Name: an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay at JoVE.com

מחקר זה נתמך על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, ו 2018R1A6A1A03023718).

1. דור של lentiviruses לבטא YFPקי ו- SLC26A4
<ol><li>לגדל תאי הכליה עובריים אנושיים HEK293T עד 80% confluency על צלחות תרבות 100 מ מ. של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 הוא המדיום תרבות בשימוש בכל רחבי הפרוטוקול כדי לשמור על HEK293T ותאים אחרים המוזכרים להלן.</li>
	<...

<ol>
	<li>Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins,+connexons,+and+Intercellular+Communication.">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li><li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity:+Structure-Function+Relationship.">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).</li><li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication.">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li><li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens.">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li><li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis.">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).</li><li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity.">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li><li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li><li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex.">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li><li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia/reperfusion+injury,+cardioprotection+and+neuroprotection.">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li><li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura.">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li><li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure.">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li><li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging:+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis.">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+2+,+6+,+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis.">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems.">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li><li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication.">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li><li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-Loading+and+Dye+Transfer:+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication.">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li><li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells.">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique.">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).</li><li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction.">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li><li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels.">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li><li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay.">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li><li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities.">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li><li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication.">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li><li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology.">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li><li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors.">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li><li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+/+c+3T3+fibroblasts.">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li><li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+Connexin+Channels.">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li><li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap.">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li></ol>

הבדיקה אני-YFP-GJIC יכול לשמש עבור HTS כי זה חזקה, מהירה וזולה. Assay HTS נחשבת חזקה אם ז '-פקטור הוא מעל 0.525. מבחני לראות ג'אנג et al. לתיאור של ניתוח סטטיסטי המשמש כדי לבדוק את התאמת HTS25. כאשר תאים LN215 שימשו, ז '-גורם היה > 0.5 ללא כל אופטימיזציה וזמינותו. אם סוגי תאים אחרים משמשים וז?...

הפער צמתים (GJs) לשמש ערוצי המערכת לאפשר פעפוע של מולקולות קטנות של < kDa 1 כגון חומרים מזינים, מטבוליטים מולקולות איתות בין תאים סמוכים. האלמנטים מהחיבור כוללים hemichannel או connexon בכל תא, ומהווה כל connexon connexins (Cxs) 61. GJs ו Cxs שימשו מבחני הרעלים של חומרים מסרטנים כגון פחמימנים ארומטיים polycyclic (הפה), אשר GJ מעכבי2,3,4. GJIC שיבשו נמצא קשור nongenotoxic carcinogenesis5,6. טיפולית כמטרה פוטנציאליים, מעורבות GJ דווחה ב תתי סוגים מסוימים של7,התקפים8, הגנה מפני הלב והמוח איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה9, מיגרנה עם אאורה10, שיכרון פגיעה בכבד6,11,12ריפוי הפצע. תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) מבחני נדרשים כדי לזהות להתכוונן GJ כימיקלים או נוגדנים לגילוי סמים, עבור מבחני רעלים, וכדי לזהות הרגולטורים הסלולר הרומן של פעילות GJ. מבחני HTS יכול לשמש גם כדי לחקור מבנה-פעילות הגומלין של GJ מאפננים2,13,14,15.
כמה מבחני GJIC כוללים העברת צבע או טכניקות מלחציים תיקון כפול. לוציפר צהוב CH (LY) ו- calcein acetoxymethyl אסתר (calcein-AM) שימשו מבחני העברת צבע. התאים אינם חדיר כדי LY, אשר הציג microinjection, מגרדים טעינה או אלקטרופורציה. פעם אחת בתוך התא, LY מתפשט לתוך השכנה תאים באמצעות GJs, פעילות GJ הוא לבדיקה על פי מידת ה-הגירה LY16. מבחני Calcein-אם כרוכים בדרך כלל הפער-זריחה התאוששות לאחר17,photobleaching18. Calcein-אם הוא צבע התא-permeant זה מומר intracellularly calcein אטום על ידי esterase מהותי. וזמינותו מחייבת מיקרוסקופ קונפוקלי להתבונן בהעברת calcein-אם בתוך תא מן הסובבים אותו בעקבות לייזר photobleaching. אם GJs פונקציונלי קיימות, calcein-אם תאים סמוכים מזין את התאים photobleached, ידי קרינה פלואורסצנטית הוא התאושש. פעילות GJ הוא לבדיקה על פי מידת פלורסצנטיות שחזור של תאי photobleached. צבע-העברת מבחני מפרך וצורכת זמן או בעלי רגישויות נמוכה. תיקון כפול מחבר חובק למעקה היא שיטת אלקטרופיזיולוגיות המודד מוליכות מהחיבור. . זה רגיש יחסית, עם תלות ישירה של מוליכות על מספר GJs פתוח19; עם זאת, כל דבר טכנית אחר, זמן רב ויקר20 הבדיקה אני-YFP-GJIC פותחה לשימוש ב- HTS.
איור 1 מדגימה את הרכיבים ואת השלבים של GJIC-YFP וזמינותו, אשר מנצל תאים מקבל ביטוי variant YFP רגיש יודיד הנושאת H148Q ו- I152L (YFPקי) ותאים התורם לבטא של טרנספורטר יודיד (SLC26A4)21 . שתי מוטציות שישאו YFPקי לאפשר שכבתה של קרינה פלואורסצנטית מאת יודיד22. Iodides מתווספים מקבל תרבותי משותף ותאים התורם; הם לא תזין את התאים מקבל, אבל שנלקחה על ידי למעליות SLC26A4 נוכח בתאי התורם. Iodides בתאי התורם מפוזרת באמצעות GJs מתפקדת לתאים סמוכים מקבל שבו הם להרוות את פלורסצנטיות YFPקי . אם GJs סגורים או נחסם על-ידי מעכבי, יודיד אין באפשרותך להזין את התאים מקבל כדי להרוות את קרינה פלואורסצנטית. הקצב quenching YFPקי משקף פעילות GJ. הנוהל וזמינותו של GJIC-YFP הוא לא מסובך ולא זמן רב. זה תואם HTS והוא יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של מספר רב של תרכובות בפעילות GJ בתקופה קצרה יחסית. זה דורש רק מקבל תאי התורם ואת שני פתרונות מלח מאוזנת. הפרוטוקול המתואר להלן מבוססת על תאים LN215 Cx העיקרי שלו הוא Cx4321. הקולטן LN215-YFPקי ואת LN215-אני תאי התורם− היו שנוצר על ידי התמרה חושית עם lentiviruses לבטא YFPקי או SLC26A421,23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">96-well plate</td>
			<td style="width:72px;">SPL</td>
			<td style="width:123px;">30096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C5670</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">HEPES</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">RES6003H-B7</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:72px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">11668-027</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2393</td>
			<td>C-solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:72px;">BMG LabTech&#160;</td>
			<td style="width:123px;">POLARstar Omega 415-1618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Polybrene</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">&#160;#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5886</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium hyroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium Iodide (NaI)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">383112</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay

הפער צמתים (GJs) הם ערוצי קרום התא לאפשר דיפוזיה של מולקולות קטנות יותר מאשר 1 kDa בין תאים סמוכים. כפי שהם תפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים, יש צורך של תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) מבחני לזהות GJ מאפננים במבחני גילוי של הרעלים סמים. Assay המערכת-צומת תקשורת (I-YFP-GJIC) הרומן יודיד-צהוב הניאון חלבון-gap ממלא את הצורך הזה. זה וזמינותו מבוססת תא כולל תאים מקבל ושל התורמים מתוכננים לבטא stably משתנה צהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP), זריחה של מי הוא ברגישות מתרצה יודיד, או SLC26A4, טרנספורטר יודיד, בהתאמה. כשנוספת יודיד לתרבות מעורב מסוגי תאים שני, הם להזין את תאי התורם באמצעות המשגר SLC26A4, טשטוש לתאים סמוכים מקבל דרך GJs איפה הם להרוות את פלורסצנטיות YFP. קרינה פלואורסצנטית YFP נמדד טוב מאת טוב במצב קינטי. הקצב quenching YFP משקף פעילות GJ. וזמינותו הוא אמין ומהיר מספיק כדי לשמש עבור HTS. הפרוטוקול עבור וזמינותו אני-YFP-GJIC באמצעות תאי LN215, תאים אנושיים glioma, מתואר.

עשרים ותשע 96-ובכן תרבות צלחות שימשו למסך כימיקלים, 2320 לזהות את הרומן מאפננים GJIC-YFP GJIC assay באמצעות LN215-YFPקי LN215-אני− תאים. התוצאות המתקבלות עם צלחת נציג מוצגים באיור2. האחוז של קרינה פלואורסצנטית YFP היטב כל מוצג כתרשים קווי איור 2<stro...

Watch this Scientific Journal Video about An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay at JoVE.com

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap

כאן, אנו מציגים עבור הרומן הפער צומת תקשורת המערכת assay המיועד להקרנה תפוקה גבוהה של הפער להתכוונן צומת כימיקלים גילוי תרופות רעילות הערכת פרוטוקול.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

צמתים של גאפ הוצעו כיערות סמים. יודיד-YFP-GJIC הראיה תואמת עם סינון תפוקה גבוהה כדי לגלות אפנוני צומת פער. זה שימשו כדי לבדוק את ההשפעות של מספר רב של תרכובות על פעילות צומת פער בתקופה קצרה יחסית.יודיד-YFP-GJIC הראיה היא פשוטה, חזקה, חוזרת וזול. ההתמדה הזו דורשת רק תאים מקבלים ותורמים ושני פתרונות מלח מאוזנים. אין צורך בריגנטים נוספים כגון לוציפר צהוב וקלסין AM.כמו כן הוא מודד את סך כל פעילויות צומת הפער של התאים באר אחת שתוותה שונות נמוכה בין בארות. כדי להתחיל בהליך זה, הגדל תאי LN215 ל- 80%confluency ב- DMEM נוסף כמפורט בפרוטוקול הטקסט. יום אחד לפני ההעתקה לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS.מוסיפים שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לתאים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. באמצעות פיפסה סרולוגית 10 מיליליטר להשתמש מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של בינוני תרבות ולהתאים את צפיפות התא ל 50, 000 תאים למיליליטר. הוסף 400 מיקרוליטרים של מדיה המכילים 20,000 תאים לכל באר של צלחת תרבות של 24 בארות.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. למחרת להחליף שתי בארות על ידי החלפת מדיום התרבות עם 400 microliters של תערובת של אחד לאחד של lentivirus ותרבות טרייה בינוני בתוספת פוליברן בריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר. עבור פקדי הנגיף לא להחליף את מדיום התרבות עם בינוני תרבות טרי בתוספת פוליברן בריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 שעות. לאחר מכן שאף את המדיום המכיל lentiviruses, ואת מדיום תרבות טרי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות נוספות.לאחר מכן, לשטוף את התאים בכל באר פעמיים עם 0.5 מיליליטר של PBS. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של 0.25% טריפסין EDTA לתאים, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. תן את התאים בשני מיליליטר של מדיום תרבותי, ולאחר מכן צלחת אותם צלחות תרבות שש באר עם שני מיקרוגרם למיליליטר של puromycin.תרבות התאים עד שכל התאים בארות הבקרה מתים, אשר בדרך כלל לוקח בערך שבוע. ראשית, בנפרד תרבות LN215-YFP ותאי LN215-יודיד ב 100 מילימטר צלחות בתרבות בינונית כדי להגיע לאוכלוסיות הנדרשות עבור המבחן. יום אחד לפני ההתנגדות, לשטוף כל צלחת עם 10 מיליליטר של PBS.לטפל בכל צלחת עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין פתרון EDTA, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. תעבירו את התאים לארבעה מיליליטר של מדיום תרבותי ותעבירו אותם לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 1, 000 גרם במשך שלוש דקות כדי גלולה התאים.השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש כל גלולת תא בחמישה מיליליטר של מדיום תרבותי. פיפטה למעלה ולמטה בערך 20 פעמים כדי לשבור את כל גושי התאים. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.ואז לדלל את התאים במדיום תרבות כדי להפוך את השעיית התא בצפיפות המוצגת כאן. לאחר מכן, מערבבים שבעה מיליליטר של כל מתלה תא יחד במאגר. השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 100 microliters של תערובת זו לכל באר של צלחת תרבות 96-well.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. ראשית, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדלה של פי 20 ומסנן GFP כדי לבדוק את הצלחות של 96 בארות כדי להיות בטוח שאין גושים של תאים, ושתרבויות הן confluent מלא מופץ היטב. לפחות 30 דקות לפני שההתנגדות מפעילה קורא מיקרופלסטיק ומגדירה אותו ל-37 מעלות צלזיוס.לשטוף את הצינורות של מזרק אוטומטי עם שלושה מיליליטר של 70% אתנול, שלושה מיליליטר של מים מזוקקים, ושלושה מיליליטר של I-פתרון. לאחר מכן, לחמם את פתרונות C ו- I ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. או להפוך את מדיום הצמיחה או להפוך את הצלחת כדי לרוקן אותו.הקש על כל מדיום שיורית. לאחר מכן הוסיפו את פתרון C למאגר באמצעות פיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטרים של C-solution לכל באר של הצלחת. או לחושף את הפתרון או להפוך את הצלחת כדי לרוקן אותו, מה שהופך את הקש החוצה כל פתרון שיורית.הוסף 50 מיקרוליטרים של C-פתרון לכל באר. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של מלאי כימי של 2.5 מילימולרים או DMSO כרכב, והוסיפו עוד 50 מיקרוליטרים של C-solution לכל באר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באוויר במשך כ 10 דקות.במהלך הדגירה, התחל להגדיר את הפרמטרים בתוכנית קורא המיקרופלסטיק על-ידי לחיצה על לחצן נהל פרוטוקולים. לחץ על לחצן חדש. בחרו בעוצמת הפלואורסצנטיות באזור 'שיטת מדידה' וב'מצב באר' באזור 'מצב קריאה'.לאחר מכן, לחץ על לחצן אישור. כרטיסיה חדשה תופיע. בתפריט פרמטרים בסיסיים הגדר את אורך הגל של העירור ל- 485 ננומטר, ואת הפליטה ל- 520 ננומטר.בחר את אופטיקה התחתונה כדי לקרוא פלואורסצנטיות מלמטה. לאחר מכן הגדר את זמן התחלת המדידה כאפס שניות, את מספר המרווחים ל- 25, את מספר ההבזקים ל הבאר ואת מרווח הזמן ל- 20 ואת זמן המרווח ל- 0.4 שניות. בתפריט 'פריסה' צייר אזור של הלוח לקריאה.בתפריט ריכוזים/כרכים/צריף הגדר את קורא המיקרופלסטיק להזריק 100 מיקרוליטרים של I-solution לכל באר במהירות הזרקה של 135 מיקרוליטרים לשנייה. בתפריט זמן הזרקה הגדר את זמן ההתחלה של ההזרקה לשנייה אחת. לאחר מכן לחצו על הלחצן 'התחל מדידה'.לאחר השלמת הדגירה, העבר את לוחות 96 הבאר לקורא המיקרופלסטיק והתחל את המדידה על-ידי לחיצה נוספת על לחצן התחל מדידה. במחקר זה, יוד צהוב פלואורסצנטי חלבון-פער צומת-intercellular תקשורת מבחן משמש עם LN215-YFP ו LN215-יוד תאים כדי מסך 2, 320 כימיקלים כדי לזהות צומת פער חדש אפנן תקשורת תאית. Homosalate נראה לעכב 50% של צומת פער תקשורת תאית.בעוד טרביניפין מעכב אותו לחלוטין. זה מאשר טרביניפין כמעכב צומת פער. הערכה זו מודדת את GJIC בין תאים תורמים ומקבלים שכנים, ולכן יש לנתק לחלוטין את התאים התורמים והמקבלים לפני ציפוי.והמינוי של התרבות המעורבת צריך להיות 100% כדי למקסם היווצרות של צמתים פער בין תאים. נתוני קורס זמן, יחסי תגובה במינון, והערכת ההפיכה של אפנוני צומת פער ניתן להשיג עם יודיד-YFP-GJIC הערכה. כמו כן, Iodide-YFP ספציפי connexin GJIC בדיקות ניתן ליצור על ידי גרימת הביטוי של connexin של עניין לתוך התאים נטול צמתים פער פונקציונלי.זה מאפשר לקבוע ערך IC50 של כימיקל מסוג מסוים של connexin. יודיד-YFP-GJIC ניתן להשתמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה, כי זה חזק, חוזר, וזול. בדיקות אלה מסייעות למצוא צומת פערים המווסת כימיקלים לגילוי תרופות והערכה טוקסיקולוגית.

Research

JoVE Journal

Biology

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...