Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione HG008100 (J.W.G., L.M.H.) niH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS).

NOT:</</c0> Una panoramica dell'intero processo MEMA, incluso il tempo stimato, è descritta nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di MEMA in lastre a 8 pozze. Il protocollo può essere adattato per altre piastre o diapositive.
1. Preparazione di buffer proteici, diluenti e coloranti
<ol><li>Fiale di ECMs Equilibrat ligando, e citochine a temperatura ambiente (RT) e centrifug...

<ol>
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L'importanza della "dimensionalità" e del contesto è stata un fattore motivante nello sviluppo di sistemi di coltura in vitro come strumenti nella caratterizzazione delle cellule tumorali attraverso la loro interazione con il microambiente11,e la capacità di in vitro sistemi di coltura per imitare l'ambiente in vivo è una forza trainante dietro la ricerca di migliorare quei sistemi di coltura. I sistemi in vitro, tuttavia, rimangono strumenti significativi di ricerca sul cancro proprio a causa...

La raccolta di linee cellulari tumorali su plastica in monostrati bidimensionali (2D) rimane uno dei principali cavalli di battaglia per i ricercatori oncologici. Tuttavia, il microambiente è sempre più riconosciuto per la sua capacità di impatto sui fenotipi cellulari. Nel cancro, il microambiente tumorale è noto per influenzare più comportamenti cellulari, tra cui la crescita, sopravvivenza, invasione, e la risposta alla terapia1,2. Le colture cellulari monostratore tradizionali in genere mancano di influenze microambientali, il che ha portato allo sviluppo di analisi tridimensionali più complesse (3D) per far crescere le cellule, compresi gli estratti di membrana seminterrato purificati disponibili in commercio. Tuttavia, queste matrici purificate sono in genere complicate da usare e soffrono di problemi tecnici come la variabilità del lotto3 e le composizioni complesse3. Di conseguenza, può essere difficile assegnare la funzione a specifiche proteine che possono avere un impatto sui fenotipi cellulari3.
Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato la tecnologia microarray microambiente (MEMA), che riduce il microambiente fino a semplici combinazioni di matrice extracellulare (ECM) e proteine solubili del fattore di crescita4,5 . La piattaforma MEMA consente l'identificazione di fattori microambientali dominanti che influenzano il comportamento delle cellule. Utilizzando un formato di matrice, migliaia di combinazioni di fattori di microambiente possono essere tese in un unico esperimento. La MEMA qui descritta interroga 2.500 diverse condizioni di microambiente unico. Le proteine ECM stampate in lastre di pozzo formano pastiglie di crescita su cui le cellule possono essere coltivate. I ligandi solubili vengono aggiunti ai singoli pozzi, creando microambienti combinatori unici (ECM e ligando) su ogni punto diverso a cui sono esposte le cellule. Le cellule vengono coltivate per diversi giorni, quindi fisse, colorate e imagete per valutare i fenotipi cellulari come risultato dell'esposizione a queste specifiche combinazioni di microambienti. Poiché i microambienti sono semplici combinazioni, è semplice identificare le proteine che guidano i principali cambiamenti fenotipici nelle cellule. I MEMA sono stati utilizzati con successo per identificare i fattori che influenzano più fenotipi cellulari, compresi quelli che guidano le decisioni del destino cellulare e la risposta alla terapia4 ,5,6,7. Queste risposte possono essere convalidate in semplici esperimenti 2D e possono quindi essere valutate in condizioni che riassumono più pienamente la complessità del microambiente tumorale. La piattaforma MEMA è altamente adattabile a una varietà di tipi di cellule ed endpoint, a condizione che siano disponibili buoni biomarcatori fenotipici.

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

Comprendere l'impatto del microambiente sul fenotipo delle cellule è un problema difficile dovuto alla complessa miscela di fattori di crescita solubili e proteine associate a matrici nel microambiente in vivo. Inoltre, i reagenti prontamente disponibili per la modellazione di microambienti in vitro in genere utilizzano complesse miscele di proteine che sono incompletamente definite e soffrono di variabilità in lotti. La piattaforma microarray microambiente (MEMA) consente la valutazione di migliaia di semplici combinazioni di proteine microambientali per il loro impatto sui fenotipi cellulari in un unico test. I MEMA sono preparati in piastre di pozzo, che consente l'aggiunta di singoli ligandri per separare pozzi contenenti proteine a matrice extracellulare (ECM) suddivise. La combinazione del ligando solubile con ogni ECM stampato forma una combinazione unica. Un tipico test MEMA contiene più di 2.500 microambienti combinatori unici a cui le cellule sono esposte in un unico test. Come test case, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata placcata sulla piattaforma MEMA. L'analisi di questo analisi ha identificato i fattori che migliorano e inibiscono la crescita e la proliferazione di queste cellule. La piattaforma MEMA è altamente flessibile e può essere estesa per l'uso con altre questioni biologiche al di là della ricerca sul cancro.

Per semplificare gli impatti microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule e per identificare le condizioni che hanno promosso o inibito la crescita e la proliferazione cellulare, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata seminata su una serie di otto MEMA con 8 carri come descritto nel protocollo. Questo test ha esposto le cellule a 48 diversi EPER e 57 diversi ligandi, per un totale di 2736 condizioni microambientali combinatori. Dopo 71 h in coltura, le cellule sono state pulsate con EdU, ...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Lo scopo del metodo qui presentato è quello di mostrare come i microarray di microambiente (MEMA) possono essere fabbricati e utilizzati per interrogare l'impatto di migliaia di semplici microambienti combinatori sul fenotipo delle cellule coltivate.

Utilizzo di microarray per interrogare l'impatto microambientale sui fenotipi cellulari nel cancro

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Studiare il microambiente tumorale è difficile a causa della sua complessità. Abbiamo sviluppato microarray di microambiente costituiti da semplici microambientati combinatori che consentono l'identificazione dei principali driver dei fenotipi delle cellule tumorali. Il principale vantaggio della piattaforma MEMA è che, poiché le condizioni del microambiente sono tutte definite, è semplice identificare i fattori microambientali che guidano fenotipi di interesse.La piattaforma MEMA è ampiamente applicabile in altri sistemi non oncologici, compresi i ceppi di cellule primarie e le cellule staminali. Ci sono una serie di trucchi e passaggi ingegneristici che abbiamo sviluppato per accelerare il lavoro sul banco bagnato e semplificare il protocollo. Per iniziare, utilizzare una stampante a spillo per stampare la miscela di stampa a matrice extracellulare in punti fiduciari in lastre a otto potte.Utilizzare perni di diametro di 350 micrometri disposti in una configurazione della testina di stampa quattro volte e sette per stampare la matrice extracellulare per i microarray di microambiente. Il blocco di collagene viene stampato su MEMA come griglia. I pozzi riempiti di PBS forniscono ulteriore umidità per evitare l'essiccazione dalla piastra di alimentazione della miscela di stampa a matrice extracellulare.Stampare gli array nelle lastre da otto pozzi come 20 colonne per 35 righe, per un totale di 700 punti. Dopo la stampa, conservare le lastre in un essiccatore per un minimo di tre giorni prima dell'uso. In primo luogo, progettare un layout a piastre a 96 po 'con spaziatura che consenta l'uso di una pipetta multicanale con quattro punte distanziate, in modo che il trattamento di molte piastre MEMA possa essere fatto contemporaneamente.Quindi recuperare i ligandi dal congelatore e scongelare nel ghiaccio in una cappa di flusso laminare. Scorrere brevemente e girare giù per ogni tubo. Utilizzare il tampone consigliato dal produttore per diluire i ligandi in uno stock di lavoro 200 volte superiore.Pipetta 10 microlitri di ogni calcio di ligando 200 volte nel pozzo corrispondente all'interno della piastra da 96 pozzi. Utilizzare la pellicola di tenuta per sigillare le piastre e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Creare piastre di trattamento del ligando in lotti e acquisire tutti i metadati per l'analisi a valle.Prima di coltivare le cellule, bloccare i MEMA con due millilitri per pozzo di buffer di blocco non fogliante per 20 minuti. Utilizzare uno splitter Y con due pipette Pasteur per aspirare il buffer di blocco in più pozzi contemporaneamente, quindi lavare triplicare i pozzi con PBS. Per evitare l'essiccazione, lasciare il volume finale di PBS nei pozzi fino a quando non è pronto per la placcatura cellulare.Prima di un esperimento MEMA completo, ottimizzare la concentrazione di semina cellulare MCF7 eseguendo un esperimento di titolazione cellulare. Un punto ideale, come mostrato qui, ha numeri di cella sufficienti per estrarre i dati, ma non così tanti che il punto è esente da confluenti. Nel MEMA, aspirare le restanti cellule PBS e MCF7 di semi a 30.000-35.000 cellule per pozzo in due millilitri di mezzo di semina.Posizionare il MEMA in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo l'adesione durante la notte nell'incubatore, aspirare il mezzo e sostituire con due millilitri di mezzo di crescita ridotto per isolare l'impatto stimolante di ligandi specifici. Quindi scongelare una piastra di trattamento del ligando precedentemente congelata sul ghiaccio.Piastra scongelata centrifuga a 200 volte g per un minuto. Trasferire 200 microlitri di mezzo da ogni pozzo nella piastra di coltura MEMA al pozzo appropriato nella piastra di trattamento del ligando. Pipettare su e giù per mescolare il ligando con il mezzo e trasferire questa miscela al pozzo appropriato nella piastra di coltura MEMA.Dondola leggermente a mano e restituisci le piastre MEMA all'incubatore per coltura della combinazione ligando-ECM a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 71 ore, aggiungere 100 volte EdU ai pozzi MEMA per una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubarlo per un'altra ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo l'incubazione finale, aspirare i pozzi. Fissare i MEMA in due millilitri per pozzo del 2%PFA per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi aspirare la PFA dai pozzi.Permeabilize con due millilitri per pozzo dello 0,1% di tensioattivi non ionici per 15 minuti. Aspirare il tensioattivo, quindi lavare i pozzi con due millilitri di PBS e PBS-T, in sequenza. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di reagenti di reazione di rilevamento EdU a ciascun pozzo.Incubare per un'ora a temperatura ambiente, dondolando e protetto dalla luce. Quindi spegnere la reazione con tampone di tempra commerciale da 1,5 millilitri per pozzo. Aspirare di nuovo e lavare con PBS-T prima di incubare con concentrazioni ottimizzate di macchie o anticorpi.Incubare i pozzi MEMA con anticorpi primari nel tampone di colorazione, dondolando a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione di anticorpi primari, lavare i pozzi con PBS seguito da PBS-T. Aggiungere anticorpi secondari in 0,5 microgrammi per millilitro DAPI, diluiti nel tampone di colorazione.Incubare, dondolando per un'ora a temperatura ambiente al buio. Lavare i pozzi due volte con due millilitri per pozzo di PBS e lasciarli negli ultimi due millilitri di PBS. Per l'immagine macchiata di MEMA, posizionarla sul palco del microscopio di un sistema di imaging automatizzato con adeguati canali di rilevamento fluorescenti.Output dei dati dell'immagine risultanti in un sistema di gestione delle immagini. Segmentare le celle e calcolare i livelli di intensità utilizzando CellProfiler. In questo protocollo, i profili del ciclo cellulare dei valori di intensità DAPI binned rispetto al conteggio delle celle da una piastra a otto pozzi indicano le celle nella fase del ciclo cellulare G1 rispetto a G2.Ciò corrisponde a due contenuti di nDNA nelle cellule nella fase iniziale di crescita e a quattro contenuti di nDNA nelle cellule che sta per subire la mitosi. Viene mostrato l'impatto del microambiente dei ligandi e dell'ECM sia sul numero di cella che sull'incorporazione dell'EdU. Il rosso indica un numero di cella più alto e il blu è un numero di cella inferiore.Molti degli effetti sono guidati dal ligando, poiché la condizione ECM non ha avuto un forte impatto sul numero di cellulare o sulla positività dell'EdU. Natagen 1 è una chiara eccezione, poiché la presenza di questa molecola ECM inibisce il legame cellulare e la crescita di MCF7. Ligandi come FGF6 e neuregulin-1 alfa migliorano il numero di cellule e hanno alti tassi di incorporazione di EdU, mentre ligandi come anfiregulina e neuregulina-1 SMDF inibiscono il legame cellulare e la crescita delle cellule.Un esempio di cellule MCF7 che crescono su un punto MEMA trattato con neuregulin-1 alpha mostra alti tassi di incorporazione di EdU, indicati dai nuclei rosa. In questa immagine, la macchia verde è maschera di cella e il blu è DAPI. Poiché un esperimento MEMA completo è costoso, è molto importante eseguire passaggi di ottimizzazione, come titolazioni cellulari e siere, prima di eseguire l'esperimento completo.Una volta identificate le condizioni microambientali di interesse utilizzando la piattaforma MEMA, i ligandi specifici e le proteine della matrice extracellulare possono essere studiati in modo più approfondito utilizzando i tradizionali sistemi di coltura cellulare 2D e 3D.

Research

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