Name: measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של 1336544 CBET קרן המדע הלאומית.
הלוגוס פיג'י, R ופייתון משמשים עם בהתאם המדיניות סימן ההיכר הבאים: פיתון: <a href="https://www.python.org/psf/trademarks/">https://www.python.org/psf/trademarks/</a> R: <a href="https://www.r-project.org/logo/">https://www.r-project.org/Logo/</a> , לפי רישיון CC-BY-SA 4.0 המפורטים ב: <a href="https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/">https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/</a> פיג ' י: <a href="https://imagej.net/Licensing">https://imagej.net/Licensing</a>

1. לאסוף דגימות לניתוח חלקיקים
<ol><li>לקבוע את אמצעי האחסון מדגם עבור כורים ספציפיים אשר יפיקו חלקיקים מספיק עבור ניתוח סטטיסטי10 (> 500) תוך הימנעות חפיפה של חלקיקים.<ol>
<li>נניח כי בטווח של 0.5 עד 2 מ לכל דגימה של משקאות מעורבים מספיקה עבור דגימות בוצה מופעל עם מוצקים משקאות מעורבים מו...

<ol>
	<li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granulation:+Advances+and+challenges.">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li><li>Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granular+sludge:+Recent+advances.">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li><li>Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162</a> (2004)</li><li>. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761</a> (2012)</li><li>Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observation+of+aerobic+granulation+in+sequential+aerobic+sludge+blanket+reactor.">Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor.</a> Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).</li><li>Kelly, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphical+Comparison+of+Image+Analysis+and+Laser+Diffraction+Particle+Size+Analysis+Data+Obtained+From+the+Measurements+of+Nonspherical+Particle+Systems.">Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems.</a> AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).</li><li>Walisko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Taming+of+the+Shrew+-Controlling+the+Morphology+of+Filamentous+Eukaryotic+and+Prokaryotic+Microorganisms.">The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).</li><li>Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Openstage:+A+Low-Cost+Motorized+Microscope+Stage+with+Sub-Micron+Positioning+Accuracy.">Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy.</a> PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).</li><li>Dias, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+identification+and+quantification+of+filamentous+bacteria+in+in+situ+acquired+images.">Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images.</a> BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).</li><li>Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Species-Specific+Filament+Levels+to+Filamentous+Bulking+in+Activated+Sludge.">Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).</li><li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+twisted+pixels:+ethical+guidelines+for+the+appropriate+use+and+manipulation+of+scientific+digital+images.">Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images.</a> Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tidy+Data.">Tidy Data.</a> Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).</li><li>van Rossum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Python tutorial. , (1995).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIJI:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis">https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</a> (2018)</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).</li><li>Sezgin, M., Sankur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+over+image+thresholding+techniques+and+quantitative+performance+evaluation.">Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation.</a> Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).</li><li>Kr&#246;ner, S., Dom&#233;nech Carb&#243;, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+pixel+resolution+for+shape+analysis:+Proposal+of+a+new+data+validation+method+for+computerized+images.">Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images.</a> Powder Technology. 245, 297-313 (2013).</li><li>McKinney, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Structures+for+Statistical+Computing+in+Python.">Data Structures for Statistical Computing in Python.</a> Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).</li><li>Waskom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).</li><li>. dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html">https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html</a> (2016)</li><li>Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Photography:+A+Primer+for+Pathologists.">Digital Photography: A Primer for Pathologists.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).</li><li>Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipeline+for+illumination+correction+of+images+for+high-throughput+microscopy.">Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy.</a> Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).</li><li>Eastwood, B. S., Childs, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Alignment+for+Multiple+Camera+High+Dynamic+Range+Microscopy.">Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy.</a> Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).</li><li>High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: <a target="_blank" href="https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/">https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/</a> (2009)</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks.">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li></ol>

למרות מערכת ניתוח התמונה היא די חסונים, QC הפעולות הננקטות כדי להבטיח תמונות המסכן יוסרו, תשומת לב המתאים הנושאים הספציפיים דגימה, הכנת צלחת, ייבוא תמונות יכול לשפר גם את הדיוק של הנתונים וגם היחס תמונות עובר QC.
ריכוז דגימה בהנחה שנלקח מדגם מייצג, הוא הצעד החשוב ביו...

מטרת שיטה זו היא כדי לספק שיטה מוגדרים היטב, הדיר ו חלקית-ממוחשב לקביעת הפצות הגודל והצורה של חלקיקים בתוך ריאקטורים, במיוחד אלה המכילים flocs בוצה מופעל ואת בגרגרים אירובי1 , 2. הרציונל מאחורי שיטה זו היו כדי לשפר את מקלחון, פשטות, תפוקה, הדיר שלנו קיימים פרוטוקולים ללא צורך במיקור חוץ3,4, להקל על מדידת חלקיקים אחרים, וכדי להקל על שיתוף ועל השוואה של נתונים.
ישנן שתי קטגוריות כלליות של חלקיקים מדידה ניתוח - ישיר הדמיה הסקתית ושיטות באמצעות תכונות כאלה כמו פיזור אור5. למרות שיטות הסקתית יכול להיות אוטומטי ויש תפוקה גדולה, הציוד יקר. בנוסף, בעוד שיטות הסקתית ניתן לקבוע במדויק הגודל המקביל של חלקיקים6, הם אינם מספקים מידע מפורט צורה7.
בשל הצורך נתוני צורה, לנו בסיס השיטה שלנו על הדמיה ישירה. בעוד כמה שיטות הדמיה של תפוקה גבוהה קיימים, הם נדרשים באופן מסורתי חומרה מסחרי יקר או פתרונות מותאמים אישית הבנויה8,9. השיטה שלנו פותחה להעסיק משותף, במחירים סבירים חומרה ותוכנה זה, למרות סובל לירידה בתפוקה, מייצרת תמונות חלקיקים הרבה יותר מהמינימום הדרוש עבור ניתוחים רבים10.
קיימים פרוטוקולים עשויה לציין לא הדגימה חשוב והשלבים רכישת התמונה. פרוטוקולים אחרים עשויה לציין שלבים ידניים זה גורם להטיה סובייקטיביות (כגון קביעת סף אד הוק11). שיטה מוגדר היטב כי קביעת שלבי רכישת דגימה, קיבעון ותמונה בשילוב עם ניתוח זמינה בחופשיות תוכנה יהיה לשפר ניתוח תמונה בתוך-מעבדה וגם השוואות בין מעבדות. יעד מרכזי של פרוטוקול זה נועד לספק זרימת עבודה וכלים צריך להוביל לתוצאות לשחזור של מעבדות שונות באותה דגימת זרע.
מלבד נרמול תהליך ניתוח התמונה, הנתונים המיוצר על ידי צינור זה נרשם גם עם קובץ מוגדר היטב, מעוצבת היטב12 מתאים לשימוש על-ידי הנתונים הפופולריים ניתוח חבילות13,14, הקלות ניסוי ניתוחים ספציפיים (כגון יצירת דמות אישית) ונתונים והקלה על שיתוף בין מעבדות.
פרוטוקול זה במיוחד הוא הציע לחוקרים אשר דורשים נתוני צורה של חלקיקים, אין גישה לשיטות הסקתית, לא הייתי רוצה לפתח צינור ניתוח התמונה שלהם, ורוצים לשתף בקלות את הנתונים שלהם עם משתמשים אחרים

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Bleach solution</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>31009</td>
			<td>For workspace disinfection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube with cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>Per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4980-50</td>
			<td>Other vessels are suitable so long as they can contain &#62; 40 mL of sample and allow mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Kimax Bottle</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>14395-50</td>
			<td>Or otherwise sufficient for agar handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R or Python are suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis is not CPU intensive, any &#39;ordinary&#39; desktop computer circa 2017 should be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External hard drive</td>
			<td>Seagate</td>
			<td>STEB5000100</td>
			<td>Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.51d</td>
			<td>Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIT</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>version 2.19.1 or later</td>
			<td>Available at: https://git-scm.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>ToupView</td>
			<td>version 3.7.5177</td>
			<td>Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical (X/Y) Stage</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A512</td>
			<td>Not fully required, but greatly aids image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M291-100</td>
			<td>Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A35140U</td>
			<td>Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Stage Micrometer</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM1</td>
			<td>Or otherwise sufficient for spatial calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>1 per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard lab coat, gloves, and eyewear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparmoria macro</td>
			<td>NCSU</td>
			<td>version 0.2.1</td>
			<td>Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo/dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2T</td>
			<td>Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline

ריאקטורים ניסיוני, כגון אלה לטיפול בשפכים, מכילים חלקיקים בגודל ובצורה של מי הם פרמטרים חשובים. לדוגמה, הגודל והצורה של בוצה מופעל flocs ניתן לציין את התנאים-microscale, משפיעים גם ישירות על מה טוב כל הטינופת בסבלך clarifier של '.
גודל החלקיקים צורה שתי מדידות בניגוד לשמו 'פשוט' בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. רבים בנושאים עדינים, לעיתים קרובות ללא התיחסות בפרוטוקולים פורמלי, יכול להיווצר כאשר הדגימה, הדמיה, ניתוח חלקיקים. שיטות דגימה עשויים להיות מוטים או אינם מספקים מספיק חשמל סטטיסטי. הדגימות עצמם ייתכן יישמרו לקוי או לעבור שינוי במהלך הנייח. תמונות אינה בהכרח באיכות טובה דיה; חופפים חלקיקים, עומק שדה, רמת הגדלה ו רעש שונים יכול כל לייצר תוצאות המסכן. ניתוח לקוי שצוין ניתן להטיה, כגון כי המיוצר על-ידי קביעת סף תמונה ידנית פילוח.
כל אחד מהחדרים מכיל ותפוקת הם רצויים לצד הפארמצבטית. שיטת תפוקה גבוהה, במחיר סביר יכול לאפשר מדידה חלקיקים בתדירות גבוהה יותר, הפקת תמונות רבות המכיל אלפי חלקיקים. שיטה המשתמשת ריאגנטים זולה, מיקרוסקופ ויבתר נפוצות וכן תוכנת ניתוח זמינה בחופשיות קוד פתוח מאפשר תוצאות ניסויית הדיר, נגיש, הדירים חלקית-ממוחשב. עוד, התוצר של השיטה יכולה להיות מעוצבת היטב, מוגדרים היטב, להבין בקלות על ידי תוכנת ניתוח נתונים, הקלות במרחק המעבדה ניתוחים והן שיתוף בין מעבדות נתונים.
אנו מציגים פרוטוקול לפירוט השלבים הדרושים כדי לייצר מוצר שכזה, לרבות: דגימה, לטעום הנייח אגר, ייבוא תמונות דיגיטליות, ניתוח תמונות דיגיטליות ו דוגמאות של דור איור ניסוי ספציפי מן והכנה תוצאות ניתוח. כללנו גם את צינור ניתוח נתונים פתוח כדי לתמוך בפרוטוקול זה.

קבצים שנוצרו התהליך מאויר באיור 1 יהיה לייצר שני קבצים לכל תמונה מנותח. הקובץ הראשון הוא פסיק מופרדים בקובץ הטקסט ערך (CSV) שבו כל שורה מקבילה לאפשרות חלקיקים בודדים ולתאר העמודות מדדים שונים של חלקיקים כגון אזור, מעגליות אחידות הגדרה ידנית ImageJ<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

הגודל והצורה של חלקיקים ב בוצה מופעל הם פרמטרים חשובים זה נמדדים באמצעות שיטות שונות. אי דיוקים נובעים דגימה בלתי מייצג, שיוצרת תמונות ופרמטרים ניתוח סובייקטיבית. כדי למזער שגיאות אלה להקל על המדידה, אנו מציגים פרוטוקול ציון בכל שלב, כולל צינור תוכנה של קוד פתוח.

מדידת לצורה ולגודל החלקיקים בוצה מופעל מרותק למיטה בטיפול אגר עם צינור תוכנה קוד פתוח

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

הגודל והצורה של חלקיקי בוצה פעילים חיוניים ליעילות הטיפול בשפכים. עם זאת, המדידה שלהם היא לעתים קרובות אד הוק. פרוטוקול זה מספק מידה חוזרת, מוגדרת היטב וניתן לאוטומטי למחצה למדידה שלהם.היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא יכול למדוד אוכלוסייה גדולה של חלקיקים על פני מגוון רחב של morphologies תוך הפחתת הטיה סובייקטיבית ושיטתית. בעוד טכניקה זו מתמקדת בוצה פעילה, מבחינה טכנית כל דבר שיש לו את אותה מורפולוגיה חלקיקים כגון מיקרופלסטיק ניתן למדוד בשיטה זו. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, נסה לעשות צלחת אחת בכל פעם ולתרגל את התנועות הפיזיות של ביצוע צלחת אחת.כמו כן, קח את הזמן שלך עם מיקרוסקופיה. גרסת הווידאו של מאמר זה חשובה מכיוון שדגימה והכנת לוח דורשים הרבה טכניקות קטנות המתקשרות בצורה הטובה ביותר מבחינה ויזואלית. כמו כן, הצגה וצפייה בתמונות טובות של צלחות חשובות כדי להבטיח שכפול.מדגים פרוטוקול זה היום הוא ג'וזף וויבר, מועמד לדוקטורט במעבדה שלי. כדי להתחיל, לרכוש מדגם מייצג מחלק מעורב היטב של הכור. מערבבים בעדינות את הדגימה ומיד יוצקים את נפח הדגימה הנחוש לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.לאחר מכן להוסיף חמישה microliters של אחוז אחד מתילן כחול לכל מדגם. מכסים ומערבבים את הדגימה על ידי היפוך עדין של הצינור לפחות שלוש פעמים. אפשר את הדגימות להכתים לפחות חמש אבל לא יותר מ 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מוכתם, להעביר נפח מספיק של אגר נמס 7.5 אחוז ומים deionized לצינור צנטריפוגה על מנת להביא את נפח הצינור הכולל בין 6.5 ל 9 מיליליטר. ואז לסכם את צינורות צנטריפוגה בעדינות להפוך אותם לפחות שלוש פעמים כדי לערבב את המדגם לתוך אגר. תוך כדי הצבעה על הכובע הרחק מעצמך, פתח את המכסה.יוצקים את תכולת הצינור של כל צינור לתוך צלחת פטרי פלסטיק 100 מיליליטר משלהם תוך נדנדה בעדינות את המנה כדי להשיג ציפוי מלא, חלקה התפלגות אחידה ויזואלית של חלקיקים. אפשר את הצלחות להתקרר בטמפרטורת החדר לפחות 5 דקות, עד אגר מתגבש. מניחים את הלוח שנחשף עם הפנים כלפי מעלה על שלב המיקרוסקופ של מיקרוסקופ סטריאו המסוגל להגדיל פי 10 עד 20.האם להאיר את המדגם מלמטה עם אור מפוזר אפילו, באמצעות ציוד כגון מעמד תאורת LED או צלחת אור. פתח את תוכנת לכידת התמונה וודא שניתיב אור המיקרוסקופ מוגדר לתמונה. לאחר מכן, בחר את המצלמה המתאימה מרשימת המצלמות.התאימו את המיקרוסקופ כך שחלקיקים מרובים יופיעו במישור המוקד עם קצוות גדולים ומוגדרים היטב. השתמש בהגדלה של 10 עד 20 פעמים כדי למדוד חלקיקים תוך שמירה על מישור מוקד עמוק יחסית. מוציאים זמנית את צלחת הגר ומ מניחים את המיקרומטר על הבמה.התאם את המוקד עד שסיום הלימודים במיקרומטר יופיע ממוקד בחדות בתוכנת לכידת התמונה. וכיול הפיקסל ליחס מיקרון. לאחר מכן, הגדר את גודל התצוגה ל- 100 אחוז על-ידי לחיצה על תצוגה ובחירת גודל ממשי.לאחר מכן בחר אפשרויות ולך לכייל. כאן, יישר את סרגל הכיול האדום בחלונית הראשית לאורך הציר הארוך של המיקרומטר. כשהפסים האנכיים מרוכזים באפס ו-200 מיקרון.בתיבת הדו-שיח כיול, הזן את רמת ההגדלה הנוכחית ואת האורך בפועל של 200 מיקרון. אם כבר כיול, בחר הגדלה מפס התפריטים ולאחר מכן בחר את רמת ההגדלה הנוכחית כדי לאשר את הכיול. בתפריט המידות, עבור לקו ובחר קו שרירותי.לחץ על ההצטלבות של סיום האפס והציר הארוך של המיקרומטר. לאחר מכן לחץ שוב על הצומת ב 200 מיקרון קו ואת הציר הארוך. כיול נכון אמור להיות מוצג כ- 200 מיקרון.מחק את השורה על-ידי לחיצה על לחצן בחר אובייקט, לחיצה על הקו, לחיצה על מחק ולחיצה על כן בתיבת האישור. לאחר מכן, החלף את צלחת אגר ולהתאים את המיקוד בסדר כדי להשיג פירוט מרבי בתוכנת ההדמיה. כדי לבצע זאת, הגדל תחילה את עומק הסיביות של הערך המרבי המותר על-ידי בחירת לחצן ה- Radio בלוח עומק הסיביות של סרגל הצד של המצלמה.כמו כן, הגדר את התוכנה לרכישת תמונות בגווני אפור על-ידי בחירת לחצן הפתגמים המתאים בחלונית 'דרגת צבע' של סרגל הצד של המצלמה. עכשיו, לכווץ כל לוחות סרגל צדדי פתוחים בין חשיפה והיסטוגרמה. הקטן את הרווח לאחד והגדל את החשיפה עד שתמונה ברורה תופיע ב- viewport ועד שההיסטוגרמה תופיע כהתפלגות שאינה מקוטעת באף אחד מקצות תיבת ההיסטוגרמה.התאימו את ההיסטוגרמה כדי להימנע מחשיפה חוזרת ותחת חשיפה. בחלונית היסטוגרמה של סרגל הצד של המצלמה, החלק את הגבול השמאלי של ההיסטוגרמה אל מחוץ לערכים הנמוכים ביותר ואת הגבול הימני אל מחוץ לערכים הגבוהים ביותר. שמור את התמונה כקובץ TIF לא דחוס.כלול מידע הגדלה במטה-נתונים של התמונה על-ידי סימון התיבה שמור עם מידע כיול בעת השמירה. בחר אזור אחר שאינו חופף לתמונות הקודמות על-ידי מעקב אחר נתיב המתחלף בין שמאל לימין לשמאל בעת הזזה במורד הלוח. ללכוד לפחות 500 חלקיקים מוערך חזותית לניתוח.רכוש את קוד ניתוח החלקיק על-ידי שיבוט מאגר GIT. בשורת הפקודה, אחזר את הגירסה העדכנית ביותר של הקוד על-ידי הקלדת הפקודה המוצגת כאן. התקן את קוד הניתוח בהתאם להוראות בקובץ הטקסט read me שנמצא בספריה ברמה העליונה של המאגר המשוכפל.לאחר מכן, ערוך קובץ טקסט המפרט את הספריות שיש לעבד יחד עם פרמטרים אופציונליים. עיין בדוגמאות ובדירטוריית המשנה של הניתוח לקבלת רשימה של פרמטרים ודוגמאות. כעת, הפעל את הניתוח בשורת הפקודה על-ידי הקלדת הפקודה המוצגת כאן.נתיב פיג'י הוא הספריה שבה תמונהJ-win64. exe ממוקם. ו paramsfile המיקום של קובץ הטקסט המתאר את הגדרת הניתוח.שם קובץ ההפעלה עשוי להשתנות בהתאם למערכת ההפעלה שבה מותקן פיג'י. הניתוח יפעל באופן אוטומטי ויקח כמה דקות עד כמה שעות בהתאם לגודל ולמספר התמונות. לאחר מכן, בדוק את קבצי בקרת האיכות הממוקמים בספריית המשנה שכבת-על של ספריית הפלט שצוינה.שימו לב לתמונות עם ערפל מזויף או חלקיקים שנתפסו בצורה גרועה, כולם ניכרים כקווי מתאר מוצללים שלא התאים לרקע. זה הכל. הנתונים מוכנים כעת לניתוח ספציפי לניסויים ולדור איורים.למרות שאין שיטת סף חלקיקים מושלמת, הנה דוגמה לתוצאות מקובלות. בעת הערכת תמונות QC, נמצאו שלוש שגיאות נפוצות. כישלון להתאים במדויק את גבולות החלקיקים, כישלון בזיהוי חלקיקים והכללת חפץ.כאן מוצגות חלוקות החלקיק בין שני כורים ניסיוניים לאורך זמן, בשילוב עם מטה-נתונים איכותיים שצוינו על ידי החוקר. תרשים זה מראה כי במקרה זה, הכורים היו בדרך כלל חלוקות גודל חלקיקים דומות אשר נטו לכיוון ממוצע גדול יותר התפשטות רחבה ככל שהזמן התקדם. בעת ביצוע הליך זה, חיוני לציפוי שווה של הצלחת בשכבה דקה של אגר המכילה חלקיקים המחולקים באופן אחיד.הקפד להתאמן ולקחת את הזמן שלך. מעבר להליך זה, חלקיקים מעניינים יכולים להיחתך מהגר וללמוד אותם. במונחים של נתונים, הקבצים הנובעים מפרוטוקול זה מוגדרים היטב והשמיים הם הגבול באופן אנליטי.טכניקה זו סללה את הדרך לספק תובנות חדשות על בוצה גרגירית אירובית. זה מורפולוגיה היא מאוד חשובה וזה איפשר לנו למדוד את זה בצורה סטנדרטית. שפכים פעילים ביולוגית.אנו מעודדים נוהלי רמת בטיחות ביו אחת. כמו כן, איך אגר יכול לבעבע כאשר במיקרוגל והוא יכול לרסס טיפות חמות בעת פתיחת צינור צנטריפוגה.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

פיתוח של Sulfidogenic בוצה מים משקעים וטריכלוריטן הפחתה בכור שמיכת Upflow אנאירובית בוצה

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

מדידת מחירים של קוטל העשבים מטבוליזם בעשבי Dicot עם Assay נכרת עלה

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

בחינת ברדלסים: אנשי זיהוי על ידי עקביהם

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

הפקת חומרים פולימריים המבני התאי מ אירובי גרגירי בוצה

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

מנגנון רב שכבתי אולטרה נקי של איסוף פלנקטון ימית גודל Fractionated וחלקיקים מושעה

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

ניסויי חקר הקשר בין גודל החלקיקים מתאן וספיחה מתוקף פצלי

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

מדידת Hypopharyngeal בלוטת Acinus בגודל דבורת הדבש (בומבוס) עובדים

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

שילוב נתוני מעקב אחר עיניים באמצעות ניתוח של תוכן וידאו מחינם-צפייה בסרטון וידאו של טיול בסביבה של פארק עירוני

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, אוגר נתונים קוד פתוח בעלות נמוכה כדי להעריך את תכולת המים Nonvascular Cryptogams

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...