Name: measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00
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1. sammeln Sie Proben für die Partikelanalyse
<ol><li>Bestimmen die Probenmenge für bestimmte Reaktoren, die genügend Partikel für statistische Analysen10 produzieren (> 500) Partikel Überschneidungen zu vermeiden.<ol>
<li>Davon ausgehen Sie, dass eine Reihe von 0,5 bis 2 mL pro Probe des gemischten Schnaps ausreichend für Belebtschlamm Proben mit einer gemischten Alkohol ausgesetzt Feststoffe (MLSS) zwischen 250 und 5.000 mg/L.</li>
		<li>Ansonsten bereiten Sie drei Test-Agarplatten mit 0...

<ol>
	<li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granulation:+Advances+and+challenges.">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li><li>Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granular+sludge:+Recent+advances.">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li><li>Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162</a> (2004)</li><li>. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761</a> (2012)</li><li>Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observation+of+aerobic+granulation+in+sequential+aerobic+sludge+blanket+reactor.">Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor.</a> Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).</li><li>Kelly, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphical+Comparison+of+Image+Analysis+and+Laser+Diffraction+Particle+Size+Analysis+Data+Obtained+From+the+Measurements+of+Nonspherical+Particle+Systems.">Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems.</a> AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).</li><li>Walisko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Taming+of+the+Shrew+-Controlling+the+Morphology+of+Filamentous+Eukaryotic+and+Prokaryotic+Microorganisms.">The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).</li><li>Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Openstage:+A+Low-Cost+Motorized+Microscope+Stage+with+Sub-Micron+Positioning+Accuracy.">Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy.</a> PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).</li><li>Dias, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+identification+and+quantification+of+filamentous+bacteria+in+in+situ+acquired+images.">Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images.</a> BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).</li><li>Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Species-Specific+Filament+Levels+to+Filamentous+Bulking+in+Activated+Sludge.">Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).</li><li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+twisted+pixels:+ethical+guidelines+for+the+appropriate+use+and+manipulation+of+scientific+digital+images.">Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images.</a> Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tidy+Data.">Tidy Data.</a> Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).</li><li>van Rossum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Python tutorial. , (1995).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIJI:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis">https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</a> (2018)</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).</li><li>Sezgin, M., Sankur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+over+image+thresholding+techniques+and+quantitative+performance+evaluation.">Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation.</a> Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).</li><li>Kr&#246;ner, S., Dom&#233;nech Carb&#243;, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+pixel+resolution+for+shape+analysis:+Proposal+of+a+new+data+validation+method+for+computerized+images.">Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images.</a> Powder Technology. 245, 297-313 (2013).</li><li>McKinney, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Structures+for+Statistical+Computing+in+Python.">Data Structures for Statistical Computing in Python.</a> Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).</li><li>Waskom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).</li><li>. dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html">https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html</a> (2016)</li><li>Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Photography:+A+Primer+for+Pathologists.">Digital Photography: A Primer for Pathologists.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).</li><li>Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipeline+for+illumination+correction+of+images+for+high-throughput+microscopy.">Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy.</a> Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).</li><li>Eastwood, B. S., Childs, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Alignment+for+Multiple+Camera+High+Dynamic+Range+Microscopy.">Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy.</a> Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).</li><li>High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: <a target="_blank" href="https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/">https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/</a> (2009)</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks.">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li></ol>

Obwohl die Bild-Analyse-System ziemlich robust ist und QC Schritte unternommen, um sicherzustellen, dass schlechte Bilder entfernt sind, kann angemessene Aufmerksamkeit auf konkrete Fragestellungen in der Probenahme, Platte Vorbereitung und Bildaufnahme sowohl die Richtigkeit der Daten und der Anteil der verbessern Bilder vorbei QC.
Probenahme-Konzentration Vorausgesetzt, dass eine repräsentative Probe entnommen worden, ist der wichtigste Schritt um sicherzustellen, dass g...

Der Zweck dieser Methode ist, eine klar definierte, reproduzierbare und teilweise automatisiert Verfahren zur Bestimmung der Größe und Form-Distributionen von Partikeln in Bioreaktoren, besonders diejenigen mit Belebtschlamm Flocken und aerobe Granulat1 , 2. waren die Beweggründe für diese Methode zur Verbesserung der Erschwinglichkeit, Einfachheit, Durchsatz und Wiederholbarkeit unserer bestehenden internen Protokollen3,4, Partikel-Messung für andere zu erleichtern und Austausch erleichtern und Vergleich der Daten.
Es gibt zwei große Kategorien von Messung Partikelanalyse - direct imaging und schlussfolgernde Methoden mit solchen Qualitäten als Lichtstreuung5. Obwohl folgernd Methoden automatisiert werden können und großen Durchsatz haben, ist die Ausrüstung teuer. Darüber hinaus während folgernd Methoden der gleicher Größe eines Teilchens6genau bestimmen können, bieten sie keine detaillierte Form Informationen7.
Wegen der Notwendigkeit der Shape-Daten haben wir unsere Methode auf direkte Bildgebung basiert. Während einige Hochdurchsatz-bildgebenden Verfahren vorhanden sind, müssen sie traditionell entweder teure kommerzielle Hardware oder Sonderlösungen gebauten8,9. Unsere Methode wurde entwickelt, um gemeinsame, kostengünstige Hardware und Software, die zwar eine Reduzierung des Durchsatzes, leiden weit mehr Partikelbilder als das Minimum für viele Analysen10benötigt produziert zu beschäftigen.
Bestehende Protokolle können keinen wichtigen Probenahme und Bild Erwerb Schritte angeben. Andere Protokolle können manuelle Schritte angeben, die subjektive Voreingenommenheit (z. B. ad-hoc-Schwellwerte11) einzuführen. Eine klar definierte Methode, die Probenahme, Immobilisierung und Bild Erwerb Schritte kombiniert mit frei verfügbaren Analysesoftware angibt wird im Labor Bildanalyse und Vergleiche zwischen den Labors verbessern. Ein wesentliches Ziel dieses Protokolls ist, einen Workflow und Tools, die aus verschiedenen Labors für die gleiche Probe zu reproduzierbaren Ergebnissen führen sollten.
Neben der Normalisierung des Analyseprozesses Bild, werden die Daten durch diese Pipeline produziert in einem klar definierten, gut formatierte Datei12 geeignet für den Einsatz von beliebten Daten Analyse Pakete13,14, Lockerung Experiment aufgezeichnet. spezifische Analysen (z. B. benutzerdefinierte Zahl Generation) und erleichtern den Datenaustausch zwischen Labors.
Dieses Protokoll wird vor allem für Forscher vorgeschlagen, die Partikel-Shape-Daten benötigen, haben keinen Zugang zu schlussfolgernde Methoden, wollen nicht ihre eigenen Bild-Analyse-Pipeline zu entwickeln, und ihre Daten einfach mit anderen teilen möchten

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Bleach solution</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>31009</td>
			<td>For workspace disinfection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube with cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>Per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4980-50</td>
			<td>Other vessels are suitable so long as they can contain &#62; 40 mL of sample and allow mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Kimax Bottle</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>14395-50</td>
			<td>Or otherwise sufficient for agar handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R or Python are suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis is not CPU intensive, any &#39;ordinary&#39; desktop computer circa 2017 should be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External hard drive</td>
			<td>Seagate</td>
			<td>STEB5000100</td>
			<td>Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.51d</td>
			<td>Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIT</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>version 2.19.1 or later</td>
			<td>Available at: https://git-scm.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>ToupView</td>
			<td>version 3.7.5177</td>
			<td>Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical (X/Y) Stage</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A512</td>
			<td>Not fully required, but greatly aids image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M291-100</td>
			<td>Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A35140U</td>
			<td>Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Stage Micrometer</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM1</td>
			<td>Or otherwise sufficient for spatial calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>1 per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard lab coat, gloves, and eyewear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparmoria macro</td>
			<td>NCSU</td>
			<td>version 0.2.1</td>
			<td>Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo/dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2T</td>
			<td>Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline

Experimentelle Bioreaktoren, wie z. B. die Behandlung von Abwasser enthalten Partikel, deren Größe und Form wichtige Parameter sind. Beispielsweise können die Größe und Form des Belebtschlammes Flocken geben die Bedingungen an den Microscale und auch direkt beeinflussen, wie gut der Schlamm in einem Nachklärbecken absetzt.
Partikelgröße und-Form sind beide fälschlich "einfachen" Messungen. Viele subtile Probleme, oft unadressierte in informelle Protokolle können entstehen, wenn Probenahme, Bildgebung und Partikel zu analysieren. Probenahmeverfahren voreingenommen sein können oder nicht genügend statistische Strom liefern. Die Proben selbst können nur schlecht erhalten oder Veränderung während der Ruhigstellung zu unterziehen. Bilder möglicherweise nicht von ausreichender Qualität sind; überlappende Partikel, produzieren Schärfentiefe, Vergrößerungsstufe, und verschiedene Geräusche alle schlechte Ergebnisse. Schlecht spezifizierten Analyse kann Vorurteile, wie durch die manuelle Bild Schwellwerte und Segmentierung einführen.
Erschwinglichkeit und Durchsatz sind neben Reproduzierbarkeit wünschenswert. Eine erschwingliche, hoher Durchsatz-Methode können häufigere Partikel Messung, viele Bilder, die mit Tausenden von Partikel produzieren. Eine Methode, die preiswerte Reagenzien, eine gemeinsame sezierenden Mikroskop und frei verfügbaren open-Source-Analyse-Software ermöglicht wiederholbare, zugänglich, reproduzierbare und teilweise automatisiert Versuchsergebnisse. Darüber hinaus kann das Produkt einer solchen Methode gut formatierte, klar definierte und Datenanalyse-Software, Lockerung in Laboranalysen und Datenaustausch zwischen den Labors leicht verständlich sein.
Präsentieren wir eine Protokoll, das beschreibt die notwendigen Schritte um solch ein Produkt herzustellen, einschließlich: probieren, probieren, Vorbereitung und Immobilisierung in Agar, digitale Bildaufnahme, digitale Bildanalyse und Beispiele der Experiment-spezifische Abbildung Generation aus der die Ergebnisse der Analyse. Wir haben auch eine Open-Source-Daten-Analyse-Pipeline für dieses Protokoll aufgenommen.

Generierte Dateien Die in Abbildung 1 dargestellten Prozess erzeugt zwei Dateien pro Bild analysiert. Die erste Datei ist ein Komma getrennt Wert (CSV) Text-Datei, wo jede Zeile entspricht einer einzelnen Teilchen und die Spalten zu beschreiben verschiedene Partikel Metriken wie Fläche, Rundheit und Solidität, und ImageJ manuelle17definiert. Beispiel-CSV-Dateien sind als ergänzende Informationen und Beispiele/Dat...

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Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

Die Größe und Form der Partikel im Belebtschlamm sind wichtige Parameter, die mit unterschiedlichen Methoden gemessen werden. Ungenauigkeiten ergeben sich aus nicht-repräsentative Probenahme, suboptimalen Bildern und subjektive Analyseparameter. Um diesen Fehler zu minimieren und Messung zu erleichtern, präsentieren wir ein Protokoll angeben, jeden Schritt, einschließlich einer open-Source-Software-Pipeline.

Messung von Form und Größe der Belebtschlamm Partikel unbeweglich in Agar mit einer Open-Source-Software-Pipeline

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

Die Größe und Form von Belebtschlammpartikeln ist entscheidend für die Abwasserbehandlung. Dennoch ist ihre Messung oft ad hoc. Dieses Protokoll bietet eine wiederholbare, gut definierte und halbautomatisierbare Messgröße für ihre Messung.Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine große Population von Teilchen über eine Vielzahl von Morphologien messen und gleichzeitig subjektive und systematische Verzerrungen reduzieren kann. Während sich diese Technik auf Belebtschlamm konzentriert, kann technisch alles, was die gleiche Partikelmorphologie wie Mikroplastik hat, mit dieser Methode gemessen werden. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, versuchen Sie, eine Platte nach der anderen zu machen und üben Sie die physikalischen Bewegungen der Herstellung dieser einen Platte.Nehmen Sie sich auch Zeit mit der Mikroskopie. Die Videoversion dieses Artikels ist wichtig, da Sampling und Plattenvorbereitung viele kleine Techniken erfordern, die am besten visuell kommuniziert werden. Auch das Zeigen und Sehen von guten Bildern von Platten ist wichtig, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.Dieses Protokoll demonstriert heute Joseph Weaver, ein Doktorand in meinem Labor. Zunächst sollten Sie eine repräsentative Probe aus einem gut gemischten Teil des Reaktors erwerben. Mischen Sie die Probe vorsichtig und gießen Sie dann sofort das ermittelte Probenvolumen in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr.Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter von einem Prozent Methylenblau zu jeder Probe hinzu. Kappen und mischen Sie die Probe, indem Sie das Rohr mindestens dreimal sanft umkehren. Lassen Sie die Proben mindestens fünf, aber nicht mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur färben.Nach der Färbung ein ausreichendes Volumen von geschmolzenem 7,5 Prozent Agar und deionisiertem Wasser in das Zentrifugenrohr übertragen, um das Gesamtrohrvolumen auf 6,5 bis 9 Milliliter zu bringen. Dann die Zentrifugenrohre rekapitulieren und mindestens dreimal sanft umkehren, um die Probe in den Agar zu mischen. Während Sie die Kappe von sich selbst wegzeigen, öffnen Sie die Kappe.Gießen Sie den Rohrinhalt jedes Rohres in ihre eigene 100 Milliliter Kunststoff-Petrischale, während Sie die Schale sanft schaukeln, um eine vollständige, glatte Beschichtung und eine optisch gleichmäßige Verteilung der Partikel zu erreichen. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur mindestens 5 Minuten abkühlen, bis sich der Agar erstarrt. Platzieren Sie die unbedeckte Platte nach oben auf der Mikroskopstufe eines Stereomikroskops, das eine 10- bis 20-fache Vergrößerung ermöglicht.Beleuchten Sie die Probe von unten mit gleichmäßigem Licht, mit Geräten wie einem LED-Beleuchtungsständer oder einer Lichtplatte. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware, und stellen Sie sicher, dass der Lichtpfad des Mikroskops auf Foto eingestellt ist. Wählen Sie dann die entsprechende Kamera aus der Kameraliste aus.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass mehrere Partikel in der Brennebene mit großen, gut definierten Kanten erscheinen. Verwenden Sie eine Vergrößerung von 10 bis 20 Mal, um Partikel zu messen, während eine relativ tiefe Brennebene beibehalten wird. Entfernen Sie vorübergehend die Agarplatte und legen Sie das Mikrometer auf die Bühne.Passen Sie den Feinfokus an, bis die Graduierungen auf dem Mikrometer in der Bildaufnahmesoftware scharf fokussiert erscheinen. Und kalibrieren Sie das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer. Legen Sie als Nächstes den Zoom auf 100 Prozent fest, indem Sie auf die Ansicht klicken und die tatsächliche Größe auswählen.Wählen Sie dann Optionen aus und gehen Sie zu kalibrieren. Richten Sie hier den roten Kalibrierbalken im Hauptansichtsfenster entlang der langen Achse des Mikrometers aus. Mit den vertikalen Balken zentriert auf die Null und 200 Mikron Graduierungen.Geben Sie im Dialogfeld Kalibrieren den aktuellen Vergrößerungsgrad und die tatsächliche Länge von 200 Mikrometern ein. Wenn bereits kalibriert, wählen Sie die Vergrößerung aus der Menüleiste und dann den aktuellen Vergrößerungsgrad aus, um die Kalibrierung zu bestätigen. Gehen Sie im Menü "Messungen" zur Zeile und wählen Sie eine beliebige Zeile aus.Klicken Sie auf den Schnittpunkt der Nullgradierung und der langen Achse des Mikrometers. Klicken Sie dann erneut auf den Schnittpunkt an der 200-Mikron-Linie und die lange Achse. Eine korrekte Kalibrierung sollte als ca. 200 Mikrometer angezeigt werden.Löschen Sie die Zeile, indem Sie auf die Schaltfläche Objekt auswählen klicken, auf die Zeile klicken, löschen und im Bestätigungsfeld "Ja" drücken. Als nächstes ersetzen Sie die Agarplatte und passen Sie den feinfeinen Fokus an, um maximale Details in der Bildverarbeitungssoftware zu erreichen. Um dies zu erreichen, erhöhen Sie zunächst die Bittiefe des maximal zulässigen Wertes, indem Sie das Optionsfeld im Bittiefenbedienfeld der Kamera-Seitenleiste auswählen.Stellen Sie außerdem die Software so ein, dass Graustufenbilder erfasst werden, indem Sie den entsprechenden Optionsfeld im Farbstufenbedienfeld der Kamera-Seitenleiste auswählen. Reduzieren Sie nun alle offenen Seitenleistenplatten zwischen Belichtung und Histogramm. Reduzieren Sie die Verstärkung auf eins, und erhöhen Sie die Belichtung, bis ein klares Bild im Ansichtsfenster angezeigt wird und bis das Histogramm als Verteilung angezeigt wird, die von keinem der beiden Enden des Histogrammfelds abgeschnitten wird.Passen Sie das Histogramm an, um eine Über- und Unterbelichtung zu vermeiden. Schieben Sie im Histogrammbedienfeld der Kamera-Seitenleiste die linke Begrenzung des Histogramms auf knapp außerhalb der niedrigsten Werte und die rechte Grenze auf etwas außerhalb der höchsten Werte. Speichern Sie das Bild als unkomprimierte TIF-Datei.Fügen Sie Vergrößerungsinformationen in die Bildmetadaten ein, indem Sie beim Speichern das Kontrollkästchen Speichern mit Kalibrierungsinformationen überprüfen. Wählen Sie einen anderen Bereich aus, der die vorherigen Bilder nicht überlappt, indem Sie einem Pfad folgen, der zwischen von links nach rechts und von rechts nach links wechselt, wenn man die Platte hinunterbewegt. Erfassen Sie mindestens 500 visuell geschätzte Partikel für die Analyse.Erfassen Sie den Partikelanalysecode, indem Sie das GIT-Repository klonen. Rufen Sie in der Befehlszeile die neueste Version des Codes ab, indem Sie den hier gezeigten Befehl eingeben. Installieren Sie den Analysecode gemäß den Anweisungen in der Textdatei Read me, die sich im Verzeichnis der obersten Ebene des geklonten Repositorys befindet.Bearbeiten Sie anschließend eine Textdatei, in der die zu verarbeitenden Verzeichnisse zusammen mit optionalen Parametern aufgeführt sind. Eine Liste von Parametern und Beispielen finden Sie im Unterverzeichnis Beispiele und Analysen. Führen Sie nun die Analyse in der Befehlszeile aus, indem Sie den hier gezeigten Befehl eingeben.Fidschi-Pfad ist das Verzeichnis, in dem imageJ-win64. exe befindet sich. Und paramsfile den Speicherort der Textdatei, die die Analyse-Setup beschreibt.Der Name der ausführbaren Datei kann je nachdem, auf welchem Betriebssystem Fidschi installiert ist, unterschiedlich sein. Die Analyse wird automatisch ausgeführt und dauert je nach Größe und Anzahl der Bilder einige Minuten bis ein paar Stunden. Überprüfen Sie anschließend die Qualitätskontrolldateien im Unterverzeichnis Overlay des angegebenen Ausgabeverzeichnisses.Beachten Sie Bilder mit falschem Nebel oder schlecht gefangenen Teilchen, die alle als schattierte Umrisse sichtbar sind, die nicht mit dem Hintergrund übereinstimmten. Das wars. Die Daten sind nun für die experimentierte Analyse und Die Generierung von Figuren bereit.Obwohl keine Methode zur Partikelschwellenbildung perfekt ist, ist hier ein Beispiel für akzeptable Ergebnisse. Beim Auswerten von QC-Bildern werden drei häufige Fehler gefunden. Nichtkorrekte Übereinstimmung mit den Partikelgrenzen, fehlende Identifizierung von Partikeln und Einbeziehung von Artefakten.Hier werden die Partikelverteilungen zwischen zwei Versuchsreaktoren im Laufe der Zeit angezeigt und mit qualitativen Metadaten kombiniert, die der Forscher notiert. Dieses Schaubild zeigt, daß die Reaktoren in diesem Fall im Allgemeinen ähnliche Partikelgrößenverteilungen aufwiesen, die im Laufe der Zeit zu einem größeren Mittelwert und einer breiteren Streuung tendierten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Platte gleichmäßig mit einer dünnen Agarschicht zu beschichten, die gleichmäßig verteilte Partikel enthält.Achten Sie darauf, zu üben und nehmen Sie sich Zeit. Über dieses Verfahren hinaus könnten interessante Partikel aus dem Agar entfernt und untersucht werden. In Bezug auf die Daten sind die resultierenden Dateien aus diesem Protokoll gut definiert und der Himmel ist die Grenze analytisch.Diese Technik ebnete den Weg für neue Einblicke in aeroben Körnungsschlamm. Seine Morphologie ist sehr wichtig und es erlaubte uns, sie in einer Standard-Art und Weise zu messen. Abwasser ist biologisch aktiv.Biosicherheitsstufe eins wird gefördert. Auch, wie Agar überblasen kann, wenn Mikrowelle und heiße Tröpfchen beim Öffnen der Zentrifugenröhre sprühen kann.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Mess Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffe in Pflanzen, die mit radioaktiver Tracer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Forschung

Umwelt

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Entwicklung sulfidogenen Schlamm aus marinen Sedimenten und Trichlorethylen Reduction in einer Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Messraten von Herbizid Metabolism in DICOT Weeds mit einem herausgeschnittenen Blatt Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spek Cheetahs: Identifizierung von Personen durch ihre Spuren

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Die Extraktion von Strukturextrazellulären polymeren Substanzen aus Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

Eine Ultra-clean Multilayer Vorrichtung zum Sammeln von Größe fraktioniert Meeresplankton und Schwebeteilchen

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Experimentelle Studie über den Zusammenhang zwischen Korngröße und Methan Sorption Kapazität in Schiefer

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Messung der Schlunddrüsen Drüse Acinus Größe in Honigbiene (Apis Mellifera) Arbeitnehmer

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

Die Kombination von Eye-Tracking-Daten mit einer Analyse von Video-Inhalten aus dem Free-Viewing eines Videos von einem Walk in einer urbanen Park-Umgebung

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, eine kostengünstige Open-Source Datenlogger, den Wassergehalt des Nonvascular Kryptogamen zu schätzen

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...