Name: an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della pubblica istruzione (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 e 2018R1A6A1A03023718).

1. generazione di lentivirus esprimere YFPQL e SLC26A4
<ol><li>Crescere le cellule embrionali umane del rene di HEK293T all'80% confluenza su piastre di coltura di 100 mm. Per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) completati con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina è il terreno di coltura utilizzato in tutto il protocollo per mantenere HEK293T ed altre cellule di seguito indicate.</li>
	<li>Cappotto 6 pozzetti cultura piastre con l'aggiunta di 2 mL di 0,005% di sol...

<ol>
	<li>Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins,+connexons,+and+Intercellular+Communication.">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li><li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity:+Structure-Function+Relationship.">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).</li><li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication.">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li><li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens.">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li><li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis.">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).</li><li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity.">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li><li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li><li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex.">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li><li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia/reperfusion+injury,+cardioprotection+and+neuroprotection.">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li><li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura.">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li><li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure.">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li><li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging:+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis.">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+2+,+6+,+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis.">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems.">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li><li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication.">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li><li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-Loading+and+Dye+Transfer:+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication.">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li><li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells.">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique.">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).</li><li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction.">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li><li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels.">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li><li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay.">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li><li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities.">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li><li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication.">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li><li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology.">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li><li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors.">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li><li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+/+c+3T3+fibroblasts.">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li><li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+Connexin+Channels.">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li><li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap.">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li></ol>

L'analisi YFP-GJIC può essere usata per HTS perché è robusto, veloce e poco costoso. Un'analisi HTS è considerata robusta se la Z'-factor è superiore a 0,525. Vedere Zhang et per una descrizione dell'analisi statistica utilizzata per valutare l'idoneità del sistema HTS dosaggi25. Quando le cellule LN215 sono state usate, la Z'-fattore era > 0,5 senza alcuna ottimizzazione del dosaggio. Se vengono utilizzati altri tipi di cella nel dosaggio e suo Z'-fattore è < 0,5, l...

Giunzioni di Gap (GJs) fungono da canali intercellulari per consentire la diffusione di piccole molecole di < 1 kDa come nutrienti, metaboliti e molecole di segnalazione tra celle adiacenti. Gli elementi giunzionali includono un hemichannel o una connessone in ogni cellula e ogni connessone costituisce sei connexins (Cxs)1. GJs e Cxs sono stati utilizzati nelle analisi di tossicologia degli agenti cancerogeni quali idrocarburi policiclici aromatici (PAH), che sono GJ inibitori2,3,4. GJIC interrotte è stato associato con nongenotoxic carcinogenesi5,6. Come un potenziale bersaglio terapeutico, GJ partecipazione è stata segnalata in particolari sottotipi di sequestri7,8, protezione da cardiaco e cervello ischemia/riperfusione pregiudizio9, emicrania con aura10, danno epatico farmaco-indotto6,11e12di guarigione della ferita. High throughput screening (HTS) saggi sono tenuti a identificare le sostanze chimiche GJ-modulanti o anticorpi per la scoperta di nuovi farmaci, per le analisi di tossicologia e per identificare nuovi regolatori cellulari della attività GJ. Saggi di HTS è utilizzabile anche per indagare le relazioni struttura-attività di GJ modulatori2,13,14,15.
Alcuni saggi GJIC includono trasferimento della tintura o tecniche di dual patch clamp. Lucifero giallo CH (LY) ed estere di calceina acetossimetil (calceina-AM) sono stati utilizzati nelle analisi di dye-transfer. Le cellule non sono permeabili a LY, che è stato introdotto da microiniezione, raschiare caricamento o elettroporazione. Una volta all'interno della cellula, LY si diffonde nelle vicine cellule via GJs e attività GJ è analizzata dalla misura del LY migrazione16. Saggi di calceina-AM coinvolgono di solito recupero di gap-fluorescenza dopo photobleaching17,18. Calceina-AM è un cellulare-permeante colorante che è convertito intracellulare in calceina impermeabile da un intrinseco dell'esterasi. Il test richiede un microscopio confocale per osservare il trasferimento di calceina-AM in una cella da coloro che la circondano dopo laser photobleaching. Se GJs funzionale sono presenti, la fluorescenza viene recuperata e calceina-AM in celle adiacenti entra nelle cellule photobleached. Attività GJ è analizzata dalla misura di recupero di fluorescenza delle cellule photobleached. Sublimazione saggi sono laboriosa e che richiede tempo o hanno basse sensibilità. Dual patch di bloccaggio è un metodo elettrofisiologico che misura di conduttanza giunzionale. È relativamente sensibile, con una dipendenza diretta della conduttanza al numero di open GJs19; Tuttavia, è tecnicamente esigente, richiede tempo e costoso20. L'analisi YFP-GJIC è stata sviluppata per l'uso in HTS
La figura 1 illustra i componenti e i passaggi del test GJIC-YFP, che utilizza celle acceptor esprimendo una variante YFP ioduro sensibili cuscinetto H148Q e I152L (YFPQL) e le cellule erogarici esprimendo un trasportatore di ioduro (SLC26A4)21 . Le due mutazioni di YFPQL consentono tempra di fluorescenza di ioduro22. Gli ioduri vengono aggiunti al co-coltivate acceptor e cellule del donatore; Essi non entrano le cellule accettore, ma sono presi dai trasportatori SLC26A4 presenti sulle cellule del donatore. Gli ioduri nelle cellule del donatore si diffondono attraverso GJs funzionante in celle adiacenti acceptor dove essi placare la fluorescenza YFPQL . Se GJs sono chiuso o bloccato dagli inibitori, ioduro non può entrare nelle cellule di acceptor per placare la fluorescenza. Il tasso d'estinzione YFPQL riflette l'attività GJ. La procedura di dosaggio-YFP GJIC è né complicato né in termini di tempo. È compatibile con HTS e può essere utilizzato per verificare gli effetti di un gran numero di composti su GJ attività in un periodo relativamente breve. Richiede solo acceptor e cellule del donatore e due soluzioni saline bilanciate. Il protocollo descritto di seguito è basato su cellule LN215 cui principali Cx è Cx4321. Il ricevitore di LN215-YFPQL e LN215-sono cellule erogarici− sono state generate da trasduzione con lentivirus esprimere YFPQL o SLC26A421,23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">96-well plate</td>
			<td style="width:72px;">SPL</td>
			<td style="width:123px;">30096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C5670</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">HEPES</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">RES6003H-B7</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:72px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">11668-027</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2393</td>
			<td>C-solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:72px;">BMG LabTech&#160;</td>
			<td style="width:123px;">POLARstar Omega 415-1618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Polybrene</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">&#160;#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5886</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium hyroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium Iodide (NaI)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">383112</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay

Giunzioni di Gap (GJs) sono i canali della membrana cellulare che permettono la diffusione delle molecole più piccolo di 1 kDa tra celle adiacenti. Come hanno ruoli fisiologici e patologici, c'è necessità di high throughput screening (HTS) saggi di identificare modulatori GJ in drug discovery e tossicologia saggi. Un saggio di comunicazione intercellulare di giunzione (I-YFP-GJIC) romanzo ioduro-giallo fluorescente proteina-gap soddisfa questa esigenza. È un'analisi basata su celle tra cui accettore e donatore di cellule che sono state progettate per esprimere stabilmente una variante della proteina fluorescente gialla (YFP), cui fluorescenza sensibile è spenta mediante ioduro o SLC26A4, un trasportatore di ioduro, rispettivamente. Quando lo ioduro viene aggiunto a una coltura mista di due tipi cellulari, entrano le cellule erogarici tramite il trasportatore SLC26A4 e diffusa alle celle adiacenti acceptor tramite GJs dove essi placare la fluorescenza YFP. YFP fluorescenza è misurata pozzetto da altro in modalità cinetica. Il tasso d'estinzione YFP riflette l'attività GJ. Il test è affidabile e abbastanza veloce da utilizzarsi per HTS Il protocollo per il dosaggio di-YFP-GJIC utilizzando le cellule LN215, cellule di glioma umano, è descritto.

Ventinove cultura 96 pozzetti piastre sono state utilizzate per lo screening di 2.320 prodotti chimici per identificare nuovi modulatori GJIC dall'analisi GJIC-YFP utilizzando il LN215-YFPQL e LN215-io− cellule. I risultati ottenuti con un piatto rappresentativo sono mostrati nella Figura 2. La percentuale di fluorescenza YFP in ciascun pozzetto viene visualizzata come un grafico a linee in Figura 2<strong...

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An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap

Qui, presentiamo un protocollo per un dosaggio di comunicazione intercellulare di romanzo gap junction progettato per lo screening ad alta resa di prodotti chimici di gap junction-modulanti per drug discovery e valutazione tossicologica.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Le giunzioni gap sono state suggerite come obiettivi farmacologici. Il test Iodide-YFP-GJIC è compatibile con lo screening ad alta produttività per scoprire modulatori di giunzione gap. È stato utilizzato per testare gli effetti di un gran numero di composti sulle attività di giunzione gap in un periodo relativamente breve.Il test Iodide-YFP-GJIC è semplice, robusto, ripetibile ed economico. Questo saggio richiede solo cellule accettori e donatrici e due soluzioni di sale bilanciate. Non sono necessari reagenti aggiuntivi come Lucifero giallo e Calcein AM.Inoltre misura le attività totali di giunzione gap delle cellule in un unico pozzo, il che si traduce in una bassa variabilità tra i pozzi. Per iniziare questa procedura far crescere le celle LN215 all'80% di confluenza in DMEM integrato come descritto nel protocollo di testo. Un giorno prima della trasduzione lavare le cellule due volte con 10 millilitri di PBS.Aggiungere due millilitri dello 0,25% di EDTA di tripside alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, le cellule vengono rimorsi in cinque millilitri di mezzo di coltura e si regola la densità cellulare a 50.000 cellule per millilitro. Aggiungere 400 microlitri di supporti che contengono 20.000 celle a ciascun pozzo di una piastra di coltura di 24 pozzi.Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo trasdurre due pozzi sostituendo il mezzo di coltura con 400 microlitri di una miscela uno-a-uno di un lentivirus e di un mezzo di coltura fresco integrato con polibrene ad una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro. Per i controlli no virus sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di coltura fresco integrato con polibrene ad una concentrazione finale di quattro microgrammi per millilitro.Incubare a 37 gradi Celsius per 15 ore. Quindi aspirare il mezzo contenente lentivirus e mezzo di coltura fresco. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altre 72 ore.Dopo questo, lavare le cellule in ogni pozzo due volte con 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere 300 microlitri dello 0,25% di EDTA di tripsidenza alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Rimostrare le cellule in due millilitri di mezzo di coltura, quindi placcarle in piastre di coltura a sei pozzi con due microgrammi per millilitro di puromicina.Coltura delle cellule fino a quando tutte le cellule nei pozzi di controllo sono morte, il che di solito richiede circa una settimana. In primo luogo, coltura separata cellule LN215-YFP e LN215-ioduro in piastre da 100 millimetri in mezzo di coltura per raggiungere le popolazioni necessarie per il saggio. Un giorno prima del test, lavare ogni piatto con 10 millilitri di PBS.Trattare ogni piastra con due millilitri di soluzione EDTA allo 0,25% di tripside e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Resostipendare le cellule in quattro millilitri di mezzo di coltura e trasferirle in un tubi conici da 15 millilitri. Centrifuga a 1.000 g per tre minuti per pellettare le cellule.Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo di coltura. Pipetta su e giù circa 20 volte per rompere eventuali grumi cellulari. Usa un emocitometro per contare le cellule.E poi diluire le cellule nel mezzo di coltura per fare la sospensione cellulare alle densità mostrate qui. Quindi, mescolare sette millilitri di ogni sospensione cellulare insieme in un serbatoio. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di questa miscela a ciascun pozzo di una piastra di coltura da 96 porri.Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 24 ore. In primo luogo, utilizzare un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 20X e un filtro GFP per controllare le piastre a 96 po 'per essere sicuri che non ci siano grumi di cellule e che le colture siano completamente confluenti e ben distribuite. Almeno 30 minuti prima del test accendere un lettore di micropiatte e impostarlo a 37 gradi Celsius.Lavare il tubo di un iniettore automatizzato con tre millilitri di etanolo al 70%, tre millilitri di acqua distillata e tre millilitri di soluzione I. Quindi, riscaldare le soluzioni C e I a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Aspirare il mezzo di crescita o invertire la piastra per svuotarla.Toccare qualsiasi mezzo residuo. Quindi aggiungere la soluzione C a un serbatoio utilizzando una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri di soluzione C a ciascun pozzo della piastra. Aspirare la soluzione o invertire la piastra per svuotarla, facendo toccare qualsiasi soluzione residua.Aggiungere 50 microlitri di soluzione C ad ogni pozzo. Quindi aggiungere un microlitri di uno stock chimico da 2,5 millimolare o DMSO come veicolo e aggiungere altri 50 microlitri di soluzione C a ciascun pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius nell'aria per circa 10 minuti.Durante l'incubazione, iniziare a impostare i parametri nel programma di lettura delle micropiatte facendo clic sul pulsante Gestisci protocolli. Fare clic sul pulsante Nuovo. Selezionate intensità fluorescenza nella sezione Metodo di misura e Modalità pozzo nella sezione Modalità di lettura.Fare quindi clic sul pulsante OK. Verrà visualizzata una nuova scheda. Nel menu Parametri di base impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 485 nanometri e l'emissione a 520 nanometri.Selezionare l'ottica inferiore per leggere la fluorescenza dal basso. Quindi impostare l'ora di inizio della misurazione su zero secondi, il numero di intervalli su 25, il numero di lampi per pozzo e intervallo su 20 e il tempo di intervallo su 0,4 secondi. Nel menu Layout disegnare un'area della piastra da leggere.Nel menu Concentrazioni/Volumi/Shacking impostare il lettore di micropiatte per iniettare 100 microlitri di soluzione I a ciascun pozzo con una velocità di iniezione di 135 microlitri al secondo. Nel menu Tempo di iniezione impostare l'ora di inizio dell'iniezione su un secondo. Quindi fare clic sul pulsante Avvia misurazione.Al termine dell'incubazione, trasferire le piastre da 96 pozzi al lettore di micropiatte e avviare nuovamente la misurazione facendo clic sul pulsante Avvia misurazione. In questo studio, il saggio di comunicazione intercellulare proteina fluorescente giallo-iodio viene utilizzato con le cellule LN215-YFP e LN215-iodio per migliorare le sostanze chimiche 2.320 per identificare nuovi modulatori di comunicazione intracellulare a giunzione gap. Si vede che l'omosalato inibisce il 50% della comunicazione intracellulare di giunzione gap.Mentre la terbinafina lo inibisce completamente. Questo conferma la terbinafina come inibitore della giunzione gap. Questo saggio misura il GJIC tra le cellule vicine del donatore e dell'accettore, quindi le cellule del donatore e dell'accettore devono essere completamente dissociate prima della placcatura.E la confluenza della coltura mista dovrebbe essere del 100% per massimizzare la formazione di giunzioni di gap tra le cellule. I dati del corso del tempo, le relazioni di risposta alla dose e la valutazione della reversibilità dei modulatori di giunzione gap possono essere ottenuti con il saggio Iodide-YFP-GJIC. Inoltre, i test GJIC specifici della connessione Iodide-YFP possono essere stabiliti inducendo l'espressione di una connexina di interesse nelle cellule prive di giunzioni funzionali gap.Ciò consente di determinare il valore IC50 di una sostanza chimica di un tipo specifico di connexina. Il test Iodide-YFP-GJIC può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività, perché è robusto, ripetibile ed economico. Questo test aiuta a trovare la giunzione gap che modula le sostanze chimiche per la scoperta di farmaci e la valutazione tossicologica.

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