Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela biblioteca de fundos comuns da NIH de assinaturas de rede celular (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., e J. E. K).

Nota: Uma visão geral de todo o processo MEMA, incluindo o tempo estimado, é descrita no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Este protocolo detalha a fabricação de MEMAs em placas de 8 poços. O protocolo pode ser adaptado para outras placas ou lâminas.
1. preparação de buffers de proteína, diluente e coloração
<ol><li>Equilibrar frascos de ECMs, ligantes e citocinas à temperatura ambiente (RT) e centrifugar brevemente. Adicione o...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. 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A importância da "dimensionalidade" e do contexto tem sido um fator motivador no desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro como ferramentas na caracterização de células cancerosas através de sua interação com o microambiente11, e a capacidade de in vitro sistemas de cultura para imitar o ambiente in vivo é uma força motriz por trás da busca para melhorar esses sistemas de cultura. No entanto, os sistemas in vitro continuam a ser instrumentos significativos de investigação do canc...

A cultura de linhagens de células cancerosas em plástico em monocamadas bidimensional (2D) continua sendo um dos principais cavalos de trabalho para pesquisadores de câncer. No entanto, o microambiente está sendo cada vez mais reconhecido por sua capacidade de impactar os fenótipos celulares. No câncer, o microambiente tumoral é conhecido por influenciar múltiplos comportamentos celulares, incluindo crescimento, sobrevida, invasão e resposta à terapia1,2. As culturas tradicionais da pilha do monocamada faltam tipicamente influências do microambiente, que conduziu ao desenvolvimento de uns ensaios tridimensionais (3D) mais complexos para crescer pilhas, incluindo extratos purificados comercialmente disponíveis da membrana do porão. No entanto, essas matrizes purificadas são tipicamente complicadas de usar e sofrem de problemas técnicos, como a variabilidade do lote3 e composições complexas3. Como resultado, pode ser difícil atribuir a função a proteínas específicas que podem estar afetando os fenótipos celulares3.
Para abordar essas limitações, desenvolvemos a tecnologia microarray (Mema), que reduz o microambiente até combinações simples de matriz extracelular (ECM) e proteínas de fator de crescimento solúvel4,5 . A plataforma MEMA possibilita a identificação de fatores microambientais dominantes que impactam o comportamento das células. Usando um formato de matriz, milhares de combinações de fatores de microambiente podem ser testadas em um único experimento. O MEMA descrito aqui interroates ~ 2.500 diferentes condições únicas de microambiente. As proteínas ECM impressas em placas de poço formam almofadas de crescimento sobre as quais as células podem ser cultivadas. Os ligantes solúveis são adicionados aos poços individuais, criando os microambientes combinatória originais (ECM + ligand) em cada ponto diferente a que as pilhas são expostas. As células são cultivadas por vários dias, em seguida, fixo, manchado, e imaged para avaliar fenótipos celulares como resultado da exposição a estas combinações específicas de microambiente. Desde que os microambientes são combinações simples, é direto identificar as proteínas que conduzem mudanças fenotípicas principais nas pilhas. As memas têm sido utilizadas com sucesso para identificar fatores que influenciam vários fenótipos celulares, incluindo aqueles que impulsionam as decisões de destino da célula e a resposta à terapia4,5,6,7. Essas respostas podem ser validadas em experimentos 2D simples e, em seguida, podem ser avaliadas em condições que recapitulam mais plenamente a complexidade do microambiente tumoral. A plataforma MEMA é altamente adaptável a uma variedade de tipos de células e endpoints, desde que estejam disponíveis bons biomarcadores fenotípicos.

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

Compreender o impacto do microambiente no fenótipo das células é um problema difícil devido à complexa mistura de fatores de crescimento solúvel e proteínas associadas à matriz no microambiente in vivo. Além disso, os reagentes prontamente disponíveis para a modelagem de microambientes in vitro utilizam tipicamente misturas complexas das proteínas que são definidas incompletamente e sofrem da variabilidade do grupo à lote. A plataforma do microarray do microambiente (Mema) permite a avaliação de milhares de combinações simples de proteínas do microambiente para seu impacto em fenótipos celulares em um único ensaio. Os MEMAs são preparados em placas de poço, o que permite a adição de ligantes individuais para separar os poços contendo proteínas de matriz extracelular (ECM) dispostas. A combinação do ligante solúvel com cada ECM impresso dá forma a uma combinação original. Um ensaio típico MEMA contém mais de 2.500 microambientes combinatórios únicos que as células são expostas em um único ensaio. Como um caso de teste, a linha celular MCF7 do cancro da mama foi chapeada na plataforma de MEMA. A análise deste ensaio identificou fatores que aumentam e inibem o crescimento e a proliferação dessas células. A plataforma MEMA é altamente flexível e pode ser estendida para uso com outras questões biológicas além da pesquisa de câncer.

Para simplificar os impactos microambientais no crescimento e proliferação celular e identificar condições que promoveram ou inibiram o crescimento e proliferação celular, a linha celular de câncer de mama MCF7 foi semeada em um conjunto de oito MEMAs de 8 poços, conforme descrito no protocolo. Este ensaio expôs as células a 48 diferentes ECMs e 57 ligantes diferentes, para um total de 2736 condições microambientais combinatórias. Após 71 h na cultura, as pilhas foram pulsada com EdU, fixo, permeablized, e ...

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Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Estudar o microambiente tumoral é difícil devido à sua complexidade. Desenvolvemos microarrays de microambiente que consistem em microambientes combinatórios simples que permitem a identificação de grandes condutores de fenótipos de células tumorais. A maior vantagem da plataforma MEMA é que, como as condições de microambiente são todas definidas, é simples identificar fatores de microambientes que impulsionam fenótipos de interesse.A plataforma MEMA é amplamente aplicável em outros sistemas não cancerígenos, incluindo cepas de células primárias e células-tronco. Há uma série de truques de engenharia e passos que desenvolvemos para acelerar o trabalho de banco molhado e simplificar o protocolo. Para começar, use uma impressora de pinos de toque para imprimir mistura de impressão de matriz extracelular em pontos fiduciários em placas de oito poços.Use pinos de diâmetro de 350 micrômetros dispostos em uma configuração de cabeça de impressão quatro vezes sete para imprimir a matriz extracelular para as microarrays de microambientes. O bloco de colágeno é impresso em MEMAs como uma grade. Os poços cheios de PBS fornecem umidade extra para evitar a secagem da placa de origem da mistura de impressão da matriz extracelular.Imprima as matrizes nas placas de oito poços e 20 colunas por 35 linhas, totalizando 700 pontos. Após a impressão, armazene as placas em um dessecador por um mínimo de três dias antes do uso. Primeiro, projete um layout de placa de 96 poços com espaçamento que permita o uso de uma pipeta multicanal com quatro pontas espaçadas, para que o tratamento de muitas placas MEMA possa ser feito de uma só vez.Em seguida, recupere os ligantes do congelador, e descongele no gelo em um capô de fluxo laminar. Gire brevemente e gire para baixo cada tubo. Use o buffer recomendado pelo fabricante para diluir os ligantes a um estoque de trabalho 200 vezes.Pipeta 10 microliters de cada estoque de ligantes 200 vezes no poço correspondente dentro da placa de 96 poços. Use filme de vedação para selar as placas e armazená-las a menos de 20 graus Celsius. Faça placas de tratamento de ligante em lotes e capture todos os metadados para análise a jusante.Antes de modelar as células, bloqueie os MEMAs com dois mililitros por poço de tampão de bloqueio não-insano por 20 minutos. Use um divisor Y com duas pipetas Pasteur para aspirar o buffer de bloqueio em vários poços ao mesmo tempo e, em seguida, lavar três vezes os poços com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS nos poços até ficar pronto para o revestimento celular.Antes de um experimento completo de MEMA, otimize a concentração de semeadura de células MCF7 realizando um experimento de titulação celular. Um ponto ideal, como mostrado aqui, tem números de células suficientes para extrair dados, mas não tantos que o local é excessivamente confluente. No MEMA, aspire as células de PBS e sementes restantes mcf7 em 30.000 a 35.000 células por poço em dois mililitros de meio de semeadura.Coloque o MEMA em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após a adesão durante a noite na incubadora, aspire o meio e substitua por dois mililitros de meio de crescimento reduzido para isolar o impacto estimulativo de ligantes específicos. Em seguida, descongele uma placa de tratamento de ligantes previamente congelada no gelo.Placa desvalada centrífuga a 200 vezes g por um minuto. Transfira 200 microliters de meio de cada poço na placa de cultura MEMA para o poço apropriado na placa de tratamento de ligantes. Pipeta para cima e para baixo para misturar o ligante com o meio, e transferir essa mistura de volta para o poço apropriado na placa de cultura MEMA.Levemente balançar à mão e devolver as placas MEMA à incubadora para cultivar a combinação ligante-ECM a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 71 horas, adicione 100 vezes o EdU aos poços mema para uma concentração final de 10 micromolar. Incuba-o por mais uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após a incubação final, aspire os poços. Fixar MEMAs em dois mililitros por poço de 2%PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o PFA dos poços.Permeabilize com dois mililitros por poço de surfactante noniônico de 0,1% por 15 minutos. Aspire o surfactante e depois lave os poços com dois mililitros de PBS e PBS-T, sequencialmente. Depois disso, adicione 1,5 mililitros de reagentes de reação de detecção de EdU a cada poço.Incubar por uma hora em temperatura ambiente, balançando e protegido contra a luz. Em seguida, sacie a reação com 1,5 mililitro comercial saciar tampão por poço. Aspire novamente e lave com PBS-T antes de incubar com concentrações otimizadas de manchas ou anticorpos.Incubar poços MEMA com anticorpos primários no tampão de coloração, balançando a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação primária de anticorpos, lave poços com PBS seguidos de PBS-T. Adicione anticorpos secundários em 0,5 microgramas por DAPI mililitro, diluídos no tampão de coloração.Incubar, balançando por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Lave poços duas vezes com dois mililitros por poço de PBS, e deixe-os nos dois mililitros finais da PBS. Para a imagem manchada mema, coloque-o no estágio microscópio de um sistema de imagem automatizado com canais de detecção fluorescentes apropriados.Saída resultante de dados de imagem para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando CellProfiler. Neste protocolo, os perfis de ciclo celular de valores de intensidade de DAPI binned versus contagem celular de uma placa de oito poços indicam células na fase de ciclo de células G1 versus G2.Isso corresponde a dois teor de nDNA em células em fase inicial de crescimento, e quatro teor de nDNA em células prestes a sofrer mitose. O impacto do microambiente de ligantes e ECM no número de células e na incorporação da EdU é mostrado. Vermelho indica maior número de células, e azul é menor número de células.Muitos dos efeitos são orientados por ligantes, uma vez que a condição de ECM não impactou fortemente o número celular ou a positividade da EdU. Natagen 1 é uma clara exceção, pois a presença desta molécula de ECM inibe a ligação celular e o crescimento do MCF7. Ligantes como FGF6 e neuregulina-1 alfa aumentam o número celular e têm altas taxas de incorporação da EdU, enquanto ligantes como a anfiiregulina e neuregulina-1 SMDF inibem a ligação celular e o crescimento das células.Um exemplo de células MCF7 crescendo em um ponto MEMA tratado com neuregulina-1 alfa mostra altas taxas de incorporação de EdU, indicadas por núcleos cor-de-rosa. Nesta imagem, a mancha verde é máscara celular, e azul é DAPI. Como um experimento mema completo é caro, é muito importante realizar etapas de otimização, como titulações celulares e soros, antes de realizar o experimento completo.Uma vez identificadas condições microambientais de interesse usando a plataforma MEMA, os ligantes específicos e proteínas de matriz extracelular podem ser estudados com mais profundidade usando sistemas tradicionais de cultura celular 2D e 3D.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Pesquisa do câncer

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Usando 22 3 anticorpo Anti-PD-L1 concentrar-se na biópsia e citologia amostras de pacientes de câncer de pulmão não-pequenas células

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Coloração elástica em lâminas de parafina-Embedded de pT3N0M0 tecido de câncer gástrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

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Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...