Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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この研究は、NIHコモン・ファンド・ライブラリー・オブ・ネットワーク・セルラー・シグネチャー(LINCS)助成金HG008100(J.W.G.、L.M.H.、J.E.K)によって支援されました。

注:MEMA プロセス全体の概要 (推定時間を含む) は、図 1に示すフロー図に概説されています。このプロトコルは、8ウェルプレートにおけるMEMAの製造について詳しく述べています。プロトコルは、他のプレートまたはスライドに適合してもよい。
1. タンパク質、希釈剤、染色バッファーの調製
<ol><li>EPM、リガンド、サイトカインのバイ?...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound.">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li></ol>

「次元性」と文脈の重要性は、微小環境11との相互作用を通じて癌細胞の特性評価のツールとしてのインビトロ培養システムの開発の動機付け要因となっている11、およびインビトロの能力インビボ環境を模倣する文化システムは、これらの文化システムを改善するための探求の原動力です。しかし、インビトロシステムは、単純化されたモデル12にインビ?...

2次元(2D)単層におけるプラスチック上の癌細胞株の培養は、がん研究者にとって依然として主要な主力の1つである。しかし、微小環境は、細胞の型示しに影響を与える能力のためにますます認識されています。癌において、腫瘍微小環境は、成長、生存、侵侵入、および治療1、2への応答を含む複数の細胞行動に影響を与える知られている。従来の単層細胞培養は、通常、微小環境の影響を欠き、市販の精製基膜抽出物を含む細胞を成長させるより複雑な3次元(3D)アッセイの開発につながっている。しかし、これらの精製行列は、通常、使用が複雑であり、バッチ変動3や複雑な組成3などの技術的な問題に苦しむ。その結果、細胞表現型3に影響を与える可能性のある特定のタンパク質に機能を割り当てるのは困難な場合があります。
これらの限界に対処するため、微小環境マイクロアレイ(MEMA)技術を開発し、微小環境を細胞外マトリックス(ECM)と可溶性成長因子タンパク質の単純な組み合わせにまで削減する4,5.MEMAプラットフォームは、細胞の挙動に影響を与える主要な微小環境因子の同定を可能にします。配列形式を使用することで、何千もの微小環境因子の組み合わせを1回の実験でアッセイすることができます。ここで説明するMEMAは、約2,500の異なるユニークな微小環境条件を尋問する。ウェルプレートに印刷されたECMタンパク質は、細胞を培養できる成長パッドを形成します。可溶性リガンドは個々のウェルに添加され、細胞が露出する各異なるスポットにユニークな組み合わせ微小環境(ECM +リガンド)を作成します。細胞は数日間培養され、次いで固定され、染色され、これらの特定の微小環境の組み合わせへの曝露の結果として細胞表現型を評価するために画像化される。微小環境は単純な組み合わせであるため、細胞の主要な現象的変化を駆動するタンパク質を特定するのは簡単です。MEMAは、細胞の運命決定と治療4、5、6、7への応答を駆動するものを含む、複数の細胞表現型に影響を与える因子を同定するために正常に使用されている。これらの応答は、単純な2D実験で検証することができ、腫瘍微小環境の複雑さをより完全に要約する条件下で評価することができます。MEMAプラットフォームは、良好なプノチピックバイオマーカーが利用可能である場合、様々な細胞タイプおよびエンドポイントに非常に適応可能です。

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

細胞の表現型に対する微小環境の影響を理解することは、生体内の微小環境における可溶性成長因子とマトリックス関連タンパク質の両方の複雑な混合物による困難な問題である。さらに、インビトロでの微小環境のモデリングに容易に利用可能な試薬は、通常、不完全に定義され、バッチからバッチの変動に苦しむタンパク質の複雑な混合物を利用します。マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)プラットフォームは、単一のアッセイにおける細胞表現型への影響について、マイクロ環境タンパク質の数千もの単純な組み合わせの評価を可能にします。MEMAはウェルプレートで調製され、個々のリガンドをアレイされた細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を含むウェルを分離することができます。各印刷されたECMとの可溶性リガンドの組み合わせは、ユニークな組み合わせを形成します。典型的なMEMAアッセイには、細胞が単一のアッセイでさらされている2,500を超えるユニークな組み合わせ微小環境が含まれています。試験ケースとして、乳癌細胞株MCF7をMEMAプラットフォーム上でメッキした。このアッセイの分析は、これらの細胞の増殖および増殖を増強および阻害する因子を同定した。MEMAのプラットホームは非常に適用範囲が広く、癌の研究を超えて他の生物学的質問と使用するために拡張することができる。

細胞増殖および増殖に対する微小環境影響を簡素化し、細胞増殖および増殖を促進または阻害する条件を同定するために、乳癌細胞株MCF7は、プロトコルに記載されている8ウェルMEMAのセットに播種した。このアッセイは、合計2736の組み合わせ微小環境条件のために、48の異なるEPMと57の異なるリガンドに細胞を曝露しました。培養71時間後、細胞をEdUでパルスし、固定、透過化、DAPI、EdU検出?...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

ここで提示される方法の目的は、マイクロ環境マイクロアレイ(MEMA)を作製し、培養細胞の表現型に対する何千もの単純な組み合わせ微小環境の影響を調べるために使用する方法を示すことです。

マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

腫瘍微小環境の研究は、その複雑さのために困難です。我々は、腫瘍細胞型の主要な要因を同定することを可能にする単純な組み合わせ微小環境からなる微小環境マイクロアレイを開発した。MEMA プラットフォームの主な利点は、マイクロ環境条件がすべて定義されているため、関心のあるフェノタイプを駆動する微小環境要因を識別することが簡単であるということです。MEMAプラットフォームは、一次細胞株および幹細胞を含む他の非癌系で広く適用可能である。湿ったベンチの仕事をスピードアップし、プロトコルを簡素化するために開発したエンジニアリングのトリックとステップの数があります。まず、タッチピンプリンタを使用して、受託者スポットの細胞外マトリックス印刷混合物を8ウェルプレートに印刷します。直径350マイクロメートルのピンを4回7回のプリントヘッド構成に配置して、微小環境マイクロアレイ用の細胞外マトリックスを印刷します。コラーゲンブロックは、グリッドとしてMEMに印刷されます。PBS充填されたウェルは、細胞外マトリックス印刷混合物ソースプレートの乾燥を防ぐために余分な湿度を提供します。8 ウェルプレートに配列を 20 列ずつ 35 行で印刷し、合計 700 個のスポットを印刷します。印刷後は、使用前に少なくとも3日間デシケータにプレートを保管してください。まず、多くのMEMAプレートの処理を一度に行うことができるように、4つの間隔のチップを持つマルチチャンネルピペットの使用を可能にする間隔を持つ96ウェルプレートレイアウトを設計します。次に、冷凍庫からリガンドを取り出し、層流フードの氷で解凍します。各チューブを簡単にフリックしてスピンダウンします。メーカーの推奨バッファを使用して、リガンドを200倍の作業在庫に希釈します。ピペット10マイクロリットルの各200回のリガンドストックは、96ウェルプレート内の対応するウェルに入った。シールフィルムを使用してプレートを密封し、マイナス20度で保管してください。リガンド処理プレートをバッチで作成し、下流分析用のすべてのメタデータをキャプチャします。細胞を培養する前に、非汚汚ブロックバッファーのウェルあたり2ミリリットルでMEMAsを20分間ブロックします。2つのパスツールピペットを備えたYスプリッターを使用して、ブロッキングバッファーを一度に複数のウェルに吸い込み、PBSで3倍に洗浄します。乾燥を防ぐために、細胞めっきの準備ができるまで、PBSの最終容積を井戸に残します。完全なMEMA実験の前に、細胞滴定実験を行うことによりMCF7細胞の播種濃度を最適化する。理想的なスポットは、ここに示すように、データを抽出するのに十分なセル番号を持っていますが、スポットが過度にコンフルエントであるほど多くはありません。MEMAでは、残りのPBSを吸引し、2ミリリットルの播種培地で30,000〜35,000個の細胞を1ウェルで播種する。MEMAを摂氏37度のインキュベーターに入れる。インキュベーターで一晩接着した後、培地を吸引し、2ミリリットルの還元成長培地に置き換えて、特定のリガンドの刺激的影響を単離する。その後、氷の上に以前に凍結したリガンド処理プレートを解凍します。遠心分離機は1分間200回gでプレートを解凍した。MEMA培養板の各ウェルからリガンド処理板の適切なウェルに培地200マイクロリットルを移す。ピペットを上下にしてリガンドを培地と混合し、この混合物をMEMA培養プレート内の適切なウェルに戻します。軽く手で揺れ、MEMAプレートをインキュベーターに戻し、リガンドとECMの組み合わせを摂氏37度と5%の二酸化炭素で培養する。71時間後、MEMAウェルに100回EdUを加え、10マイクロモルの最終濃度を求めます。摂氏37度と5%の二酸化炭素でさらに1時間インキュベートします。最終インキュベーションの後、井戸を吸引する。室温で15分間2%PFAのウェルあたり2ミリリットルでMEMAsを固定します。その後、井戸からPFAを吸引します。15分間0.1%の非イオン性界面活性剤のウェルあたり2ミリリットルで透過化する。界面活性剤を吸引し、次いでPBSとPBS-Tの2ミリリットルでウェルを順次洗浄する。その後、各ウェルに1.5ミリリットルのEdU検出反応試薬を加えます。室温で1時間インキュベートし、揺れ、光から保護します。その後、1.5ミリリットルの市販のクエンチバッファーを使用して反応を焼き付けます。再度吸い込み、最適化された濃度の汚れまたは抗体でインキュベートする前にPBS-Tで洗浄します。MEMAウェルを染色バッファーの一次抗体でインキュベートし、一晩で摂氏4度で揺れます。一次抗体インキュベーションに続いて、PBSでウェルを洗浄し、続いてPBS-Tを洗浄する。2次抗体を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムのDAPIに添加し、染色バッファーで希釈します。インキュベート、暗闇の中で室温で1時間揺れる。PBSの井戸あたり2ミリリットルで井戸を2回洗い、PBSの最後の2ミリリットルに残します。画像染色MEMAに、適切な蛍光検出チャネルを備えた自動イメージングシステムの顕微鏡ステージに配置します。結果の画像データを画像管理システムに出力します。セルをセグメント化し、CellProfiler を使用して強度レベルを計算します。このプロトコルでは、ビン分割されたDAPI強度値のセルサイクルプロファイルと1つの8ウェルプレートからのセルカウントは、G1とG2細胞周期期の細胞を示す。これは、初期の増殖期の細胞内の2つのnDNA含有量と、有糸分裂を起間させる細胞内の4つのnDNA含有量に相当する。リガンドとECMの微小環境が細胞数とEdUの組み込みの両方に及ぼす影響を示す。赤はセル番号が高いことを示し、青はセル番号の低さです。ECM条件が細胞数またはEdU陽性に強く影響を与えなかったことを示す効果の多くは、リガンド駆動である。Natagen 1は、このECM分子の存在がMCF7の細胞結合および増殖を阻害するので、明確な例外である。FGF6やノイレグリン-1アルファなどのリガンドは細胞数を高め、EdUの取り込みの割合が高く、アンファイヤグリンやノイレグリン-1 SMDFなどのリガンドは細胞結合および細胞増殖を阻害します。ニューレグリン-1αで処理されたMEMAスポット上で増殖するMCF7細胞の一例は、ピンク核によって示される高いEdUの取り込み率を示す。この画像では、緑色の染色はセルマスク、青はDAPIです。完全なMEMA実験は高価であるため、完全な実験を行う前に、細胞および血清滴定などの最適化ステップを実行することが非常に重要である。MEMAプラットフォームを用いて目的とする微小環境条件を特定すると、従来の2Dおよび3D細胞培養システムを用いて、特定のリガンドおよび細胞外マトリックスタンパク質をより深く研究することができます。

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Cancer Research

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