Name: measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline
Uploaded: 2019-01-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una subvención de la nacional Science Foundation CBET 1336544.
Los logotipos de FIJI, R y Python se utilizan con el de acuerdo con las siguientes políticas de marca registrada: Python: <a href="https://www.python.org/psf/trademarks/">https://www.python.org/psf/trademarks/</a> R: <a href="https://www.r-project.org/logo/">https://www.r-project.org/Logo/</a> , según la licencia CC-BY-SA 4.0 en: <a href="https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/">https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/</a> Fiji: <a href="https://imagej.net/Licensing">https://imagej.net/Licensing</a>

1. recolectar muestras para análisis de partículas
<ol><li>Determinar el volumen de muestra para reactores específicos que se producen suficientes partículas para análisis estadístico10 (> 500) evitando superposición de partículas.<ol>
<li>Asumir que una gama de 0.5 a 2 mL por muestra de licor mezcla es suficiente para las muestras de lodos activados con una sólidos suspendido de licor mezcla (MLSS) entre 250 y 5.000 mg/L.</li>
		<li>De lo contrario, preparar tres placas de agar de ensa...

<ol>
	<li>Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granulation:+Advances+and+challenges.">Aerobic granulation: Advances and challenges.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).</li><li>Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granular+sludge:+Recent+advances.">Aerobic granular sludge: Recent advances.</a> Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).</li><li>Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162</a> (2004)</li><li>. Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: <a target="_blank" href="https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761">https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761</a> (2012)</li><li>Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+observation+of+aerobic+granulation+in+sequential+aerobic+sludge+blanket+reactor.">Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor.</a> Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).</li><li>Kelly, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphical+Comparison+of+Image+Analysis+and+Laser+Diffraction+Particle+Size+Analysis+Data+Obtained+From+the+Measurements+of+Nonspherical+Particle+Systems.">Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems.</a> AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).</li><li>Walisko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Taming+of+the+Shrew+-Controlling+the+Morphology+of+Filamentous+Eukaryotic+and+Prokaryotic+Microorganisms.">The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).</li><li>Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Openstage:+A+Low-Cost+Motorized+Microscope+Stage+with+Sub-Micron+Positioning+Accuracy.">Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy.</a> PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).</li><li>Dias, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+identification+and+quantification+of+filamentous+bacteria+in+in+situ+acquired+images.">Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images.</a> BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).</li><li>Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Species-Specific+Filament+Levels+to+Filamentous+Bulking+in+Activated+Sludge.">Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).</li><li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+twisted+pixels:+ethical+guidelines+for+the+appropriate+use+and+manipulation+of+scientific+digital+images.">Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images.</a> Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tidy+Data.">Tidy Data.</a> Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).</li><li>van Rossum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Python tutorial. , (1995).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIJI:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">FIJI: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>. SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis">https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</a> (2018)</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).</li><li>Sezgin, M., Sankur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+over+image+thresholding+techniques+and+quantitative+performance+evaluation.">Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation.</a> Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).</li><li>Kr&#246;ner, S., Dom&#233;nech Carb&#243;, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+minimum+pixel+resolution+for+shape+analysis:+Proposal+of+a+new+data+validation+method+for+computerized+images.">Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images.</a> Powder Technology. 245, 297-313 (2013).</li><li>McKinney, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+Structures+for+Statistical+Computing+in+Python.">Data Structures for Statistical Computing in Python.</a> Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).</li><li>Waskom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).</li><li>. dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html">https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html</a> (2016)</li><li>Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+Photography:+A+Primer+for+Pathologists.">Digital Photography: A Primer for Pathologists.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).</li><li>Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pipeline+for+illumination+correction+of+images+for+high-throughput+microscopy.">Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy.</a> Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).</li><li>Eastwood, B. S., Childs, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Alignment+for+Multiple+Camera+High+Dynamic+Range+Microscopy.">Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy.</a> Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).</li><li>High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: <a target="_blank" href="https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/">https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/</a> (2009)</li><li>Jain, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+Learning+of+Image+Restoration+with+Convolutional+Networks.">Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks.</a> 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).</li></ol>

Aunque el sistema de análisis de imagen es bastante robusto y pasos de control de calidad se toman para asegurar imágenes pobres se retiran, la atención adecuada a problemas específicos en la adquisición de la imagen, muestreo y preparación de las placas puede mejorar tanto la precisión de los datos y la proporción de imágenes pasando del control de calidad.
Concentración de muestras Suponiendo que se ha tomado una muestra representativa, es el paso más important...

El propósito de este método es proporcionar un método bien definido, repetible y parcialmente automatizados para determinar las distribuciones de tamaño y forma de las partículas en biorreactores, especialmente aquellas que contienen los flóculos de lodo activado y gránulos aerobios1 , 2. el fundamento de este método mejorar la accesibilidad, sencillez, rendimiento y repetibilidad de nuestros actuales protocolos internos3,4, facilitar la medición de partículas de otros, facilitar el intercambio y comparación de los datos.
Hay dos categorías generales de análisis de medición de partículas - métodos directo imágenes e inferenciales mediante tales cualidades como la dispersión de la luz5. Aunque métodos inferenciales pueden ser automatizados y tienen gran rendimiento, el equipo es caro. Además, mientras métodos inferenciales pueden determinar con precisión el tamaño equivalente de una partícula6, no proporcionan información de forma detallada7.
Debido a la necesidad de datos de formas, nos hemos basado nuestro método en la proyección de imagen directa. Aunque existen algunos métodos de proyección de imagen de alto rendimiento, ha requerido tradicionalmente caro hardware comercial o soluciones construido8,9. Nuestro método ha sido desarrollado para emplear común y asequible hardware y software que, aunque sufren de una reducción en el rendimiento, produce imágenes de partículas mucho más que el mínimo necesario para muchos análisis10.
No debe especificar los protocolos muestreo importante y los pasos de adquisición de imagen. Otros protocolos pueden especificar pasos manuales que introducen sesgos subjetivos (tales como umbral ad hoc11). Un método bien definido que especifica los pasos de adquisición muestreo, inmovilización e imagen combinados con software de análisis gratuitamente mejorará tanto dentro del laboratorio de imagen análisis y comparaciones entre laboratorios. Un objetivo principal de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo y herramientas que deben conducir a resultados reproducibles de diferentes laboratorios para la misma muestra.
Además de normalizar el proceso de análisis de imagen, los datos producidos por este gasoducto se registran en un archivo bien definidos y bien formateado,12 adecuado para uso popular datos análisis paquetes13,14, experimento de relajación análisis específicos (como la generación de la figura de encargo) y facilitar información entre laboratorios.
Este protocolo se recomienda especialmente para los investigadores que requieren datos de forma de partícula, no tienen acceso a los métodos inferenciales, desea desarrollar su propia tubería de análisis de imagen y desea compartir sus datos fácilmente con otros

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Bleach solution</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>31009</td>
			<td>For workspace disinfection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube with cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430790</td>
			<td>Per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4980-50</td>
			<td>Other vessels are suitable so long as they can contain &#62; 40 mL of sample and allow mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Kimax Bottle</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>14395-50</td>
			<td>Or otherwise sufficient for agar handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>R or Python are suggested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis is not CPU intensive, any &#39;ordinary&#39; desktop computer circa 2017 should be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>External hard drive</td>
			<td>Seagate</td>
			<td>STEB5000100</td>
			<td>Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>version 1.51d</td>
			<td>Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIT</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>version 2.19.1 or later</td>
			<td>Available at: https://git-scm.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image capture software</td>
			<td>ToupView</td>
			<td>version 3.7.5177</td>
			<td>Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical (X/Y) Stage</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A512</td>
			<td>Not fully required, but greatly aids image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M291-100</td>
			<td>Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A35140U</td>
			<td>Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Stage Micrometer</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM1</td>
			<td>Or otherwise sufficient for spatial calibration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>1 per sample.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPE</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Standard lab coat, gloves, and eyewear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparmoria macro</td>
			<td>NCSU</td>
			<td>version 0.2.1</td>
			<td>Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo/dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-2T</td>
			<td>Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the shape and size of activated sludge particles immobilized in agar with an open source software pipeline

Bioreactores experimentales, tales como ésos tratamiento de aguas residuales, contienen partículas cuyo tamaño y forma son parámetros importantes. Por ejemplo, el tamaño y la forma de flóculos de lodo activado pueden indicar las condiciones en la microescala y afectan también directamente cómo el lodo se instala en un clarificador.
Forma y tamaño de las partículas son ambas medidas misleadingly 'simples'. Muchas cuestiones sutiles, a menudo ignoradas en protocolos informales, pueden surgir cuando el muestreo, la proyección de imagen y análisis de partículas. Métodos de muestreo pueden ser sesgados o no proporcionan suficiente poder estadístico. Las muestras se pueden llevar mal o sufren alteración durante la inmovilización. Las imágenes pueden ser de calidad suficiente; superposición de partículas, profundidad de campo, nivel de ampliación y ruidos varios puede todos producir malos resultados. Mal especificado análisis pueden introducir sesgos, como el producido por segmentación y umbral de imagen manual.
Rendimiento y la asequibilidad son deseables junto con reproducibilidad. Un método asequible, de alto rendimiento permite medición de partícula más frecuente, produciendo muchas imágenes que contiene miles de partículas. Un método que utiliza reactivos de bajo costo, un microscopio de disección común y libremente disponibles análisis software libre permite resultados experimentales repetibles, accesibles, reproducibles y parcialmente automatizado. Además, el producto de dicho método puede ser bien formateado, bien definido y fácil de entender por software de análisis de datos, facilitando datos entre laboratorios y análisis en laboratorio.
Presentamos un protocolo que detalla los pasos necesarios para producir un producto, incluyendo: toma de muestras, la muestra preparación e inmovilización en agar, adquisición de imagen digital, análisis digital de imágenes y ejemplos de generación específicos del experimento figura de la resultados del análisis. También hemos incluido un gasoducto de análisis de datos de código abierto para apoyar este protocolo.

Archivos generados El proceso ilustrado en la figura 1 produce dos archivos por imagen analizada. El primer archivo es una coma separa el archivo de texto de valores (CSV) donde cada fila corresponde a una partícula individual y las columnas describen varios indicadores de partículas tales como área, circularidad y solidez y definidos en el manual de ImageJ17. Archivos CSV de ejemplo se incluyen como información...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline at JoVE.com

Measuring the Shape and Size of Activated Sludge Particles Immobilized in Agar with an Open Source Software Pipeline

El tamaño y forma de las partículas de lodos activados son parámetros importantes que se miden utilizando diferentes métodos. Errores surgen de muestreo no representativo, imágenes subóptimas y parámetros de análisis subjetivo. Para minimizar estos errores y facilitar la medición, presentamos un protocolo especificando cada paso, incluyendo un oleoducto de software de código abierto.

Medición de la forma y el tamaño de las partículas de lodo activado inmovilizado en Agar con una tubería de Software de código abierto

Experimental bioreactors, such as those treating wastewater, contain particles whose size and shape are important parameters. For example, the size and ...

El tamaño y la forma de las partículas de lodos activados son fundamentales para la eficiencia del tratamiento de aguas residuales. Sin embargo, su medición es a menudo ad hoc. Este protocolo proporciona una medida repetible, bien definida y semiautomática para su medición.La principal ventaja de este protocolo es que puede medir una gran población de partículas en una amplia gama de morfologías al tiempo que reduce el sesgo subjetivo y sistemático. Si bien esta técnica se centra en los lodos activados, técnicamente cualquier cosa que tenga la misma morfología de partículas como los microplásticos se puede medir con este método. Al intentar esta técnica por primera vez, intente hacer una placa a la vez y practique los movimientos físicos de hacer esa placa.Además, tómese su tiempo con la microscopía. La versión de vídeo de este artículo es importante porque el muestreo y la preparación de placas requieren una gran cantidad de pequeñas técnicas que se comunican mejor visualmente. Además, mostrar y ver buenas imágenes de las placas es importante para garantizar la reproducibilidad.Demostrando este protocolo hoy está Joseph Weaver, un candidato de PHD en mi laboratorio. Para empezar, adquiera una muestra representativa de una porción bien mezclada del reactor. Mezcle suavemente la muestra y vierta inmediatamente el volumen de la muestra determinado en un tubo centrífugo de 15 mililitros.A continuación, agregue cinco microlitros de un uno por ciento de azul de metileno a cada muestra. Tapar y mezclar la muestra invirtiendo suavemente el tubo al menos tres veces. Deje que las muestras se manche durante al menos cinco pero no más de 30 minutos a temperatura ambiente.Una vez manchado, transfiera un volumen suficiente de agar fundido 7.5 por ciento y agua desionizada al tubo centrífuga con el fin de llevar el volumen total del tubo a entre 6.5 y 9 mililitros. A continuación, vuelva a tapar los tubos centrífugos e invierta suavemente al menos tres veces para mezclar la muestra en el agar. Mientras apunta la tapa lejos de uno mismo, abra la tapa.Vierta el contenido del tubo de cada tubo en su propia placa de petri de plástico de 100 mililitros mientras balancea suavemente el plato para lograr un recubrimiento completo y suave y una distribución visualmente uniforme de las partículas. Deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, hasta que el agar se solidifique. Coloque la placa descubierta boca arriba en la etapa del microscopio de un microscopio estéreo que sea capaz de 10 a 20 veces el aumento.Ilumina la muestra desde abajo con luz difusa uniforme, utilizando equipos como un soporte iluminador LED o una placa de luz. Abra el software de captura de imágenes y asegúrese de que la ruta de la luz del microscopio esté configurada en foto. A continuación, seleccione la cámara adecuada en la lista de cámaras.Ajuste el microscopio para que aparezcan varias partículas en el plano focal con bordes grandes y bien definidos. Utilice un aumento de 10 a 20 veces para medir partículas mientras mantiene un plano focal relativamente profundo. Retire temporalmente la placa de agar y coloque el micrómetro en el escenario.Ajuste el enfoque fino hasta que las graduaciones del micrómetro aparezcan nítidamente enfocadas en el software de captura de imágenes. Y calibrar la relación píxel a micra. A continuación, establezca el zoom en 100 por ciento haciendo clic en la vista y seleccionando el tamaño real.A continuación, seleccione las opciones y vaya a calibrar. Aquí, alinee la barra de calibración roja en la ventana gráfica principal a lo largo del eje largo del micrómetro. Con las barras verticales centradas en las graduaciones cero y 200 micras.En el cuadro de diálogo Calibrar, introduzca el nivel de ampliación actual y la longitud real de 200 micras. Si ya está calibrado, seleccione ampliación en la barra de menús y, a continuación, seleccione el nivel de ampliación actual para confirmar la calibración. En el menú de medidas, vaya a línea y seleccione la línea arbitraria.Haga clic en la intersección de la graduación cero y el eje largo del micrómetro. A continuación, haga clic de nuevo en la intersección en la línea de 200 micras y el eje largo. Una calibración correcta debe mostrarse como aproximadamente 200 micras.Elimine la línea haciendo clic en el botón Seleccionar objeto, haciendo clic en la línea, presionando Eliminar y presionando sí en el cuadro de confirmación. A continuación, reemplace la placa de agar y ajuste el enfoque fino para lograr el máximo detalle en el software de imágenes. Para lograr esto, primero aumente la profundidad de bits del valor máximo permitido seleccionando el botón de opción en el panel de profundidad de bits de la barra lateral de la cámara.Además, configure el software para adquirir imágenes en escala de grises seleccionando el botón de opción adecuado en el panel de grado de color de la barra lateral de la cámara. Ahora, contraiga cualquier panel de barra lateral abierto entre la exposición y el histograma. Reduzca la ganancia a uno y aumente la exposición hasta que aparezca una imagen clara en la ventana gráfica y hasta que el histograma aparezca como una distribución que no esté recortada por ninguno de los extremos del histograma.Ajuste el histograma para evitar la exposición excesiva y inferior. En el panel del histograma de la barra lateral de la cámara, deslice el límite izquierdo del histograma justo fuera de los valores más bajos y el límite derecho a estar justo fuera de los valores más altos. Guarde la imagen como un archivo TIF sin comprimir.Incluya la información de ampliación en los metadatos de la imagen marcando la casilla Guardar con información de calibración al guardar. Seleccione otra área que no se superponga a las imágenes anteriores siguiendo un trazado que alterna entre izquierda a derecha y de derecha a izquierda a medida que se mueve hacia abajo en la placa. Capture al menos 500 partículas estimadas visualmente para su análisis.Adquiera el código de análisis de partículas clonando el repositorio GIT. En la línea de comandos, recupere la versión más reciente del código escribiendo el comando que se muestra aquí. Instale el código de análisis siguiendo las instrucciones del archivo de texto Léame que se encuentra en el directorio de nivel superior del repositorio clonado.A continuación, edite un archivo de texto que muestre los directorios que se van a procesar junto con los parámetros opcionales. Consulte los ejemplos y el subdirectorio de análisis para obtener una lista de parámetros y ejemplos. Ahora, ejecute el análisis en la línea de comandos escribiendo el comando que se muestra aquí.La ruta de Fiji es el directorio en el que imageJ-win64. exe se encuentra. Y paramsfile la ubicación del archivo de texto que describe la configuración del análisis.El nombre del ejecutable puede variar dependiendo del sistema operativo en el que esté instalado Fiji. El análisis se ejecutará automáticamente y tardará unos minutos o unas horas dependiendo del tamaño y el número de imágenes. A continuación, examine los archivos de control de calidad ubicados en el subdirectorio de superposición del directorio de salida especificado.Observe las imágenes con niebla espuria o partículas mal capturadas, todas aparentes como contornos sombreados que no coinciden con el fondo. Eso es todo. Los datos ya están listos para el análisis específico del experimento y la generación de figuras.Aunque ningún método de umbral de partículas es perfecto, aquí hay un ejemplo de resultados aceptables. Al evaluar imágenes de control de calidad, se han encontrado tres errores comunes. No ajustarse con precisión a los límites de partículas, no identificar partículas e incluir artefactos.Aquí, las distribuciones de partículas entre dos reactores experimentales a lo largo del tiempo se muestran y se combinan con metadatos cualitativos observados por el investigador. Este gráfico muestra que en este caso, los reactores tenían distribuciones de tamaño de partícula generalmente similares que tendían hacia una media más grande y una propagación más amplia a medida que avanzaba el tiempo. Al realizar este procedimiento, es fundamental recubrir uniformemente la placa con una fina capa de agar que contenga partículas distribuidas uniformemente.Asegúrese de practicar y tomar su tiempo. Más allá de este procedimiento, partículas interesantes podrían ser extirpadas del agar y estudiadas. En términos de datos, los archivos resultantes de este protocolo están bien definidos y el cielo es el límite analíticamente.Esta técnica allanó el camino para proporcionar nuevos conocimientos sobre lodos granulares aeróbicos. Su morfología es muy importante y nos permitió medirla de una manera estándar. Las aguas residuales son biológicamente activas.Se fomentan las prácticas de nivel uno de biosema seguridad. Además, cómo el agar puede burbujear cuando se microonda el microondas y puede rociar gotas calientes al abrir el tubo de centrífuga.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

Investigación

Medio ambiente

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Desarrollo de sulfidogénicos lodos de sedimentos marinos y tricloroetileno Reducción en un reactor anaerobio de flujo ascendente Manta lodos

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Al ver guepardos: identificación de las personas por sus huellas

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

La extracción de sustancias poliméricas extracelulares estructural de lodo granular aerobio

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

Un aparato de múltiples capas ultra limpio para recoger plancton marino tamaño fraccionado y partículas en suspensión

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Estudio experimental de la relación entre tamaño de partícula y la capacidad de absorción del metano en la pizarra

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Medición de hipofaringe tamaño de acino de glándula en trabajadores de la abeja (Apis mellifera)

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

Combinando los datos de seguimiento ocular con un análisis de contenido de vídeo de la visualización gratuita de un vídeo de un paseo en un entorno de parque urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, un Datalogger de código abierto de bajo costo para estimar el contenido de agua de criptógamas no vasculares

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...