Name: an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay at JoVE.com

Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 ve 2018R1A6A1A03023718).

1. nesil YFPQL ve SLC26A4 ifade lentiviruses
<ol><li>HEK293T insan embriyonik böbrek hücreleri % 80 100 mm Kültür tabaklarda confluency büyümek. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM) boyunca protokolünün HEK293T ve aşağıda belirtilen diğer hücreleri korumak için kullanılan kültür ortamıdır.</li>
	<li>Her şey 10 dakika süreyle 2 mL steril poli-L-lizin (PLL) çözüm %0,005 ekleyerek kat 6-şey k...

<ol>
	<li>Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins,+connexons,+and+Intercellular+Communication.">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li><li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity:+Structure-Function+Relationship.">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).</li><li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication.">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li><li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens.">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li><li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis.">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).</li><li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity.">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li><li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li><li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex.">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li><li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia/reperfusion+injury,+cardioprotection+and+neuroprotection.">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li><li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura.">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li><li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure.">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li><li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging:+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis.">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+2+,+6+,+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis.">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li><li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems.">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li><li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication.">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li><li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-Loading+and+Dye+Transfer:+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication.">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li><li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells.">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li><li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique.">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).</li><li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction.">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li><li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels.">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li><li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay.">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li><li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities.">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li><li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication.">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li><li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology.">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li><li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors.">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li><li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+/+c+3T3+fibroblasts.">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li><li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+Connexin+Channels.">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li><li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap.">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li></ol>

Sağlam, hızlı ve ucuz olduğu için ben-YFP-GJIC tahlil HTS için kullanılabilir. Bir HTS tahlil sağlam kabul edilir eğer Z'-0.525bir faktördür. Zhang ve ark. bkz: HTS deneyleri25uygunluğunun değerlendirilmesi için kullanılan istatistiksel analiz açıklaması için. LN215 hücreler kullanıldığında, Z'-faktör oldu > 0,5 olmadan herhangi bir tahlil en iyi duruma getirme. Diğer hücre tipleri tahlil ve onun Z kullanılan Eğer '-faktör < 0.5, sağlamlık ge...

Gap kavşak (GJs) hareket hücreler arası kanalları küçük moleküllerin difüzyon izin vermek için < 1 kDa besin, metabolitleri ve bitişik hücreler arasında sinyal molekülleri gibi. Bileske öğeleri hemichannel veya connexon her hücrede içerir ve her connexon altı connexins (Cxs)1teşkil eder. GJs ve Cxs gibi GJ inhibitörleri2,3,4olan aromatik polisiklik hidrokarbonlar (PAH), karsinojenler, toksikoloji deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Kesintiye GJIC nongenotoxic karsinojenezis5,6ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Potansiyel terapötik hedef olarak, belirli alt türlerinden nöbetler7,8, kalp ve beyin iskemi/reperfüzyon hasarı9, migren aura10ile koruma GJ tutulum bildirilmiştir, ilaca bağlı karaciğer hasarı6,11ve12şifa yara. Yüksek işlem hacmi (HTS) eleme deneyleri GJ oransal kimyasal madde veya ilaç bulma, toksikoloji deneyleri için için antikorlar tanıtmakta ve Roman hücresel düzenleyiciler GJ faaliyet tanımlamak için gereklidir. HTS deneyleri GJ modülatörler2,13,14,15yapısı-aktivite ilişkileri araştırmak için kullanabilirsiniz.
Bazı GJIC deneyleri boya transferi veya ikili yama kelepçe teknikleri içerir. Lucifer sarı CH (LY) ve calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) boya-devret deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Hücreler LY, mikroenjeksiyon, yükleme kazıma veya Elektroporasyon tarafından kullanılmaya geçirgen değildir. Bir kez hücre içindeki komşu hücreleri yoluyla GJs LY yayılır ve GJ etkinlik LY geçiş16ölçüde tarafından denetlesinler. Calcein-AM deneyleri genellikle photobleaching17,18sonra boşluk-floresan kurtarma içerir. Calcein-AM intracellularly geçirimsiz calcein tarafından içsel bir esteraz dönüştürülür bir hücre permeant boya var. Tahlil bu lazer photobleaching takip çevresindeki bir hücreye calcein-AM transferini gözlemlemek için confocal mikroskop gerektirir. Fonksiyonel GJs varsa, calcein-AM bitişik hücrelerde photobleached hücreleri girer ve floresan kurtarılır. GJ faaliyet photobleached hücrelerinin floresans kurtarma ölçüde tarafından denetlesinler. Boya-devret deneyleri zahmetli ve zaman alıcı veya düşük hassasiyetleri sahip. İkili yama sıkma bileske gürültülerinden ölçer elektrofizyolojik bir yöntemdir. Gürültülerinden doğrudan bir bağımlılık açık GJs19sayısı ile oldukça hassas; Ancak, bu teknik olarak talep, zaman alıcı ve pahalı20. Ben-YFP-GJIC tahlil HTS. kullanım için geliştirilmiştir
Şekil 1 gösterir bileşenleri ve alıcısı hücreleri H148Q ve I152L taşıyan bir iyodür duyarlı YFP değişken ifade kullanır-YFP GJIC tahlil adımlardan (YFPQL) ve donör hücreleri bir iyodür ışınlama (SLC26A4) ifade21 . YFPQL tarafından yapılan iki mutasyon floresans iyodür22tarafından Şoklama izin. İodides Co kültürlü alıcısı ve donör hücreleri eklenir; alıcısı hücreleri girmez ancak mevcut SLC26A4 taşıyıcıları tarafından donör hücreleri alınır. İodides donör hücreleri işleyen GJs nerede YFPQL floresans gidermek bitişik alıcısı hücrelere yaygın. GJs kapalı veya inhibitörleri tarafından bloke, iyodür floresans gidermek için alıcısı hücreleri giremezsiniz. YFPQL su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Ben-YFP GJIC tahlil ne karmaşık ne de zaman alıcı bir işlemdir. HTS ile uyumlu ve nispeten kısa bir süre içinde GJ etkinlik bileşikler çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılabilir. Sadece alıcısı ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözüm gerektirir. Aşağıda açıklanan protokol önemli olan Cx Cx4321yaşında LN215 hücreleri temel alan. LN215-YFPQL reseptörü ve LN215-ı− donör hücreleri YFPQL veya SLC26A421,23ifade lentiviruses ile iletim tarafından üretilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:629px;" width="630">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">96-well plate</td>
			<td style="width:72px;">SPL</td>
			<td style="width:123px;">30096</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C5670</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">HEPES</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">RES6003H-B7</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:72px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">11668-027</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M2393</td>
			<td>C-solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Microplate reader&#160;</td>
			<td style="width:72px;">BMG LabTech&#160;</td>
			<td style="width:123px;">POLARstar Omega 415-1618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Polybrene</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Poly-L-lysine solution</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5405</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">psPAX2&#160;</td>
			<td style="width:72px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">&#160;#12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td style="width:72px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S5886</td>
			<td>C-solution, I-solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium hyroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium Iodide (NaI)</td>
			<td style="width:72px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">383112</td>
			<td>I-solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication assay

Gap kavşak (GJs) bitişik hücreler arasında 1 kDa daha küçük moleküllerin difüzyon izin hücre zarı kanallar vardır. Fizyolojik ve patolojik rollere sahip olduğu ilaç bulma ve toksikoloji deneyleri GJ modülatörler tanımlamak için lüzum-in yüksek-den geçerek (HTS) eleme deneyleri. Bir roman iyodür-Sarı floresan protein-gap junction hücreler arası iletişim (ı-YFP-GJIC) tahlil bu ihtiyacı karşılamaktadır. Stabil olan floresans hassas iyodür veya SLC26A4, bir iyodür taşıyıcı tarafından sırasıyla söndürülür bir sarı floresan protein (YFP) değişken ifade etmek için tasarlanmıştır alıcısı ve donör hücreleri de dahil olmak üzere hücre tabanlı bir tahlil olduğunu. İyodür iki hücre tiplerinin karışık bir kültüre eklendiğinde, donör hücreleri ile SLC26A4 taşıyıcı girin ve nereye YFP floresan gidermek GJs ile bitişik alıcısı hücrelere diffüz. YFP floresan iyi iyi bir kinetik modunda ölçülür. YFP su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Güvenilir ve HTS. için kullanılacak hızlı tahlil LN215 hücreleri, insan gliyom hücreleri, kullanarak ben-YFP-GJIC tahlil için protokol açıklanmıştır.

29 96-şey kültür plakaları istimal belgili tanımlık LN215-YFPQL ve LN215-YFP GJIC tahlil tarafından roman GJIC modülatörler tanımlamak için 2,320 kimyasallar ekran için kullanılmıştır-ben− hücreleri. Temsil edici bir plaka ile elde edilen sonuçlar Şekil 2' de gösterilir. Her iyi YFP floresan yüzdesi Şekil 2A bir çizgi grafik olarak gösterilir ve her şey GJIC etkinl...

Watch this Scientific Journal Video about An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay at JoVE.com

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Gap kavşakları uyuşturucu hedefleri olarak öne sürülmüşlerdir. Iodide-YFP-GJIC tsöplisi, boşluk bağlantı modülatörlerini keşfetmek için yüksek iş leme taraması ile uyumludur. Nispeten kısa bir süre içinde boşluk kavşak faaliyetleri üzerinde bileşiklerin çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılmıştır.Iodide-YFP-GJIC analizi basit, sağlam, tekrarlanabilir ve ucuzdur. Bu töz sadece kabul ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözeltisi gerektirir. Lucifer sarısı ve Calcein gibi ek reaktifler gerekmez.Ayrıca tek bir kuyudaki hücrelerin toplam boşluk kavşak aktivitelerini ölçer ve bu da iyi-değişkenlik arasında düşük bir sonuç verir. Bu yordamı başlatmak için ln215 hücreleri büyümek 80% metak ile eklenmiş DMEM metin protokolünde belirtildiği gibi. Transdüksiyondan bir gün önce hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Hücrelere %0.25 tripsin EDTA'dan iki mililitre ekleyin ve 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak, beş mililitre lik kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya almak ta ve hücre yoğunluğunu mililitrede 50.000 hücreye ayarlar. 24 kuyulu bir kültür plakasının her kuyuya 20.000 hücre içeren 400 mikrolitre medya ekleyin.24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün mililitre başına dört mikrogram lık son konsantrasyonda polibren ile desteklenen bir lentivirüs ve taze kültür ortamının bire bir karışımının 400 mikrolitresi ile kültür ortamını değiştirerek iki kuyu yuvarlayın. Hiçbir virüs kontrolleri için mililitre başına dört mikrogram son konsantrasyonda polibren ile takviye taze kültür ortamı ile kültür ortamı değiştirin.15 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Sonra lentiviruses içeren orta aspire, ve taze kültür orta. Hücreleri 72 saat ek olarak 37 derecede kuluçkaya yatırın.Bundan sonra, 0,5 mililitre PBS ile her kuyudaki hücreleri iki kez yıkayın. Hücrelere %0,25 tripsin EDTA'dan 300 mikrolitre ekleyin ve 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. İki mililitre kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve mililitre püromisin başına iki mikrogram ile altı kuyulu kültür plakalarına koyun.Kültür kontrol kuyularında tüm hücreler ölü kadar hücreleri, genellikle yaklaşık bir hafta sürer. İlk olarak, ayrı ayrı kültür LN215-YFP ve LN215-iyodür hücreleri 100 milimetrelik plakalar kültür ortamda tsurel için gerekli popülasyonlara ulaşmak için. Bir gün önce, pbs 10 mililitre ile her plaka yıkayın.Her plakayı %0,25 tripsin EDTA çözeltisi ile iki mililitre ile tedavi edin ve 5 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Dört mililitre kültür ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri peletlemek için üç dakika için 1,000 g santrifüj.Supernatant atın ve kültür orta beş mililitre her hücre pelet resuspend. Pipet herhangi bir hücre kümeleri kırmak için yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.Ve sonra burada gösterilen yoğunluklarda hücre süspansiyon yapmak için kültür ortamı hücreleri seyreltmek. Daha sonra, her hücre süspansiyonunun yedi mililitresini bir rezervuarda karıştırın. 96 kuyulu bir kültür plakasının her kuyusu için bu karışımın 100 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.24 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. İlk olarak, 96 kuyulu plakaları kontrol etmek için 20X büyütmeli floresan mikroskobu ve GFP filtresi kullanın. Bir mikroplaka okuyucuaçmak ve 37 santigrat dereceye ayarlamak önce en az 30 dakika.Otomatik bir enjektörün tüpünü üç mililitre 70%etanol, üç mililitre distile su ve üç mililitre I-çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra, C ve I-çözeltilerini su banyosunda 37 dereceye ısıtın. Ya büyüme ortamını aspire edin ya da boşaltmak için plakayı ters çevirin.Artık ortama dokunun. Daha sonra plakanın her kuyusu için 200 mikrolitre C-çözeltisi eklemek için çok kanallı pipet kullanarak bir rezervuara C-çözeltisi ekleyin. Ya çözeltiaspire veya plakayı ters çevirerek boşaltmak için, artık çözeltiyi dışarı atamasını sağlar.Her kuyuya 50 mikrolitre C-çözeltisi ekleyin. Daha sonra bir araç olarak 2,5 milimolar kimyasal stok veya DMSO bir mikrolitre ekleyin ve her kuyuya 50 mikrolitre C-çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 derecede havada yaklaşık 10 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sırasında, Protokolleri Yönet düğmesini tıklatarak mikroplaka okuyucu programındaki parametreleri ayarlamaya başlayın. Yeni düğmesini tıklatın. Ölçüm Yöntemi bölümündeFloresan Yoğunluk ve Okuma Modu bölümünde Kimod'u seçin.Ardından, Tamam düğmesini tıklatın. Yeni bir sekme görüntülenir. Temel Parametreler menüsünde Uyarma dalga boyu 485 nanometre, Emisyon ise 520 nanometre olarak belirlenmiştir.Floresan'ı alttan okumak için Alt optik'i seçin. Daha sonra ölçüm başlangıç saatini sıfır saniye, aralık ların sayısı 25, kuyu başına yanıp sönme sayısını ve 20 olmak üzere aralık sayısını ve aralık süresini 0,4 saniye olarak ayarlayın. Düzen menüsünde okunacak plakanın bir bölgesini çizin.Konsantrasyonlar/Hacimler/Shacking menüsünde mikroplaka okuyucu, saniyede 135 mikrolitre enjeksiyon hızıyla her kuyuya 100 mikrolitre I-çözelti enjekte etmeye ayarlayın. Enjeksiyon Süresi menüsünde enjeksiyon başlangıç saatini bir saniye olarak ayarlayın. Ardından Ölçüm Başlat düğmesini tıklatın.Kuluçka tamamlandığında, 96 kuyulu plakaları mikroplaka okuyucuya aktarın ve yeniden Başlat ölçüm düğmesini tıklatarak ölçüme başlayın. Bu çalışmada, iyot-sarı floresan protein-gap kavşak-hücrelerarası iletişim testi LN215-YFP ve LN215-iyot hücreleri ile ekran 2, 320 kimyasallar yeni boşluk kavşak hücre içi iletişim modülatörleri tanımlamak için kullanılır. Homosalate'in hücre içi gap kavşağının %50'sini inhibe edilebistir.Terbinafine tamamen inhibe ederken. Bu bir boşluk kavşak inhibitörü olarak terbinafine doğrular. Bu titreci, komşu donör ve kabul eden hücreler arasındaki GJIC'yi ölçer, bu nedenle donör ve kabul eden hücreler kaplamadan önce tamamen ayrıştırılmalıdır.Ve karışık kültürün birleşimi hücreler arasındaki boşluk kavşaklarının oluşumunu en üst düzeye çıkarmak için %100 olmalıdır. Zaman ders verileri, doz yanıt ilişkileri ve gap kavşak modülatörlerinin geri döndürülebilirliğini değerlendirmek Iodide-YFP-GJIC tsömu ile elde edilebilir. Ayrıca, Iodide-YFP spesifik connexin GJIC tahlilleri fonksiyonel boşluk kavşaklarından yoksun hücrelere ilgi connexin ifadesini indükleyerek kurulabilir.Bu connexin belirli bir tür bir kimyasal IC50 değerini belirlemek mümkün kılar. Iodide-YFP-GJIC tsöplisi yüksek iş elde tarama için kullanılabilir, çünkü sağlam, tekrarlanabilir ve ucuzdur. Bu tahliller ilaç keşfi ve toksikolojik değerlendirme için kimyasallar modüle boşluk kavşak bulmak için yardımcı olur.

Research

JoVE Journal

Biology

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Immunoperoksidaz Testi İnsan coronavirüsleri Titrasyon

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Biyoloji

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Oküler Mikrovasküler Anjiyogenezin Ex Vivo Koroid Filizlenme Satomu

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...