Name: site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Syddansk Universitet åben adgang politik tilskud.

1. vektor udvalg
<ol><li>Vælg en vektor til at udføre downstream eksperimenter med. Enhver vektor er gældende for denne 2 - og 3-trins PCR metode.</li>
	<li>Baseret på valg af vektor, vælge passende restriktionsenzymer for kloning.</li>
</ol>2. primer design for websted instrueret mutagenese
<ol><li>Vælge mellem enten 2-trins eller 3-trins PCR strategi (2-trin er kun for mutationer < 200 bp fra begge ender af DNA af interesse). For 2-trins PCR, gå til trin 2.2 og 3-trins PCR gå til tri...

<ol>
	<li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+binding+to+5'+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation.">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli.">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter.">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li><li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli:+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA.">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li><li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli.">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot.">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+(EMSA).">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li><li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids.">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cassette+mutagenesis:+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites.">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li></ol>

Site-directed mutagenese har en bred vifte af forskellige applikationer, og her, repræsentative resultater fra en in vivo og in vitro-eksperiment blev medtaget som eksempler på hvordan man laver biologiske konklusioner ved hjælp af teknikken. Site-directed mutagenese har længe været den gyldne standard for RNA interaktion undersøgelser. Styrken af teknikken, der ligger i kombinationen af at indføre relevante mutationer med downstream assays og eksperimenter (f.eks., vestlige skamplet eller EMSA) at drage konklusio...

DNA er ofte omtales som blueprint af en levende celle, da alle strukturer i cellen er kodet i rækkefølgen af sit DNA. Nøjagtig replikering og DNA reparation mekanismer sikre, at kun meget lave takster for mutationer opstår, som er afgørende for at opretholde korrekte funktioner af kodede gener. Ændringer i DNA-sekvens kan påvirke hinanden følgende funktioner på forskellige niveauer, startende med DNA (anerkendelse af transkriptionsfaktorer og restriktionsenzymer), derefter RNA (base-pair komplementaritet og sekundær struktur ændringer) og/eller protein (aminosyrer syre erstatninger, udeladelser, tilføjelser eller ramme-Skift). Mens mange mutationer ikke påvirker genfunktion betydeligt, kan nogle mutationer i DNA har enorme konsekvenser. Således, site-directed mutagenese er et værdifuldt redskab til at studere betydningen af specifikke DNA websteder på alle niveauer.
Denne protokol beskriver en målrettet mutagenese fremgangsmåde bruges til at indføre specifikke mutationer. Protokollen er baseret på to forskellige PCR strategier: en 2-trins eller en 3-trins PCR. 2-trins PCR er gældende, hvis den ønskede mutation er tæt på enten 5'-enden eller 3'-enden af DNA af interesse (< 200 basepar (bp) fra slutningen) og 3-trins PCR kan anvendes i alle tilfælde.
I 2-trins PCR tilgang, 3 primere er designet, hvor ét sæt primere er designet til at forstærke DNA af interesse (primere 1 og 3, frem og bak, henholdsvis), og en enkelt primer er udviklet til at inkorporere mutationen. Mutationen at indføre primer (primer 2) bør have en omvendt orientering, hvis mutationen er tæt på 5'-enden og et fremadrettet retning hvis mutationen er tæt på 3'-enden. I det første skridt i PCR forstærker primer 1 + 2 eller 2 + 3 et lille fragment tæt på 5' enden eller 3' enden, henholdsvis. Den resulterende PCR produkt bruges derefter som en primer i trin to med primer 1 eller 3, hvilket resulterer i en PCR produkt med en mutation i DNA af interesse (figur 1A).
I 3-trins PCR, 4 primere er designet, hvor ét sæt primere er designet til at forstærke DNA af interesse (primere 1 og 4, frem og bak, henholdsvis) og ét sæt primere er udviklet til at inkorporere bestemte mutationer med overlappende komplementaritet (primere 2 og 3, vende og fremad, henholdsvis). I trin et og to, primere 1 + 2 og 3 + 4 forstærke 5' og 3' enden. I trin tre, de deraf følgende PCR produkter fra trin et og to er brugt som skabeloner og forstærket med primere 1 + 4. Den resulterende PCR produkt er således DNA af interesse med den ønskede mutation (figur 1B).
Mens muteret DNA kan bruges til enhver downstream, beskriver denne protokol, hvordan du re kombinere DNA i en kloning vektor. Anvendelse af kloning vektorer har flere fordele som brugervenlighed kloning og særlige eksperimentelle programmer afhængigt af funktioner af vektoren. Denne funktion anvendes ofte til RNA interaktion undersøgelser. En anden teknik til RNA interaktion undersøgelser er strukturelle sondering af RNA i kompleks med en anden RNA1,2 eller protein3,4. Imidlertid udføres strukturelle sondering kun in vitro-mens site-directed mutagenese og efterfølgende kloning mulighed for interaktion undersøgelser in vivo.
Site-directed mutagenese har været flittigt brugt til RNA interaktion undersøgelser, som præsenteres her. Imidlertid den vigtigste metode med hensyn til 2 - eller 3-trins PCR gælder for ethvert stykke DNA, og derfor ikke kun begrænset til RNA-interaktion undersøgelser.
For at illustrere teknikken og dens anvendelsesmuligheder, bruges karakterisering af regioner vigtigt for post-transcriptional regulering af mRNA, csgD, af Escherichia coli (E. coli). I E. coli, csgD er målrettet af de små ikke-kodende RNA, McaS, i samarbejde med et protein, regulering, at undertrykke protein-udtryk for CsgD2,4,5. Teknikken bruges til at indføre mutationer i base-parring regionen mellem csgD og McaS og at bindingssted regulering af csgD. Fremstillet DNA er derefter klones til en vektor egnet til efterfølgende forsøg. Downstream anvendelser af teknikken omfatter både in vivo og in vitro-eksperimenter. For illustration, eksempel 1 er karakteriseret in vivo, ved hjælp af en western blot analysen og eksempel 2 er kendetegnet i vitro ved hjælp af en elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA). I begge tilfælde er det illustreret hvor site-directed mutagenese kan bruges i kombination med andre teknikker til at gøre biologisk konklusioner om et gen af interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G6532</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure c200</td>
			<td>Azure</td>
			<td>NA</td>
			<td>Gel imaging workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom DNA oligo</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VC00021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>NA</td>
			<td>Spectrophotometer for nucleic acid measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Gel Extraction Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>SM0333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td>
			<td>Gerard Biotech</td>
			<td>TO12</td>
			<td>Dialysis tubes for electro elution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704406</td>
			<td>Horizontal electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3165</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0447</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin miRNA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740971</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>Bis-Tris gels for protein separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0531S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Immunoglobulins</td>
			<td>Dako Cytomation</td>
			<td>P0448</td>
			<td>HRP conjucated secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot</td>
			<td>Systat Software Inc</td>
			<td>NA</td>
			<td>Graph and data analysis software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td>Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

site-directed mutagenesis for in vitro and in vivo experiments exemplified with rna interactions in escherichia coli

Site-directed mutagenese er en teknik, der anvendes til at indføre specifikke mutationer i DNA til at undersøge samspillet mellem små ikke-kodende ribonukleinsyre (sRNA) molekyler og target messenger RNA'er (mRNAs). Desuden, bruges site-directed mutagenese til at knytte specifikke protein bindingssteder til RNA. En 2-trins og 3-trins PCR baseret indførelsen af mutationer er beskrevet. Metoden er relevant for alle protein-RNA og RNA-RNA interaktion undersøgelser. Kort sagt, afhængig teknikken design primere med den ønskede mutation(s), og gennem 2 eller 3 trin af PCR syntetisere en PCR produkt med mutationen. PCR-produktet bruges derefter til kloning. Vi beskriver her, hvordan du udfører site-directed mutagenese med både 2 - og 3-trins tilgang til at indføre mutationer af sRNA, McaS og mRNA, csgD, at undersøge RNA-RNA og RNA-protein interaktioner. Vi anvender denne teknik for at undersøge RNA interaktion; teknikken er dog gældende for alle mutagenese undersøgelser (fx DNA-protein interaktioner, aminosyre substitution/sletning/tilføjelse). Det er muligt at indføre nogen form for mutation bortset fra ikke-naturlige baser, men teknikken er kun gældende, hvis en PCR produkt kan bruges til efterfølgende anvendelse (fx, kloning og skabelon for yderligere PCR).

At undersøge RNA interaktioner med hensyn til post-transcriptional regulering af csgD, en dobbelt vektor setup blev valgt: en til at udtrykke csgD mRNA og en anden til at udtrykke de små ikke-kodende RNA, McaS. csgD er klonet i pBAD33, som er en arabinose inducerbar medium-kopi plasmid med chloramphenicol modstand og McaS blev klonet i mini R1 pNDM220, som er en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducerbar lav kopi plasmid med ampicillin-resistense...

Watch this Scientific Journal Video about Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli at JoVE.com

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenese er en teknik, der anvendes til at indføre specifikke mutationer i deoxyribonukleinsyre (DNA). Denne protokol beskriver, hvordan at gøre site-directed mutagenese med en 2-trins og 3-trins Polymerasekædereaktionen (PCR) baseret tilgang, der finder anvendelse på enhver DNA fragmenter af interesse.

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site-rettet mutagenese er nyttigt at studere molekylære interaktioner, såsom RNA-RNA, og RNA protein interaktioner. Denne protokol beskriver, hvordan du udfører problemtagenese styret af webstedet med en to- eller 3-trins PCR-tilgang. De vigtigste fordele ved metoden er mangfoldigheden af forskellige mutationer, der kan indarbejdes, samt en relativ lethed og omkostninger for at gøre det.Til at begynde, skal du bruge wild-type DNA-skabelon og primer par to, en og to, tre, specifikke for 2-trins, eller primer par tre, en og tre, fire, specifikke for 3-trins PCR for at opnå PCR produkt en. For at validere PCR-produkter ved agarosegelelektroforese skal du lave en 2% agarosegel ved at opløse to gram agarose i 100 milliliter 1X TAE-buffer ved hjælp af en mikrobølgeovn. Der tilsættes ethidiumbromid ved en endelig koncentration på 0,5 mikrogram pr. milliliter.Derefter kastes agarose gel. Når størknet, placere den i en elektroforese enhed. Læg en DNA-stige af kendt størrelse, og PCR-prøverne blandes med DNA-indlæsningsfarve i brønde.Kør prøver ved 75 volt i 45 minutter. Og visualisere bands på en UV transilluminator eller med en gel billeddannelse system. Dernæst rense PCR produkt med en gel ekstraktion kit i henhold til producenterne protokol og måle koncentrationen af det rensede DNA med et spektrofotometer.Opbevar derefter det rensede DNA på minus 20 celsius i TE-buffer. For at begynde site-instrueret mutagenesis med en 2-trins PCR, først bruge wild-type DNA skabelon, derefter primer par to, en og to, to, for fem primer mutationer, eller primer par to, to og to, tre for tre priment mutationer at opnå PCR produkt to. Valider PCR-produktet ved hjælp af gelelektrofoering, rengør PCR-produktet, og mål dets koncentration som beskrevet før.Brug derefter wild-type DNA-skabelonen og PCR-produktet to som primer, sammen med primer to, tre for fem priment mutation, eller primer to, en for tre priment mutation, for at opnå PCR produkt tre. Valider PCR-produktet ved hjælp af gelelektrofoering, rengør PCR-produktet, og mål dets koncentration som beskrevet før. Opbevar derefter det rensede DNA på minus 20 grader celsius i TE-buffer.For at begynde site-direkte mutagenese med en 3-trins PCR, skal du først bruge wild-type DNA-skabelonen og primerpar tre, en og tre, to for at få PCR-produkt to. Brug wild-type DNA skabelon og primer par tre, tre og tre, fire, for at opnå PCR produkt tre. Brug wild-type DNA skabelon og primer par tre, tre og tre, fire, for at opnå PCR produkt tre.Valider PCR-produktet ved hjælp af gelelektrofoering, rengør PCR-produktet, og mål dets koncentration som beskrevet før. Endelig bruge to til fem nanogram PCR produkter to og tre som skabelon sammen med primer par tre, en og tre, fire, for at opnå PCR produkt fire. Valider PCR-produktet ved hjælp af gelelektrofoering, rengør PCR-produktet, og mål dets koncentration som beskrevet før.Opbevar det rensede DNA ved minus 20 grader celsius i TE-buffer. I denne undersøgelse blev 2-trins og 3-trins site-rettet mutagenese brugt til at undersøge RNA interaktioner vedrørende post transskriptionel regulering af CsgD. Den vilde type CsgD blev PCR forstærket til at give PCR produkt IA, og wild-type mcaS blev PCR forstærket til at give PCR produkt IB. Ved hjælp af en 3-trins PCR-strategi blev PCR-produkter IIA og IIIA syntetiseret i de første to trin, og IVA i tredje trin for at indføre mutationer i CsgD.Tilsvarende, gratis site-rettet mutationer blev indført i mcaS at give PCR produkter IIB, IIIB, i de første to trin, og IVB i tredje trin. Western blot analyse viste, at mens udtryk for vilde-type mcaS forhindrer oversættelse af vilde-type CsgD, mutationer i enten mcaS eller CsgD lindrer den observerede undertrykkelse. Men mutationer i både CsgD og mcaS forhindrer oversættelse af CsgD.Ved hjælp af en 2-trins PCR-strategi blev PCR-produkter IIC, IID, IIE, IIF og IIG syntetiseret i første trin, og PCR-produkter IIIC, IIID, IIIE, IIIF og IIIG, i andet trin for at introducere mutationer til hele CsgD DNA. EMSA-resultaterne af HFQ-bindingen til in vitro transskriberede CsgD wild-type og mutant RNA'er, syntetiseret ved hjælp af PCR-produkter IIIC, IIID, IIIE, IIIF og IIIG, viste de øgede KD-værdier af mutantallerne. Dette beviste, at HFQ kunne binde sig mindre effektivt til mutanterne.Desuden har HFQ flere bindingssteder på CsgD, hvilket fremgår af de tre skift, der observeres for det vilde RNA. Der observeres dog kun to bindingssteder for forskellige mutant RNA'er. Således identificerer den stedsbestemte mutationsmetode primære og eller sekundære strukturer i CsgD mRNA, som er vigtige for fuldstændig binding af HFQ.Metoden til site-rettet mutagenese beskrevet her er afhængig af PCR. God PCR praksis er derfor afgørende for metoden og kan kræve optimering at blive en succes. Site-rettet mutagenesis er kun kraftfuld med alle tre metoder såsom EMSA og vestlige Blotting.Andre metoder, for eksempel, omfatter forskellige strukturelle analyser og nogle aktivitet assays, og post oversættelse ændring undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning af pH-afhængige aktivitet af<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; og<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Ekstremt hurtig og specifik metabolisk mærkning af RNA in vivo med 4-thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Hurtig og omkostningseffektiv RNA udvinding af rotte pancreas væv

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specifik lysin acetylering af Histoner for nukleosom rekonstitution ved hjælp af genetisk kode ekspansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...