Name: measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Science Foundation CBET 1336544.
De FIJI, R en Python logo's worden gebruikt met het overeenkomstig de volgende handelsmerk-beleid: Python: <a href="https://www.python.org/psf/trademarks/">https://www.python.org/psf/trademarks/</a> R: <a href="https://www.r-project.org/logo/">https://www.r-project.org/Logo/</a> , volgens de CC-BY-SA 4.0 licentie vermeld op: <a href="https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/">https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/</a> Fiji: <a href="https://imagej.net/Licensing">https://imagej.net/Licensing</a>

1. het verzamelen van monsters voor analyse van het deeltje
<ol><li>Vastgesteld wat de omvang van de steekproef voor specifieke reactoren die voldoende deeltjes voor statistische analyse10 produceren zal (> 500) terwijl het vermijden van overlapping van de particle.<ol>
<li>Ga ervan uit dat een bereik van 0,5 tot 2 mL per monster van het mengsel bevatten voldoende voor actiefslibinstallatie monsters met een mengsel bevatten geschorst vaste stoffen (MLSS) tussen 250 en 5000 mg/L.</li>
		<li>Ander...

<ol>
	<li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granulation:+Advances+and+challenges.">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li><li>Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granular+sludge:+Recent+advances.">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li><li>Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162</a> (2004)</li><li>. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761</a> (2012)</li><li>Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observation+of+aerobic+granulation+in+sequential+aerobic+sludge+blanket+reactor.">Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor.</a> Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).</li><li>Kelly, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphical+Comparison+of+Image+Analysis+and+Laser+Diffraction+Particle+Size+Analysis+Data+Obtained+From+the+Measurements+of+Nonspherical+Particle+Systems.">Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems.</a> AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).</li><li>Walisko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Taming+of+the+Shrew+-Controlling+the+Morphology+of+Filamentous+Eukaryotic+and+Prokaryotic+Microorganisms.">The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).</li><li>Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Openstage:+A+Low-Cost+Motorized+Microscope+Stage+with+Sub-Micron+Positioning+Accuracy.">Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy.</a> PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).</li><li>Dias, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+identification+and+quantification+of+filamentous+bacteria+in+in+situ+acquired+images.">Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images.</a> BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).</li><li>Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Species-Specific+Filament+Levels+to+Filamentous+Bulking+in+Activated+Sludge.">Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).</li><li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+twisted+pixels:+ethical+guidelines+for+the+appropriate+use+and+manipulation+of+scientific+digital+images.">Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images.</a> Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tidy+Data.">Tidy Data.</a> Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).</li><li>van Rossum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Python tutorial. , (1995).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIJI:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis">https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</a> (2018)</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).</li><li>Sezgin, M., Sankur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+over+image+thresholding+techniques+and+quantitative+performance+evaluation.">Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation.</a> Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).</li><li>Kr&#246;ner, S., Dom&#233;nech Carb&#243;, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+pixel+resolution+for+shape+analysis:+Proposal+of+a+new+data+validation+method+for+computerized+images.">Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images.</a> Powder Technology. 245, 297-313 (2013).</li><li>McKinney, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Structures+for+Statistical+Computing+in+Python.">Data Structures for Statistical Computing in Python.</a> Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).</li><li>Waskom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).</li><li>. dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html">https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html</a> (2016)</li><li>Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Photography:+A+Primer+for+Pathologists.">Digital Photography: A Primer for Pathologists.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).</li><li>Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipeline+for+illumination+correction+of+images+for+high-throughput+microscopy.">Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy.</a> Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).</li><li>Eastwood, B. S., Childs, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Alignment+for+Multiple+Camera+High+Dynamic+Range+Microscopy.">Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy.</a> Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).</li><li>High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: <a target="_blank" href="https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/">https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/</a> (2009)</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks.">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li></ol>

Hoewel het systeem van de analyse van het beeld vrij robuust is en QC stappen worden genomen om ervoor te zorgen dat slechte afbeeldingen worden verwijderd, kan juiste aandacht op specifieke kwesties in bemonstering, plaat voorbereiding en beeldacquisitie verbeteren, zowel de juistheid van de gegevens en het percentage beelden passeren van QC.
Bemonstering concentratie Ervan uitgaande dat een representatieve steekproef is genomen, is de belangrijkste stap om ervoor te zorge...

Het doel van deze methode is bedoeld als een welomschreven, herhaalbare en gedeeltelijk geautomatiseerde methode voor het bepalen van de grootte en vorm distributies van deeltjes in de bioreactoren, met name die met actief slib Floc en aërobe korrels1 , 2. de grondgedachte achter deze methode waren om de betaalbaarheid, eenvoud, doorvoer, en herhaalbaarheid van onze bestaande interne protocollen,3,4, verlichten deeltje meting voor anderen, en vergemakkelijken delen en vergelijking van de gegevens.
Er zijn twee brede categorieën voor de analyse van de meting van de deeltjes - direct beeldvorming en inferentiële methoden met behulp van deze kwaliteiten als lichtverstrooiing5. Hoewel inferentiële methoden kunnen worden geautomatiseerd en grote doorvoer hebben, is de apparatuur duur. Bovendien, terwijl de inferentiële methoden kunnen nauwkeurig bepalen het equivalent grootte van een deeltje6, bieden ze geen gedetailleerde vorm informatie7.
Vanwege de noodzaak van shapegegevens, hebben wij onze methode gebaseerd op directe imaging. Hoewel sommige high-throughput beeldvormende methoden bestaan, moeten ze traditioneel dure commerciële hardware of oplossingen op maat gebouwde8,9. Onze methode is ontwikkeld om gemeenschappelijk, betaalbare hardware en software die, hoewel lijden aan een afname van de doorvoer, veel meer deeltjes beelden dan het minimum dat nodig is voor veel analyses10 produceerttewerk te stellen.
Bestaande protocollen kunnen niet geven belangrijk bemonsterings- en afbeelding overname stappen. Andere protocollen kunnen handmatige stappen die invoering van subjectieve bias (zoals ad hoc drempelmethode11) opgeven. Een duidelijk omschreven methode waarmee bemonstering, immobilisatie en afbeelding overname stappen gecombineerd met vrij beschikbare analysesoftware zal verbeteren zowel binnen-lab beeldanalyse en vergelijkingen tussen labs. Een belangrijk doel van dit protocol is bedoeld als een werkstroom en hulpmiddelen die tot reproduceerbare resultaten van verschillende labs voor hetzelfde monster leiden moeten.
Afgezien van het normaliseren van de installatiekopie van de analyse, worden de gegevens geproduceerd door deze pijpleiding vastgelegd in een welomschreven, goed geformatteerde bestand12 geschikt voor gebruik populaire data analyse pakketten13,14, versoepeling experiment specifieke analyses (zoals aangepaste figuur generatie) en faciliterende gegevensuitwisseling tussen labs.
Dit protocol wordt met name voorgesteld voor onderzoekers die vereisen deeltje shapegegevens, hebben geen toegang tot de inferentiële methoden, niet willen ontwikkelen hun eigen beeld analyse pijpleiding, en willen hun gegevens gemakkelijk delen met anderen

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Bleach solution</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>31009</td>
			<td>For workspace disinfection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube with cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>Per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4980-50</td>
			<td>Other vessels are suitable so long as they can contain &#62; 40 mL of sample and allow mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Kimax Bottle</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>14395-50</td>
			<td>Or otherwise sufficient for agar handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R or Python are suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis is not CPU intensive, any &#39;ordinary&#39; desktop computer circa 2017 should be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External hard drive</td>
			<td>Seagate</td>
			<td>STEB5000100</td>
			<td>Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.51d</td>
			<td>Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIT</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>version 2.19.1 or later</td>
			<td>Available at: https://git-scm.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>ToupView</td>
			<td>version 3.7.5177</td>
			<td>Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical (X/Y) Stage</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A512</td>
			<td>Not fully required, but greatly aids image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M291-100</td>
			<td>Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A35140U</td>
			<td>Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Stage Micrometer</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM1</td>
			<td>Or otherwise sufficient for spatial calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>1 per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard lab coat, gloves, and eyewear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparmoria macro</td>
			<td>NCSU</td>
			<td>version 0.2.1</td>
			<td>Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo/dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2T</td>
			<td>Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline

Experimentele bioreactoren, zoals deze behandelen afvalwater, bevatten deeltjes waarvan grootte en vorm belangrijke parameters zijn. Bijvoorbeeld, kunnen de grootte en vorm van actief slib Floc geven op welke voorwaarden op de microscale en ook rechtstreeks van invloed op hoe goed het slib vestigt zich in een clarifier.
Deeltjesgrootte en vorm zijn beide bedrieglijk 'eenvoudige' metingen. Vele subtiele problemen, vaak ongeadresseerde in informele protocollen, kunnen optreden wanneer bemonstering, imaging en analyseren van de deeltjes. Bemonsteringsmethoden een vertekend beeld kunnen geven of niet genoeg statistische stroomvoorziening. De monsters zelf slecht kunnen worden bewaard of wijziging tijdens immobilisatie ondergaan. Afbeeldingen kunnen niet worden van voldoende kwaliteit; overlappende deeltjes, kan scherptediepte, vergrotingsniveau, en diverse lawaai alle slechte resultaten opleveren. Slecht opgegeven analyse kan leiden tot vertekening, zoals die geproduceerd door handmatige afbeelding drempelmethode en segmentatie.
Betaalbaarheid en doorvoer zijn wenselijk naast reproduceerbaarheid. Een betaalbare, hoge doorvoer methode kunnen vaker meting van de deeltjes, produceren veel afbeeldingen met duizenden deeltjes. Een methode die gebruikmaakt van goedkope reagentia, een gemeenschappelijk ontleden Microscoop, en de software van de analyse van de vrij beschikbare open source kunt herhaalbare, toegankelijk, reproduceerbare en gedeeltelijk geautomatiseerde experimentele resultaten. Verder, het product van een dergelijke methode kunnen well-formatted, welomschreven en gemakkelijk te begrijpen door data-analysesoftware, versoepeling van zowel binnen-lab analyses en gegevens delen tussen labs.
We presenteren een protocol dat de gegevens van de stappen die nodig zijn voor de productie van dergelijk product, met inbegrip van: bemonstering, sample voorbereiding en immobilisatie in agar, digital image aquisition, digitale beeldanalyse en voorbeelden van experiment-specifieke figuur met behulp van de de resultaten van de analyse. We hebben ook een open-source data analyse pijpleiding ter ondersteuning van dit protocol opgenomen.

Bestanden die zijn gegenereerd Het proces geïllustreerd in Figuur 1 zal produceren twee bestanden per beeld geanalyseerd. Het eerste bestand is een door komma's gescheiden waarde (CSV) tekstbestand waarin elke rij komt overeen met een afzonderlijke deeltjes en de kolommen beschrijven verschillende deeltje statistieken zoals gebied, cirkelvormigheid en degelijkheid en omschreven in de handleiding van ImageJ17. Voorb...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

De grootte en de vorm van deeltjes in actiefslibinstallatie zijn belangrijke parameters die worden gemeten met behulp van verschillende methoden. Onjuistheden voortvloeien uit niet-representatieve bemonstering, suboptimaal afbeeldingen en subjectieve analyse gebruikte parameters. Om deze fouten te minimaliseren en verlichten van de meting, presenteren we een protocol waarin elke stap, met inbegrip van een pijpleiding van opensource software.

Meten van de vorm en grootte van actief slib deeltjes vervoertechnische Agar met een Open Source Software pijpleiding

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

De grootte en vorm van actieve slibdeeltjes is van cruciaal belang voor de efficiëntie van de afvalwaterbehandeling. Toch is hun meting vaak ad hoc. Dit protocol biedt een herhaalbare, goed gedefinieerde en semi-automatiseerbare meting voor hun meting.Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een grote populatie van deeltjes kan meten over een breed scala van morfologieën, terwijl het verminderen van subjectieve en systematische bias. Hoewel deze techniek is gericht op actief slib, kan technisch alles met dezelfde deeltjesmorfologie zoals microplastics met deze methode worden gemeten. Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, probeer het maken van een plaat tegelijk en de praktijk van de fysieke bewegingen van het maken van die ene plaat.Neem ook de tijd met de microscopie. De videoversie van dit artikel is belangrijk omdat bemonstering en plaatvoorbereiding veel kleine technieken vereisen die het best visueel kunnen worden gecommuniceerd. Ook het tonen en zien van goede foto's van platen zijn belangrijk om reproduceerbaarheid te garanderen.Het aantonen van dit protocol vandaag is Joseph Weaver, een promovendus in mijn lab. Om te beginnen, het verwerven van een representatief monster van een goed gemengd deel van de reactor. Meng het monster voorzichtig en giet het bepaalde monstervolume onmiddellijk in een 15 milliliter centrifugebuis.Voeg vervolgens vijf microliters van één procent methyleenblauw toe aan elk monster. Dop en meng het monster door de buis minstens drie keer voorzichtig om te keren. Laat de monsters ten minste vijf maar niet langer dan 30 minuten vlekken op kamertemperatuur.Zodra gekleurd, breng een voldoende volume van gesmolten 7,5 procent agar en gedeïmiseerd water naar de centrifuge buis om het totale buisvolume te brengen tot tussen de 6,5 en 9 milliliter. Dan recapituleren de centrifuge buizen en voorzichtig omkeren ze ten minste drie keer om het monster te mengen in de agar. Terwijl u de dop van zichzelf wegwijst, opent u de dop.Giet de buis inhoud van elke buis in hun eigen 100 milliliter plastic petrischaal terwijl zachtjes schommelen de schotel om een volledige, gladde coating en een visueel uniforme verdeling van de deeltjes te bereiken. Laat de platen minstens 5 minuten afkoelen op kamertemperatuur, totdat de agar stolt. Plaats de onbedekte plaat gezicht omhoog op de microscoop stadium van een stereo microscoop die in staat is 10 tot 20 keer vergroting.Verlicht het monster van onderaf met zelfs diffuus licht, met behulp van apparatuur zoals een LED-verlichtingsstandaard of lichtplaat. Open de software voor het vastleggen van afbeeldingen en zorg ervoor dat het lichtpad van de microscoop op foto is ingesteld. Selecteer vervolgens de juiste camera in de cameralijst.Pas de microscoop zo aan dat er meerdere deeltjes in het brandpuntsvlak verschijnen met grote, goed gedefinieerde randen. Gebruik een vergroting van 10 tot 20 keer om deeltjes te meten met behoud van een relatief diep brandpuntsvlak. Verwijder de agarplaat tijdelijk en plaats de micrometer op het podium.Pas de fijne focus aan totdat de graduaties op de micrometer scherp zijn gericht in de beeldopnamesoftware. En kalibreer de pixel naar micron verhouding. Stel vervolgens de zoom in op 100 procent door op de weergave te klikken en de werkelijke grootte te selecteren.Selecteer vervolgens opties en ga naar kalibreren. Richt hier de rode kalibratiebalk in de hoofdweergavehaven langs de lange as van de micrometer uit. Met de verticale balken gecentreerd op de nul en 200 micron graduaties.Voer in het kalibrerendialoogvak het huidige vergrotingsniveau en de werkelijke lengte van 200 micron in. Als u al bent gekalibreerd, selecteert u vergroting in de menubalk en selecteert u het huidige vergrotingsniveau om de kalibratie te bevestigen. Ga in het meetmenu naar de lijn en selecteer willekeurige regel.Klik op het snijpunt van de nul-graduatie en lange as van de micrometer. Klik dan opnieuw op de kruising op 200 micron lijn en de lange as. Een correcte kalibratie moet ongeveer 200 micron bedragen.Verwijder de regel door op de knop Object selecteren te klikken, op de lijn te klikken, op delete te drukken en op ja te drukken op het bevestigingsvak. Vervang vervolgens de agarplaat en pas de fijne scherpstelling aan om maximale details in de beeldsoftware te bereiken. Om dit te bereiken, eerst de bitdiepte van de maximale waarde toegestaan door het selecteren van de radioknop in de bit diepte paneel van de camera sidebar.Stel ook de software in om grijswaardenafbeeldingen te verkrijgen door de juiste keuzerondje te selecteren in het deelvenster kleurkwaliteit van de zijbalk van de camera. Nu, vouw alle open zijbalk panelen tussen de blootstelling en histogram. Verklein de winst tot één en verhoog de belichting totdat een duidelijk beeld in de viewport wordt weergegeven en totdat het histogram wordt weergegeven als een verdeling die niet wordt geknipt door een van beide kanten van het histogramvak.Pas het histogram aan om over en onder blootstelling te voorkomen. Schuif in het histogrampaneel van de zijbalk van de camera de linkergrens van het histogram naar net buiten de laagste waarden en de rechtergrens naar net buiten de hoogste waarden. Sla de afbeelding op als een niet-gecomprimeerd TIF-bestand.Voeg vergrotingsgegevens toe in de metagegevens van de afbeelding door het vak opslaan met kalibratiegegevens aan tevinken bij het opslaan. Selecteer een ander gebied dat de vorige afbeeldingen niet overlapt door een pad te volgen dat tussen links naar rechts en van rechts naar links wordt afgewisseld terwijl men de plaat naar beneden beweegt. Leg ten minste 500 visueel geschatte deeltjes vast voor analyse.Verwerf de deeltjesanalysecode door de GIT-opslagplaats te klonen. Haal bij de opdrachtregel de nieuwste versie van de code op door de hier getoonde opdracht in te typen. Installeer de analysecode volgens de instructies in het leesleestekstbestand in de map op het hoogste niveau van de gekloonde repository.Bewerk vervolgens een tekstbestand met de mappen die moeten worden verwerkt, samen met optionele parameters. Raadpleeg de voorbeelden en analyse subdirectory voor een lijst met parameters en voorbeelden. Voer nu de analyse uit op de opdrachtregel door de hier getoonde opdracht te typen.Fiji pad is de directory waarin imageJ-win64. exe is gevestigd. En paramsfile de locatie van het tekstbestand beschrijven van de analyse setup.De naam van de uitvoerbare kan verschillen afhankelijk van op welk besturingssysteem Fiji is geïnstalleerd. De analyse wordt automatisch uitgevoerd en duurt enkele minuten tot een paar uur, afhankelijk van de grootte en het aantal afbeeldingen. Controleer vervolgens de kwaliteitscontrolebestanden in de overlay-submap van de opgegeven uitvoermap.Let op afbeeldingen met valse mist of slecht gevangen deeltjes, allemaal zichtbaar als schaduwrijke contouren die niet overeenkomen met de achtergrond. Dat is het. De gegevens zijn nu klaar voor experiment specifieke analyse en figuur generatie.Hoewel geen enkele deeltjesdrempelmethode perfect is, is hier een voorbeeld van acceptabele resultaten. Bij het evalueren van QC-afbeeldingen zijn er drie veelvoorkomende fouten gevonden. Het niet nauwkeurig voldoen aan de deeltjesgrenzen, het niet identificeren van deeltjes en het opnemen van artefacten.Hier worden de deeltjesverdelingen tussen twee experimentele reactoren in de loop van de tijd weergegeven en gecombineerd met kwalitatieve metadata die door de onderzoeker worden opgemerkt. Deze grafiek toont aan dat in dit geval, de reactoren had over het algemeen vergelijkbare deeltjesgrootte distributies die de neiging naar een grotere gemiddelde en bredere verspreiding naarmate de tijd vorderde. Bij het uitvoeren van deze procedure is het van cruciaal belang om de plaat gelijkmatig te coaten met een dunne laag agar met gelijkmatig verdeelde deeltjes.Zorg ervoor dat u de praktijk en neem de tijd. Buiten deze procedure, interessante deeltjes kunnen worden verwijderd uit de agar en bestudeerd. In termen van gegevens, de resulterende bestanden uit dit protocol zijn goed gedefinieerd en de hemel is de limiet analytisch.Deze techniek effende de weg naar het verstrekken van nieuwe inzichten in aërobe korrelig slib. Het is morfologie is erg belangrijk en het stelde ons in staat om het te meten op een standaard manier. Afvalwater is biologisch actief.Bio veiligheid niveau men praktijken worden aangemoedigd. Ook, hoe agar kan bellen over wanneer magnetron en kan spuiten hete druppels bij het openen van de centrifuge buis.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Het meten van stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in planten met radioactieve tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Ontwikkeling van Sulfidogenic Slib van mariene sedimenten en Trichloorethyleen Vermindering van een Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: identificeren van individuen door hun voetsporen

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Extractie van structurele extracellulaire polymere stoffen van aërobe korrelslib

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

Een Ultra-Clean gelaagde apparaat voor het verzamelen van grootte gefractioneerde mariene Plankton en zwevende deeltjes

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Experimentele studie van de relatie tussen deeltjesgrootte en methaan Sorption capaciteit in leisteen

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Meten van de Hypopharyngeal de grootte van de Acinus van de klier in de honingbij (Apis mellifera) werknemers

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

Het combineren van Eye-tracking gegevens met een analyse van de video-inhoud van Free-viewing een video van een wandeling in een stedelijk park omgeving

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, een Low-cost Open-source Datalogger te schatten het watergehalte van Nonvascular cryptogamen

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...