Name: using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH Общий фонд Библиотека сетевых сотовых подписей (LINCS) грант HG008100 (J.W.G., L.M.H., и J.E.K.).

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор всего процесса MEMA, включая расчетное время, изложен на диаграмме потока, показанной на рисунке 1. В этом протоколе подробно описано изготовление MEMA в 8-колодцах. Протокол может быть адаптирован для других пластин или слайдов.
1. Под...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>LaBarge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments.">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).</li><li>Watson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-Mediated+Mechanisms+of+Resistance+to+HER2+Inhibitors+Differ+between+HER2++Breast+Cancer+Subtypes.">Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes.</a> Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).</li><li>Ranga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+niche+microarrays+for+systems-level+analyses+of+cell+fate.">3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate.</a> Nature Communications. 5, 4324 (2014).</li><li>Malta, D. F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+microarrays+to+study+inductive+signaling+for+endoderm+specification.">Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification.</a> Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+Unwanted+Variation+from+High+Dimensional+Data+with+Negative+Controls.">Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls.</a> University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).</li><li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMERO:+flexible,+model-driven+data+management+for+experimental+biology.">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+"normal"+cell+in+culture.">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li><li>Serban, M. A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+extracellular+matrices:+solutions+for+the+puzzle.">Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle.</a> Methods. 45 (1), 93-98 (2008).</li><li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays.">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li><li>Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound.">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li></ol>

Важность "мерности" и контекста был мотивирующее фактор в развитии систем культуры in vitro в качестве инструментов в характеристике раковых клеток через их взаимодействие с микросредой11, и способность in vitro культурные системы для имитации среды in vivo является движущей силой с...

Культирование раковых клеток линий на пластике в двумерных (2D) монослой остается одним из основных рабочих лошадок для исследователей рака. Тем не менее, микросреда все больше признается за его способность влиять на клеточные фенотипы. При раке, микроокружение опухоли, как известно, влияет на несколько клеточного поведения, в том числе рост, выживание, вторжение, и ответ на терапию1,2. Традиционные монослойные клеточные культуры, как правило, не имеют влияния микроэкологии, что привело к разработке более сложных трехмерных (3D) анализов для выращивания клеток, в ключая коммерчески доступные очищенные экстракты мембраны подвала. Тем не менее, эти очищенные матрицы, как правило, сложны в использовании и страдают от технических проблем, таких как вариабельность пакетов3 и сложные композиции3. В результате, это может быть трудно назначить функцию конкретных белков, которые могут влиять на клеточные фенотипы3.
Для устранения этих ограничений мы разработали технологию микроокружения microarray (MEMA), которая сводит микроокружение к простым сочетаниям внеклеточной матрицы (ECM) и растворимых белков фактора роста4,5 . Платформа MEMA позволяет выявлять доминирующие микроэкологические факторы, влияющие на поведение клеток. Используя формат массива, тысячи комбинаций факторов микросреды могут быть рассмотрены в одном эксперименте. MEMA описал здесь допрашивает 2500 различных уникальных условий микросреды. Белки ECM, напечатанные в хорошо пластины образуют рост колодки, на которых клетки могут быть культивированы. Растворимые лиганды добавляются в отдельные скважины, создавая уникальные комбинаторные микросреды (ECM и ligand) на каждом различном месте, к которому подвергаются клетки. Клетки культивируются в течение нескольких дней, затем фиксируются, окрашиваются и образуются для оценки клеточных фенотипов в результате воздействия этих специфических комбинаций микросреды. Поскольку микросреда представляет собой простые комбинации, легко определить белки, которые управляют основными фенотипическими изменениями в клетках. MEMAs были успешно использованы для выявления факторов, которые влияют на несколько клеточных фенотипов, в том числе те, которые управляют решениями судьбы клеток и ответ на терапию4,5,6,7. Эти ответы могут быть проверены в простых 2D-экспериментов, а затем могут быть оценены в условиях, которые более полно резюмировать сложность микросреды опухоли. Платформа MEMA хорошо адаптируется к различным типам клеток и конечным точкам, при условии, что имеются хорошие фенотипические биомаркеры.

using microarrays to interrogate microenvironmental impact on cellular phenotypes in cancer

Понимание влияния микроокружения на фенотип клеток является сложной проблемой из-за сложной смеси как растворимых факторов роста, так и матричных белков в микроокружении in vivo. Кроме того, легкодоступные реагенты для моделирования микросред в пробирке обычно используют сложные смеси белков, которые не полностью определены и страдают от пакетной к пакетной изменчивости. Платформа микроокружения microarray (MEMA) позволяет оценить тысячи простых комбинаций белков микросреды для их воздействия на клеточные фенотипы в одном анализе. MEMAs готовятся в колодцах, что позволяет добавление отдельных лигандов отделять скважины, содержащие массивные внеклеточные матричные белки (ECM). Сочетание растворимого лиганда с каждым печатным ECM образует уникальное сочетание. Типичный анализ MEMA содержит более 2500 уникальных комбинаторных микросред, что клетки подвергаются в одном анализе. В качестве тестового случая, линия клеток рака молочной железы MCF7 была покрыта на платформе MEMA. Анализ этого анализа выявил факторы, которые как усиливают и препятствуют росту и распространению этих клеток. Платформа MEMA является очень гибкой и может быть расширена для использования с другими биологическими вопросами, помимо исследований рака.

Для упрощения воздействия микроenvironmentalов на рост и пролиферацию клеток и выявления условий, способствующих или препятствуя росту и пролиферации клеток, линия клеток рака молочной железы MCF7 была посеяна на комплекте из восьми 8-ну хорошо MEMAs, как описано в протоколе. Этот анализ подверга...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer at JoVE.com

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Цель метода, представленного здесь, состоит в том, чтобы показать, как микроокружение microarrays (MEMA) могут быть изготовлены и использованы для допроса воздействия тысяч простых комбинаторных микросред на фенотип культивированных клеток.

Использование Microarrays для допроса микроenvironmentale влияние на клеточные фенотипы при раке

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Изучение микрооквидения опухоли затруднено из-за ее сложности. Мы разработали микроокноронные микроармейки, состоящие из простых комбинаторных микроокнорониров, которые позволяют идентифицировать основные драйверы фенотипов опухолевых клеток. Основным преимуществом платформы MEMA является то, что, поскольку условия микроокноронности определены, просто определить факторы микроокноронности, которые управляют фенотипами, представляющими интерес.Платформа MEMA широко применяется в других неракомовых системах, включая первичные клеточные штаммы и стволовые клетки. Есть ряд инженерных трюков и шагов, которые мы разработали, чтобы ускорить мокрую работу скамейки и упростить протокол. Для начала используйте сенсорный принтер для печати внеклеточной смеси матричной печати в фидуциальных пятнах на пластины из восьми колодец.Используйте булавки диаметром 350 микрометров, расположенные в четырехразовой конфигурации печати для печати внеклеточной матрицы для микроармей микрохирургии. Блок коллагена печатается на MEMAs как сетка. Заполненные PBS скважины обеспечивают дополнительную влажность, чтобы предотвратить высыхание внеклеточной матрицы печати смеси источник пластины.Печать массивов в восьми-хорошо пластин, как 20 столбцов на 35 строк, в общей сложности 700 пятен. После печати храните тарелки в desiccator в течение как минимум трех дней до использования. Во-первых, разработать 96-хорошо пластины макет с интервалом, что позволяет использовать многоканандовые пипетки с четырьмя раскладными наконечниками, так что лечение многих пластин MEMA может быть сделано сразу.Затем извлекаем лиганды из морозильной камеры и оттаивают во льду в капюшоне из ламинарного потока. Кратко Флик и спина вниз каждой трубки. Используйте рекомендуемый буфер производителя, чтобы разбавить лиганды до 200-х рабочих запасов.Pipette 10 микролитров каждого 200-времени лиганд акций в соответствующий колодец в 96-хорошо пластины. Используйте герметивную пленку, чтобы запечатать пластины и хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Сделайте лигандовые лечебные пластины партиями и захватите все метаданные для анализа ниже по течению.Перед культивированием ячеек блокируйте MEMAs двумя миллилитров на колодец необлеваемого блокирующего буфера в течение 20 минут. Используйте Y-сплиттер с двумя трубами Pasteur, чтобы аспирировать блокирующий буфер в нескольких скважинах одновременно, а затем утроить промыть колодцы с помощью PBS. Чтобы предотвратить высыхание, оставьте окончательный объем PBS в колодцах до готовности к облицовыванию клеток.Перед полным экспериментом MEMA оптимизируйте концентрацию посева клеток MCF7, выполняя эксперимент по титрованиям клеток. Идеальное место, как показано здесь, имеет достаточное количество ячееок для извлечения данных, но не так много, что пятно слишком стечения. В MEMA, аспирировать оставшиеся PBS и семян MCF7 клетки на 30000 до 35000 клеток на колодец в двух миллилитров посева среды.Поместите MEMA в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. После адгезии на ночь в инкубаторе, аспирировать среды и заменить двумя миллилитров снижение среднего роста, чтобы изолировать стимулируемое воздействие конкретных лигандов. Затем оттаивать ранее замороженную лигандовую плиту на льду.Центрифуга размороженная пластина по 200 раз г в течение одной минуты. Передача 200 микролитров среды из каждого хорошо в MEMA культуры пластины в соответствующий колодец в лиганд лечения пластины. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать лиганд со средой, и передать эту смесь обратно в соответствующий колодец в MEMA культуры пластины.Слегка рок вручную и вернуть MEMA пластин в инкубатор для культуры лиганд-ECM сочетание при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. После 71 часов, добавить 100 раз EdU к скважинам MEMA для окончательной концентрации 10 микромолей. Инкубировать его еще один час при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе.После окончательной инкубации, аспирировать скважины. Исправить MEMAs в два миллилитров на колодец 2%PFA в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем аспирировать PFA из скважин.Permeabilize с двумя миллилитров на колодец 0,1%неионные сурфактант в течение 15 минут. Аспирировать сурфактант, а затем мыть скважины с двумя миллилитров PBS и PBS-T, последовательно. После этого добавьте к каждой колодец 1,5 миллилитров реагентов реакции EdU.Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, качая и защищены от света. Затем утолить реакцию с 1,5 миллилитров коммерческого буфера утоления на колодец. Аспирировать снова, и мыть с PBS-T до инкубации с оптимизированной концентрации пятен или антител.Инкубировать MEMA скважины с первичными антителами в окрашивание буфера, качания при четырех градусах по Цельсию в одночасье. После первичной инкубации антител, мыть колодцы с PBS следуют PBS-T. Добавьте вторичные антитела в 0,5 микрограмма на миллилитр DAPI, разбавленные буфером окрашивания.Инкубировать, качая в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Вымойте скважины два раза с двумя миллилитров на скважину PBS, и оставить их в последние два миллилитров PBS. Для изображения окрашенных MEMA, поместите его на стадии микроскопа автоматизированной системы визуализации с соответствующими флуоресцентными каналами обнаружения.Вывод полученных данных изображения в систему управления изображениями. Сегментные ячейки и рассчитать уровни интенсивности с помощью CellProfiler. В этом протоколе профили клеточного цикла связанных значений интенсивности DAPI по сравнению с ячейками из одной пластины из восьми хорошо указывают на клетки в фазе цикла G1 против G2.Это соответствует двум содержанием nDNA в клетках на ранней стадии роста, и четыре nDNA содержание в клетках вот-вот пройти митоз. Показано влияние микрооквидения лигандов и ЭКМ как на номер клетки, так и на включение ЭдУ. Красный цвет указывает на более высокое число ячеев, а синий – на меньшее число клеток.Многие из эффектов лиганд-управляемых, как условие ECM не сильно влияет на номер клетки или EdU положительность. Натаген 1 является явным исключением, так как наличие этой молекулы ECM подавляет связывание клеток и рост MCF7. Лиганды, такие как FGF6 и neuregulin-1 альфа увеличить количество клеток и имеют высокие показатели включения Эду, в то время как лиганды, такие как амфирегулин и неурегулин-1 SMDF подавляют связывание клеток и рост клеток.Пример клеток MCF7, растущих на месте MEMA, обработанном альфа-неурегулином-1, показывает высокие показатели включения ЭдУ, указанные розовыми ядрами. На этом изображении зеленое пятно - это клеточная маска, а синее - DAPI. Так как полный эксперимент MEMA стоит дорого, очень важно выполнить шаги оптимизации, такие как клеточные и сывороточной титрование, до выполнения полного эксперимента.После того, как микроокронные условия, представляющие интерес, идентифицируются с помощью платформы MEMA, специфические лиганды и внеклеточные матричные белки могут быть изучены более подробно с использованием традиционных систем 2D и 3D-культуры клеток.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Инъекции Произвести мышь Модели метастаз мозга

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

С помощью 22 c 3 антитела анти PD-L1 сосредоточиться на биопсию и цитологических мазков из больных раком легкого немелкоклеточного

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Упругое окрашивание на параффиновые слайды ткани рака желудка pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Характеризуй связанных с болезнями мутантов семейки RAF Kinases с помощью набора практических и осуществимых методов

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...