोटीन के सरल संयोजन के हजारों के आकलन के लिए अनुमति देता है. MEMAs अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार कर रहे हैं, जो व्यक्तिगत ligands के अलावा सरणी extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन युक्त कुओं को अलग करने के लिए अनुमति देता है. प्रत्येक मुद्रित ECM के साथ घुलनशील लिगंड का संयोजन एक अद्वितीय संयोजन रूपों. एक ठेठ MEMA परख से अधिक शामिल 2,500 अद्वितीय combinatorial microenvironments कि कोशिकाओं को एक परख में उजागर कर रहे हैं. एक परीक्षण के मामले के रूप में, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 MEMA मंच पर चढ़ाया गया था. इस परख के विश्लेषण कारकों की पहचान की है कि दोनों को बढ़ाने और वृद्धि और इन कोशिकाओं के प्रसार को बाधित. MEMA मंच अत्यधिक लचीला है और कैंसर अनुसंधान से परे अन्य जैविक सवालों के साथ उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है.

सेल विकास और प्रसार पर microenvironmental प्रभावों को सरल बनाने के लिए और शर्तों है कि बढ़ावा दिया या सेल विकास और प्रसार को बाधित की पहचान करने के लिए, स्तन कैंसर सेल लाइन MCF7 आठ 8 अच्छी तरह से MEMAs के एक सेट पर बीज के रूप ?...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य यह दिखाने के लिए है कि कैसे microenvironment microarrays (MEMA) गढ़ा जा सकता है और सुसंस्कृत कोशिकाओं के phenotype पर सरल combinatorial microenvironments के हजारों के प्रभाव से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया.

कैंसर में सेलुलर Phenotypes पर Microenvironmental प्रभाव पूछताछ करने के लिए Microarrays का उपयोग

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

इसकी जटिलता के कारण ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का अध्ययन करना मुश्किल है। हमने माइक्रोएनवायरमेंट माइक्रोएरे विकसित किए हैं जिनमें सरल संयोजन माइक्रोएनवायरमेंट्स शामिल हैं जो ट्यूमर सेल फेनोटाइप के प्रमुख ड्राइवरों की पहचान की अनुमति देते हैं। MEMA मंच का प्रमुख लाभ यह है कि क्योंकि माइक्रोएनवायरमेंट की स्थिति सभी परिभाषित कर रहे हैं, यह माइक्रोएनवायरमेंट कारकों की पहचान करने के लिए सीधा है जो ब्याज के फेनोटाइप ड्राइव करते हैं।मेमा प्लेटफॉर्म प्राथमिक कोशिका उपभेदों और स्टेम सेल सहित अन्य गैर-कैंसर प्रणालियों में व्यापक रूप से लागू होता है। वेट बेंच वर्क को गति देने और प्रोटोकॉल को आसान बनाने के लिए हमने कई इंजीनियरिंग ट्रिक्स और स्टेप्स तैयार किए हैं । शुरू करने के लिए, आठ-अच्छी प्लेटों में प्रत्ययी स्थानों में एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रिंट मिश्रण प्रिंट करने के लिए एक टच पिन प्रिंटर का उपयोग करें।माइक्रोएनवायरमेंट माइक्रोएरे के लिए एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रिंट करने के लिए चार गुना-सात प्रिंट हेड कॉन्फिगरेशन में व्यवस्थित 350-माइक्रोमीटर व्यास पिन का उपयोग करें। कोलेजन ब्लॉक एक ग्रिड के रूप में MEMAs पर मुद्रित किया जाता है। पीबीएस से भरे कुएं एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रिंट मिश्रण स्रोत प्लेट से सूखने से रोकने के लिए अतिरिक्त आर्द्रता प्रदान करते हैं।कुल 700 स्थानों के लिए, 35 पंक्तियों द्वारा 20 स्तंभों के रूप में आठ-अच्छी प्लेटों में सरणी प्रिंट करें। मुद्रण के बाद, उपयोग करने से पहले कम से कम तीन दिनों के लिए एक डिसिकेटर में प्लेटों को स्टोर करें। सबसे पहले, अंतर के साथ एक 96-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट डिजाइन करें जो चार दूरी वाले सुझावों के साथ एक बहु-चैनल पिपेट के उपयोग की अनुमति देता है, ताकि कई मेमा प्लेटों का उपचार एक बार में किया जा सके।फिर फ्रीजर से लिगामेंट्स को पुनः प्राप्त करें, और एक लैमिनार प्रवाह हुड में बर्फ में गल जाएं। संक्षेप में झटका और प्रत्येक ट्यूब नीचे स्पिन। लिगांड को 200 गुना काम करने वाले स्टॉक में पतला करने के लिए निर्माता की अनुशंसित बफर का उपयोग करें।प्रत्येक 200-बार लिगांड स्टॉक के पिपेट 10 माइक्रोलीटर 96-अच्छी प्लेट के भीतर संबंधित अच्छी तरह से। प्लेटों को सील करने के लिए सीलिंग फिल्म का उपयोग करें और उन्हें शून्य-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बैचों में लिगामेंट ट्रीटमेंट प्लेट्स बनाएं, और डाउनस्ट्रीम एनालिसिस के लिए सभी मेटाडेटा को कैप्चर करें ।कोशिकाओं को बनाने से पहले, 20 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने वाले नॉनफोलिंग के दो मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से MEMAs को ब्लॉक करें। एक बार में कई कुओं में अवरुद्ध बफर को aspirate करने के लिए दो पाश्चुर पिपेट के साथ एक वाई-स्प्लिटर का उपयोग करें, और फिर पीबीएस के साथ कुओं को ट्रिपल धोएं। Desiccation को रोकने के लिए, सेल चढ़ाना के लिए तैयार जब तक कुओं में PBS की अंतिम मात्रा छोड़ दें ।एक पूर्ण MEMA प्रयोग से पहले, एक सेल टिटरेशन प्रयोग करके MCF7 सेल सीडिंग एकाग्रता को अनुकूलित करें। एक आदर्श स्थान, जैसा कि यहां दिखाया गया है, डेटा निकालने के लिए पर्याप्त सेल नंबर हैं, लेकिन इतने सारे नहीं हैं कि स्थान पीढ़ी भ्रमित हो। MEMA में, बीज मध्यम के दो मिलीलीटर में शेष पीबीएस और सीड एमसीएफ7 कोशिकाओं को 30, 000 से 35, 000 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से एस्पिरेट करें।मेमा को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेटर में रातोंरात आसंजन के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और विशिष्ट लिगांड के उत्तेजक प्रभाव को अलग करने के लिए कम विकास माध्यम के दो मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें। फिर बर्फ पर पहले से जमे हुए लिगामेंट ट्रीटमेंट प्लेट को गल लें ।एक मिनट के लिए 200 बार जी पर सेंट्रलाइज गल प्लेट। मेमा कल्चर प्लेट में प्रत्येक कुएं से माध्यम के 200 माइक्रोलीटर को लिगांड उपचार प्लेट में उपयुक्त कुएं में स्थानांतरित करें। माध्यम के साथ लिगामेंट को मिलाने के लिए पिपेट अप और डाउन करें, और इस मिश्रण को मेमा कल्चर प्लेट में उचित कुएं में वापस स्थानांतरित करें।हल्के से हाथ से रॉक और इनक्यूबेटर के लिए MEMA प्लेटों को वापस करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर ligand-ECM संयोजन संस्कृति । 71 घंटे के बाद, 10 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए मेमा कुओं में 100 गुना एडू जोड़ें। इसे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।अंतिम इनक्यूबेशन के बाद, कुओं को आकांक्षी करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2% पीएफए के अच्छी तरह से प्रति दो मिलीलीटर में MEMAs ठीक करें । फिर कुआं से पीएफए को आकांक्षी करें।15 मिनट के लिए 0.1% नॉनएनिक सर्फेक्टेंट के दो मिलीलीटर प्रति कुएं के साथ परमीलिट करें। सर्फेक्टेंट को एस्पिरेट करें, और फिर पीबीएस और पीबीएस-टी के दो मिलीलीटर के साथ कुओं को क्रमिक रूप से धोएं। उसके बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से 1.5 मिलीलीटर एडू डिटेक्शन रिएक्शन रिएजेंट जोड़ें।कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट, कमाल और प्रकाश से संरक्षित। फिर 1.5 मिलीलीटर वाणिज्यिक शमन बफर प्रति अच्छी तरह से प्रतिक्रिया को बुझाें। फिर से एस्पिरेट करें, और दाग या एंटीबॉडी की अनुकूलित सांद्रता के साथ इनक्यूबेटिंग करने से पहले पीबीएस-टी के साथ धोएं।धुंधला बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ MEMA कुओं इनक्यूबेट, रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर कमाल । प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस-टी के बाद पीबीएस के साथ कुओं को धोएं। 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर DAPI में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें, धुंधला बफर में पतला।इनक्यूबेट, अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए कमाल । पीबीएस के प्रति कुएं दो मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं, और उन्हें पीबीएस के अंतिम दो मिलीलीटर में छोड़ दें। छवि दाग MEMA के लिए, यह उचित फ्लोरोसेंट डिटेक्शन चैनलों के साथ एक स्वचालित इमेजिंग सिस्टम के माइक्रोस्कोप चरण पर रखें ।आउटपुट जिसके परिणामस्वरूप छवि डेटा एक छवि प्रबंधन प्रणाली के लिए। सेलप्रोफिलर का उपयोग करके कोशिकाओं को खंडित करें और तीव्रता के स्तर की गणना करें। इस प्रोटोकॉल में, बिन्ड डीएपीआई तीव्रता मूल्यों बनाम सेल की सेल चक्र प्रोफाइल 18-अच्छी प्लेट से गिना जाता है जो जी 1 बनाम जी-2 सेल चक्र चरण में कोशिकाओं को इंगित करता है।यह प्रारंभिक विकास चरण में कोशिकाओं में दो एनडीएनए सामग्री से मेल खाता है, और कोशिकाओं में चार एनडीएनए सामग्री माइटोसिस से गुजरने के बारे में है। सेल नंबर और एडू निगमन दोनों पर लिगामेंट्स और ईसीएम के माइक्रोएनवायरमेंट का असर दिखाया गया है। लाल उच्च सेल संख्या इंगित करता है, और नीला कम सेल संख्या है।कई प्रभाव लिगांड-चालित हैं, क्योंकि ईसीएम स्थिति ने सेल नंबर या एडू सकारात्मकता को दृढ़ता से प्रभावित नहीं किया। नेटजेन 1 एक स्पष्ट अपवाद है, क्योंकि इस ईसीएम अणु की उपस्थिति सेल बाध्यकारी और एमसीएफ 7 के विकास को रोकती है। एफजीएफ 6 और न्यूरेग्लिन-1 अल्फा जैसे लिगांड सेल संख्या को बढ़ाते हैं और एडू निगमन की उच्च दरें होती हैं, जबकि एम्फीरिगुलिन और न्यूरेगुलिन-1 एसएमडीएफ जैसे लिगाइंड सेल बाइंडिंग और कोशिकाओं के विकास को रोकते हैं।NEF7 कोशिकाओं का एक उदाहरण neuregulin-1 अल्फा के साथ इलाज एक MEMA स्थान पर बढ़ रहा है एडू निगमन की उच्च दरों से पता चलता है, गुलाबी नाभिक द्वारा संकेत दिया । इस छवि में, हरे रंग का दाग सेल मास्क है, और नीला DAPI है। चूंकि एक पूर्ण MEMA प्रयोग महंगा है, इसलिए पूर्ण प्रयोग करने से पहले सेल और सीरम टिटरेशन जैसे अनुकूलन चरणों का प्रदर्शन करना बहुत महत्वपूर्ण है।एक बार मेमा प्लेटफॉर्म का उपयोग करके ब्याज की माइक्रोएनवायरमेंटल स्थितियों की पहचान की जाती है, पारंपरिक लिगामेंट्स और एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स प्रोटीन का पारंपरिक 2D और 3डी सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग करके अधिक गहराई से अध्ययन किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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