Name: measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation CBET 1336544.
Les logos de Fidji, R et Python sont utilisés avec l’en conformité avec les politiques de marques suivantes : Python : <a href="https://www.python.org/psf/trademarks/">https://www.python.org/psf/trademarks/</a> R: <a href="https://www.r-project.org/logo/">https://www.r-project.org/Logo/</a> , conformément à la licence CC-BY-SA 4.0 répertoriée au : <a href="https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/">https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/</a> Fidji : <a href="https://imagej.net/Licensing">https://imagej.net/Licensing</a>

1. prélever des échantillons pour l’analyse des particules
<ol><li>Déterminer le volume de l’échantillon pour des réacteurs spécifiques permettant de produire des particules suffisantes pour l’analyse statistique10 (> 500) tout en évitant le chevauchement de la particule.<ol>
<li>Supposons qu’une gamme de 0.5 à 2 mL par échantillon de liqueur mixte est suffisante pour les échantillons de boues activées avec un solides de la liqueur mixte suspendu (MTSS) entre 250 et 5 000 mg/L...

<ol>
	<li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granulation:+Advances+and+challenges.">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li><li>Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granular+sludge:+Recent+advances.">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li><li>Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162</a> (2004)</li><li>. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761</a> (2012)</li><li>Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observation+of+aerobic+granulation+in+sequential+aerobic+sludge+blanket+reactor.">Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor.</a> Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).</li><li>Kelly, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphical+Comparison+of+Image+Analysis+and+Laser+Diffraction+Particle+Size+Analysis+Data+Obtained+From+the+Measurements+of+Nonspherical+Particle+Systems.">Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems.</a> AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).</li><li>Walisko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Taming+of+the+Shrew+-Controlling+the+Morphology+of+Filamentous+Eukaryotic+and+Prokaryotic+Microorganisms.">The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).</li><li>Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Openstage:+A+Low-Cost+Motorized+Microscope+Stage+with+Sub-Micron+Positioning+Accuracy.">Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy.</a> PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).</li><li>Dias, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+identification+and+quantification+of+filamentous+bacteria+in+in+situ+acquired+images.">Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images.</a> BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).</li><li>Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Species-Specific+Filament+Levels+to+Filamentous+Bulking+in+Activated+Sludge.">Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).</li><li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+twisted+pixels:+ethical+guidelines+for+the+appropriate+use+and+manipulation+of+scientific+digital+images.">Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images.</a> Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tidy+Data.">Tidy Data.</a> Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).</li><li>van Rossum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Python tutorial. , (1995).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIJI:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis">https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</a> (2018)</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).</li><li>Sezgin, M., Sankur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+over+image+thresholding+techniques+and+quantitative+performance+evaluation.">Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation.</a> Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).</li><li>Kr&#246;ner, S., Dom&#233;nech Carb&#243;, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+pixel+resolution+for+shape+analysis:+Proposal+of+a+new+data+validation+method+for+computerized+images.">Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images.</a> Powder Technology. 245, 297-313 (2013).</li><li>McKinney, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Structures+for+Statistical+Computing+in+Python.">Data Structures for Statistical Computing in Python.</a> Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).</li><li>Waskom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).</li><li>. dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html">https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html</a> (2016)</li><li>Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Photography:+A+Primer+for+Pathologists.">Digital Photography: A Primer for Pathologists.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).</li><li>Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipeline+for+illumination+correction+of+images+for+high-throughput+microscopy.">Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy.</a> Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).</li><li>Eastwood, B. S., Childs, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Alignment+for+Multiple+Camera+High+Dynamic+Range+Microscopy.">Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy.</a> Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).</li><li>High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: <a target="_blank" href="https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/">https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/</a> (2009)</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks.">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li></ol>

Bien que le système de l’analyse d’image est assez robuste et QC mesures sont prises pour s’assurer que les pauvres images sont supprimées, l’attention à des questions spécifiques à l’échantillonnage, la préparation de la plaque et acquisition d’images peut améliorer tant l’exactitude des données et la proportion de images en passant de QC.
Concentration d’échantillonnage En supposant qu’un échantillon représentatif a été pris, l’étape la ...

Le but de cette méthode est de fournir une méthode bien définie, reproductible et partiellement automatisée pour déterminer la taille et la forme des distributions de particules dans des bioréacteurs, particulièrement celles qui contiennent des flocons de boues activées et granules aérobie1 , 2. la raison d’être de cette méthode étaient d’améliorer l’accessibilité, de simplicité, de débit et répétabilité de nos protocoles internes existantes3,4, faciliter la mesure des particules pour les autres et de faciliter le partage et comparaison des données.
Il existe deux grandes catégories d’analyse de mesure des particules - méthodes déductives et direct d’imagerie utilisant des qualités telles que la diffusion de la lumière5. Bien que les méthodes déductives peuvent être automatisées et disposer d’un débit important, l’équipement est coûteux. En outre, alors que les méthodes déductives peuvent déterminer avec précision la taille équivalente d’une particule6, ils ne fournissent pas de forme détaillée d’informations7.
En raison de la nécessité pour les données de forme, nous avons fondé notre méthode sur imagerie directe. Alors que certaines méthodes d’imagerie haut débit existent, ils ont traditionnellement requis matériel commercial coûteux ou des solutions sur mesure construit8,9. Notre méthode a été développée pour utiliser une commune et abordable matérielle et logicielle qui, bien que souffrant d’une réduction de débit, produit des images de particules beaucoup plus que le minimum nécessaire pour nombreuses analyses10.
Les protocoles actuels ne peuvent pas spécifier d’échantillonnage important et image acquisition étapes. Autres protocoles peuvent spécifier des étapes manuelles qui biaisent subjectifs (par exemple ad hoc seuillage11). Une méthode bien définie qui spécifie les étapes d’acquisition d’échantillonnage, immobilisation et image associés au logiciel d’analyse disponible gratuitement améliorera les analyse dans le laboratoire d’images et des comparaisons entre les laboratoires. Des principaux objectifs du présent protocole sont de fournir un flux de travail et des outils qui devraient aboutir à des résultats reproductibles de laboratoires différents pour le même échantillon.
En dehors de la normaliser le processus d’analyse de l’image, les données produites par ce pipeline sont enregistrées dans un fichier bien définis, bien formatée12 approprié pour l’usage de données populaires analyse paquets13,14, expérience d’accélération des analyses spécifiques (par exemple de génération personnalisée de la figure) et facilite partage des données entre laboratoires.
Ce protocole est proposé en particulier pour les chercheurs qui ont besoin de données de forme de particules, n’ont pas accès aux méthodes déductives, ne souhaitent pas développer leur propre pipeline de l’analyse d’image et souhaitent partager leurs données facilement avec d’autres

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Bleach solution</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>31009</td>
			<td>For workspace disinfection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube with cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>Per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4980-50</td>
			<td>Other vessels are suitable so long as they can contain &#62; 40 mL of sample and allow mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Kimax Bottle</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>14395-50</td>
			<td>Or otherwise sufficient for agar handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R or Python are suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis is not CPU intensive, any &#39;ordinary&#39; desktop computer circa 2017 should be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External hard drive</td>
			<td>Seagate</td>
			<td>STEB5000100</td>
			<td>Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.51d</td>
			<td>Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIT</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>version 2.19.1 or later</td>
			<td>Available at: https://git-scm.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>ToupView</td>
			<td>version 3.7.5177</td>
			<td>Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical (X/Y) Stage</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A512</td>
			<td>Not fully required, but greatly aids image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M291-100</td>
			<td>Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A35140U</td>
			<td>Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Stage Micrometer</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM1</td>
			<td>Or otherwise sufficient for spatial calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>1 per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard lab coat, gloves, and eyewear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparmoria macro</td>
			<td>NCSU</td>
			<td>version 0.2.1</td>
			<td>Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo/dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2T</td>
			<td>Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline

Bioréacteurs expérimentaux, tels que ceux traitant des eaux usées, contiennent des particules dont la taille et forme sont des paramètres importants. Par exemple, la taille et la forme des flocs de boues activées peuvent indiquer les conditions à la micro-échelle et affectent également directement comment bien la boue s’installe dans un clarificateur.
Forme et la taille des particules sont les deux mesures de façon trompeuse « simples ». Nombreuses questions subtiles, souvent non adressées dans les protocoles de l’informels, peuvent survenir lors de l’échantillonnage, imagerie et l’analyse des particules. Méthodes d’échantillonnage pourraient être biaisées ou ne fournissent pas assez de puissance statistique. Les exemples eux-mêmes peuvent être mal conservés ou subir une altération au cours de l’immobilisation. Images peuvent ne pas être d’une qualité suffisante ; chevauchement des particules, profondeur de champ, grossissement et divers bruits peut tous fruits et légumes des résultats médiocres. Analyse mal spécifié peut introduire un biais, tel que celui produit par segmentation et seuillage d’image manuel.
Abordabilité et le débit sont souhaitables aux côtés de reproductibilité. Une méthode abordable, haut débit peut permettent de mesurer les particules plus fréquente, produisant beaucoup d’images contenant des milliers de particules. Une méthode qui utilise des réactifs peu coûteux, un microscope à dissection commun et logiciel d’analyse de source ouverte librement disponible permet reproductibles, accessibles, reproductibles et partiellement automatisée des résultats expérimentaux. En outre, le produit d’une telle méthode peut être correctement mise en forme, bien définies et facilement comprise par le logiciel d’analyse de données, les analyses de laboratoire au sein et partage des données entre laboratoires d’accélération.
Nous présentons un protocole qui détaille les étapes nécessaires pour produire un tel produit, y compris : prélèvement, préparation des échantillons et immobilisation dans la gélose, acquisition d’images numériques, analyse d’image numérique et des exemples de génération de la figure de l’expérience spécifique de la résultats de l’analyse. Nous avons également inclus un pipeline d’analyse de données open source pour prendre en charge ce protocole.

Fichiers générés Le processus illustré dans la Figure 1 produira deux fichiers par image analysée. Le premier fichier est une virgule séparées fichier CSV (valeurs) texte où chaque ligne correspond à une particule individuelle et les colonnes décrivent diverses métriques de particules telles que zone circularité et solidité et définies dans le manuel de ImageJ17. Exemples de fichiers CSV sont inclus co...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

La taille et la forme des particules dans les boues activées sont des paramètres importants qui sont mesurés à l’aide de différentes méthodes. Imprécisions proviennent d’échantillonnage non représentatif, images sous-optimal et paramètres de l’analyse subjective. Pour minimiser ces erreurs et faciliter la mesure, nous présentons un protocole spécifiant toutes les étapes, y compris un pipeline de logiciels open source.

Mesurer la forme et la taille des particules de boues activées immobilisées dans la gélose avec un Pipeline de logiciels Open Source

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

La taille et la forme des particules de boue activées sont essentielles à l’efficacité du traitement des eaux usées. Pourtant, leur mesure est souvent ponctuelle. Ce protocole fournit une mesure reproductible, bien définie et semi-automatisable pour leur mesure.Le principal avantage de ce protocole est qu’il peut mesurer une grande population de particules sur un large éventail de morphologies tout en réduisant les biais subjectifs et systématiques. Bien que cette technique soit axée sur les boues activées, techniquement tout ce qui a la même morphologie de particules comme les microplastiques peut être mesuré avec cette méthode. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, essayez de faire une plaque à la fois et de pratiquer les mouvements physiques de la fabrication de cette seule plaque.Aussi, prenez votre temps avec la microscopie. La version vidéo de cet article est importante parce que l’échantillonnage et la préparation des plaques nécessitent beaucoup de petites techniques qui sont mieux communiquées visuellement. En outre, montrer et voir de bonnes images des plaques sont importants pour assurer la reproductibilité.Joseph Weaver, candidat au doctorat dans mon laboratoire, démontre ce protocole aujourd’hui. Pour commencer, obtenir un échantillon représentatif d’une partie bien mélangée du réacteur. Mélanger délicatement l’échantillon, puis verser immédiatement le volume déterminé de l’échantillon dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Ajouter ensuite cinq microlitres d’un pour cent de bleu méthylène à chaque échantillon. Capuchon et mélanger l’échantillon en inversant doucement le tube au moins trois fois. Laisser les échantillons tacher pendant au moins cinq, mais pas plus de 30 minutes à température ambiante.Une fois taché, transférer un volume suffisant d’agar fondu de 7,5 pour cent et d’eau déionisée dans le tube de centrifugeuse afin d’amener le volume total du tube entre 6,5 et 9 millilitres. Puis récapituler les tubes de centrifugeuse et les inverser doucement au moins trois fois pour mélanger l’échantillon dans l’agar. Tout en pointant le bouchon loin de soi, ouvrez le bouchon.Verser le contenu du tube de chaque tube dans leur propre boîte de Pétri en plastique de 100 millilitres tout en berçant doucement le plat pour obtenir un revêtement complet et lisse et une distribution visuellement uniforme des particules. Laisser refroidir les assiettes à température ambiante pendant au moins 5 minutes, jusqu’à ce que l’agar se solidifie. Placez la plaque découverte face vers le haut sur le stade de microscope d’un microscope stéréo qui est capable de 10 à 20 fois grossissement.Illuminez l’échantillon d’en bas avec même une lumière diffuse, à l’aide d’équipements tels qu’un support d’éclairage LED ou une plaque lumineuse. Ouvrez le logiciel de capture d’image et assurez-vous que la trajectoire de lumière du microscope est réglée sur la photo. Ensuite, sélectionnez l’appareil photo approprié à partir de la liste des caméras.Ajustez le microscope de sorte que plusieurs particules apparaissent dans le plan focal avec de grands bords bien définis. Utilisez un grossissement de 10 à 20 fois pour mesurer les particules tout en maintenant un plan focal relativement profond. Retirez temporairement la plaque d’agar et placez le micromètre sur la scène.Réglez la mise au point fine jusqu’à ce que les graduations sur le micromètre semblent fortement ciblées dans le logiciel de capture d’image. Et calibrer le rapport pixel/micron. Ensuite, réglez le zoom à 100 pour cent en cliquant sur afficher et en sélectionnant la taille réelle.Ensuite, sélectionnez les options et allez calibrer. Ici, alignez la barre d’étalonnage rouge dans le viewport principal le long du long axe du micromètre. Avec les barres verticales centrées sur le zéro et 200 microns graduations.Dans la boîte de dialogue calibré, entrez le niveau actuel de grossissement et la longueur réelle de 200 microns. S’il est déjà calibré, sélectionnez le grossissement de la barre de menu, puis sélectionnez le niveau de grossissement actuel pour confirmer l’étalonnage. Dans le menu des mesures, allez en ligne et sélectionnez la ligne arbitraire.Cliquez sur l’intersection du zéro graduation et du long axe du micromètre. Puis cliquez à nouveau sur l’intersection à la ligne de 200 microns et le long axe. Un étalonnage correct doit s’afficher sous forme d’environ 200 microns.Supprimez la ligne en cliquant sur le bouton objet sélectionné, en cliquant sur la ligne, en appuyant sur supprimer, et en appuyant oui sur la boîte de confirmation. Ensuite, remplacez la plaque d’agar et ajustez la mise au point fine pour obtenir un maximum de détails dans le logiciel d’imagerie. Pour ce faire, augmentez d’abord la profondeur du bit de la valeur maximale autorisée en sélectionnant le bouton radio dans le panneau de profondeur de bit de la barre latérale de la caméra.En outre, réglez le logiciel pour acquérir des images à échelle grise en sélectionnant le bouton radio approprié dans le panneau de qualité couleur de la barre latérale de la caméra. Maintenant, l’effondrement de tous les panneaux latéraux ouverts entre l’exposition et l’histogramme. Réduisez le gain à un et augmentez l’exposition jusqu’à ce qu’une image claire apparaisse dans le viewport et jusqu’à ce que l’histogramme apparaisse comme une distribution qui n’est pas coupée à chaque extrémité de la boîte d’histogramme.Ajustez l’histogramme pour éviter une exposition répétée et sous-exposition. Dans le panneau histogramme de la barre latérale de la caméra, faites glisser la limite gauche de l’histogramme juste à l’extérieur des valeurs les plus basses et de la limite droite à juste à l’extérieur des valeurs les plus élevées. Enregistrez l’image sous la forme d’un fichier TIF non compressé.Incluez des informations de grossissement dans les métadonnées d’image en cochant l’enregistrement avec la boîte d’information d’étalonnage lors de l’enregistrement. Sélectionnez une autre zone qui ne chevauche pas les images précédentes en suivant un chemin qui alterne entre de gauche à droite et de droite à gauche lorsque l’on descend la plaque. Capturez au moins 500 particules visuellement estimées pour analyse.Obtenez le code d’analyse des particules en clonage du référentiel GIT. À la ligne de commande, récupérez la dernière version du code en tapant la commande indiquée ici. Installez le code d’analyse en suivant les instructions dans le fichier texte lisez-moi trouvé dans le répertoire de haut niveau du référentiel cloné.Ensuite, modifiez un fichier texte énumérant les répertoires à traiter avec des paramètres optionnels. Consultez les exemples et la sous-direction d’analyse pour une liste de paramètres et d’exemples. Maintenant, exécutez l’analyse sur la ligne de commande en tapant la commande indiquée ici.Fidji chemin est le répertoire dans lequel imageJ-win64. exe est situé. Et paramsfile l’emplacement du fichier texte décrivant la configuration de l’analyse.Le nom de l’exécuteur testamentaire peut différer selon le système d’exploitation sur lequel Fidji est installé. L’analyse s’exécutera automatiquement et prendra de quelques minutes à quelques heures selon la taille et le nombre d’images. Ensuite, examinez les fichiers de contrôle de la qualité situés dans la sous-direction de superposition de l’annuaire de sortie spécifié.Notez les images avec une brume fallacieuse ou des particules mal capturées, toutes apparentes comme des contours ombragés qui ne correspondaient pas à l’arrière-plan. Voilà. Les données sont maintenant prêtes pour l’analyse spécifique de l’expérience et la génération de chiffres.Bien qu’aucune méthode de seuil de particules ne soit parfaite, voici un exemple de résultats acceptables. Lors de l’évaluation des images QC, il ya trois erreurs courantes trouvées. Défaut de se conformer avec précision aux limites des particules, incapacité d’identifier les particules et inclusion d’artefacts.Ici, les distributions de particules entre deux réacteurs expérimentaux au fil du temps sont affichées et combinées avec des métadonnées qualitatives notées par le chercheur. Ce graphique montre que dans ce cas, les réacteurs avaient généralement des distributions de taille de particules similaires qui tendaient vers une diffusion moyenne et plus large plus grande au fur et à mesure que le temps progressait. Lors de l’exécution de cette procédure, il est essentiel d’enduire uniformément la plaque d’une fine couche d’agar contenant des particules uniformément réparties.Assurez-vous de vous entraîner et de prendre votre temps. Au-delà de cette procédure, des particules intéressantes pourraient être excisées de l’agar et étudiées. En termes de données, les fichiers résultant de ce protocole sont bien définis et le ciel est la limite analytiquement.Cette technique a ouvert la voie à de nouvelles perspectives sur les boues granulaires aérobies. Sa morphologie est très importante et elle nous a permis de la mesurer de manière standard. Les eaux usées sont biologiquement actives.Les pratiques de niveau 1 en matière de biosécurité sont encouragées. En outre, comment l’agar peut bouillonner au-dessus quand micro-ondes et peut pulvériser des gouttelettes chaudes en ouvrant le tube de centrifugeuse.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Mesurer les flux d&#39;éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Recherche

Environnement

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Développement de sulfurogènes boues de sédiments marins et la réduction de trichloroéthylène dans une couverture Réacteur à refoulement de boue anaérobie

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Mesurer les taux de métabolisme dans l&#39;herbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: l&#39;identification des personnes par leurs empreintes

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Extraction des substances Structural extracellulaires polymériques de Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

Un appareil ultra propre multicouche pour la collecte de plancton marin taille fractionné et particules en suspension

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Etude expérimentale de la relation entre la taille des particules et capacité de Sorption de méthane en schiste

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Mesure taille de Acinus glandes hypopharyngiennes chez les travailleurs de l’abeille à miel (Apis mellifera)

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

Combiner les données de suivi des yeux avec une analyse du contenu vidéo à partir de Free-visualisation d’une vidéo d’une promenade dans un environnement de parc urbain

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, un enregistreur de données Open source Low-cost pour estimer la teneur en eau des cryptogames vasculaires

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...